Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Zusammenfassung

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Zusammenfassung

Krankheiten, die die Integrität des Rückenmarks Motoneuronen gehören zu den schwächenden neurologischen Erkrankungen. In den letzten Jahrzehnten hat sich die Entwicklung der verschiedenen Tiermodellen dieser neuromuskulären Erkrankungen die wissenschaftliche Gemeinschaft mit anderen therapeutischen Szenarien bei Verzögerung oder Umkehren des Fortschreitens dieser Bedingungen ausgerichtet ist. Durch Ausnutzung des Rück Maschinen von Neuronen, wobei einer dieser Ansätze hat, um die Skelettmuskulatur um Shuttle therapeutische Gene in entsprechende Rückenmarksmotoneuronen zu zielen. Obwohl einmal vielversprechend, wurde der Erfolg einer solchen Gentransfer Ansatz der suboptimalen Anzahl der transduzierten Motoneuronen es bisher gezeigt, ergeben behindert. Motor Endplatten (MEP) sind hochspezialisierte Bereiche auf der Skelettmuskulatur, die in direktem Kontakt mit dem synaptischen Rückenmarks α Motoneuronen sind. In dieser Hinsicht ist es wichtig zu beachten, dass, so weit die Bemühungen, retrogradTransfer von Genen in Motoneuronen wurden ohne Bezug auf die Lage der Region MEP in die gezielten Muskeln. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll 1), um die genaue Lage der Abgeordneten auf der Oberfläche der Skelettmuskulatur zu offenbaren und 2), diese Informationen zu verwenden, um die intramuskuläre Lieferung und anschließende optimale retrograden Transport von retrograde Tracer in Motoneuronen zu führen. Wir hoffen, dass die Ergebnisse aus diesen Experimenten Tracing in weiteren Studien zu untersuchen retrograden Transport von therapeutischen Genen, um Rückenmark Motoneuronen durch die Ausrichtung der Europaabgeordneten zu nutzen.

Einleitung

Der Verlust der Kontrolle über willkürliche Bewegung, die von neurologischen Erkrankungen wie Motoneuronerkrankung führt und Spinal- als auch Duchenne Muskelatrophie ist eine schwächende Krankheit, die hohe und lang anhaltende Auswirkungen auf den Alltag der Betroffenen hat. Während des letzten Jahrzehnts, Forschungsanstrengungen zu stoppen oder zumindest zu verzögern die schädlichen Auswirkungen dieser neuromuskulären Erkrankungen ist eine Priorität für viele Ärzte und Wissenschaftler auf der ganzen Welt. In dieser Hinsicht ist die neueste Generation von Tiermodellen, die diese neuromuskulärer Krankheiten nachahmen war maßgeblich bei der Erlangung grundlegende Einsichten in die physiologischen Mechanismen, die der Entwicklung und Progression von diesen Bedingungen ^1-13 Basiswert. Behandlung dieser neuromuskuläre Erkrankung ist ein direkter Zugriff auf das Rückenmark und durch Rückenmarks Injektionen ^14,15 erreicht werden. Jüngste Fortschritte in der Gentherapie wurden ins Visier der quergestreiften Muskulatur des oberen undunteren Gliedmaßen Shuttle therapeutische Gene in die entsprechenden α-Motoneuronen, die innerhalb des Vorderhorns des Rückenmarks ^1,9-13 befinden. Allerdings hat diese einst vielversprechende Strategie versäumt, den Ausgang dieser neurologischen Erkrankungen zu verbessern. Während es ist fair zu schließen, dass diese schlechte Ergebnisse könnte, zumindest teilweise auf die geringe Wirksamkeit dieser Schutz Gene sein, kann man die geringe Wirksamkeit dieser Gentransferverfahren nicht aus.

Motor Endplatten (MEPs) sind spezialisierte Regionen der Skelett Muskelfasern, die von den Axonterminalen großer peripheren motorischen Fasern aus α-Motoneuronen Ursprung eingerückt sind. Zusammen bilden die peripheren Nervenfaserenden und die Abgeordneten bilden die neuromuskulären Synapse, dh der Ort, an dem synaptischen Impulse werden von der anterograde Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin ausgelöst. Wichtig ist, daß die Beziehung zwischen peripheren Nervenfasern und der MEPs bi-direclen, obwohl verschiedene Motoren sind für den Transport von Molekülen und Organellen in Richtung als auch weg von dem Neuron verantwortlich somata ^16-18. Angesichts dieser anatomischen Erwägungen erscheinen die Abgeordneten, um die Ziele der Wahl für die Lieferung und anschließender retrograden Transport von genetischem Material in die entsprechenden motorischen Neuronen sein. In diesem Zusammenhang ist es nicht überraschend, dass der Erfolg der Motoneuronen Transduktion hängt stark von dem Abstand zwischen der intramuskulären Injektion von viralen Vektoren und MEPs ^19-20 des Muskels. Überraschenderweise ist jedoch die genaue Lage der MEP Zonen an den Muskelfasern des Labor Ratte und Maus, die beiden Arten der Wahl, um neuromuskuläre Erkrankungen modellieren, die bis vor kurzem nicht möglich.

Wir haben umfassende Karten der Region MEP für mehrere Vorderbein Muskeln bei der Ratte und der Maus ^21-22 produziert. Vor kurzem haben wir die Einzelheiten der Organisation des MEP r gezeigtegion für mehrere Muskeln der Maus Hinterlauf ²³ und wir sind derzeit die Analyse der Merkmale der Abgeordneten an der Ratte Hinterlauf. In unseren Händen hielt intramuskuläre Injektionen von retrograder Tracer auf die gesamten MEP Zonen in diesen Muskeln gerichtet zu mehr markierte Motoneuronen, die mehr Rückenmarksegmente spannt sind als bisher angenommen. Hier stellen wir das Protokoll, das in den letzten Jahren entwickelt worden ist, um den Standort der MEPs auf der äußeren Oberfläche als auch über die Tiefe der Hintergliedmaßen und Vorderbein Muskeln zeigen sowohl in der Maus und der Ratte.

Protokoll

Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren mit der Tierpflege und Ethikkommission der UNSW Australien eingehalten und wurden in Übereinstimmung mit dem National Health und Medical Research Council of Australia Vorschriften für Tierversuche durchgeführt. Alle Verfahren in diesem Protokoll sollte in Übereinstimmung mit den Anforderungen der einschlägigen Tierpflege und Ethik-Kommission durchgeführt werden.

1. Acetylcholinesterase histochemische Färbung

1. Bereiten Sie die Acetylcholinesterase Reaktionsgemisch
   1. Add 290 mg Acetylthiocholiniodid zu 200 ml 0,1 M Phosphatpuffer (PB). Mischen mit einem Magnetrührer bei 900 Umdrehungen pro Minute.
   2. In 600 mg Glycin unter ständigem Rühren.
   3. Werden langsam 420 mg Kupfersulfat zu der Reaktionsmischung unter kontinuierlichem Rühren, bis das Produkt vollständig gelöst ist.
2. Entfernen Sie die Haut an der Tierkörper durch Einschnitte (durch Gewebe-Sharing erhalten)in die Haut eines perfundierten Ratte oder Maus, Greifen der Haut von der Hals-Bereich und ziehen zu ihren Füßen. Sicherzustellen, dass die Faszie bedeckt jeden Muskel wird entweder entfernt oder erheblich perforiert, um eine ausreichende Belichtung der Muskelfasern zu der Reaktionslösung zu gewährleisten.
3. Tauchen Sie den ganzen Körper oder Gliedmaßen von Interesse in der Reaktionsmischung und Inkubieren O / N bei 4 ° C.
4. Für 2 min in destilliertem Wasser waschen den Kadaver. Hinweis: In dieser Phase werden die Muskeln zeigen eine Blaufärbung und die motorischen Endplatten (MdEP) als weiße Punkte zu sehen.
5. Expose der Karkasse zu einer 10% Ammoniumsulfid-Lösung für 3-5 sec.
   Hinweis: Die Muskelfasern schnell braun werden und die Abgeordneten werden beobachtbare als schwarze Punkte gesprenkelt sein. Wenn die Reaktion tritt zu schnell, und die Muskelfasern zu dunkel, um zwischen den Abgeordneten und den Muskelfasern unterscheiden befleckt versuchen mit niedrigeren Konzentrationen von Ammoniumsulfid-Lösung (zB 5%) werden. Die Reaktionszeit, um das zu bekommenoptimalen Kontrast zwischen den Abgeordneten und den Muskelfasern variiert von einer Probe zur anderen. Daher ist es schwierig, die genaue Belichtungszeit an das Reagenz zu definieren. Die Reaktion sollte sorgfältig überwacht werden und angehalten, wenn der Kontrast als angemessen.
6. Zweimal Waschen der Karkasse unter Rühren in destilliertem Wasser und sanft pat den Kadaver trocken.
7. Fotografie sowohl die lateralen und medialen Aspekte der Extremität, sicherzustellen, dass die Mitglieder des Europäischen Parlaments für alle Muskeln von Interesse erfasst.

2. intramuskuläre Injektionen an den motorischen Endplatten

1. Ziehen Glasmikropipetten mit einer Mikropipette Abzieher (die Verwendung von Mikropipetten mit abgestuften Kolben wird empfohlen). Mit Hilfe eines Binokular, brechen die Spitzen der Mikropipetten mit einer Pinzette, so daß der Innendurchmesser des Lumens des Mikropipette ist etwa 0,5 mm.
2. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumenten verwendet werden frisch autoklaviert und thim OP-Bereich ist steril.
3. Füllen Sie die Mikropipetten mit Fluoro-Gold-(5% in destilliertem Wasser).
4. Induzieren anaesthetise im Tier in einer Induktionskammer, die mit Isofluoran (4% in O _2). Überprüfen Sie für Aufrichtungsreflexes und Gewährleistung ihrer Abwesenheit, bevor es von der Induktionskammer zu entfernen. Sichern Sie sich einen Nasenkegel über der Schnauze der Ratte und liefern Isofluoran (2% in O ₂₎ zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Klemmen Sie das Tier Zehen und sanft berühren Auge des Tieres, um sicherzustellen, dass sowohl die Pedal Rückzug und die Hornhautreflexe sind nicht vorhanden. Anmerkung: Eine Mischung aus Ketamin und xylazil können ebenfalls verwendet werden (80 und 10 mg / kg, intraperitoneal geliefert). Ketamin ist ein Schedule 8 ("Controlled") Arzneimittel und notwendigen Protokolle mit dem Kauf, Verwendung, Lagerung und Entsorgung der Droge verbunden müssen eingehalten werden.
5. Gelten Auge Schmiermittel Trocknung der Augen bei dem während des Verfahrens zu verhindern.
6. Rasieren Sie die targeted Gliedmaßen und die Verwendung Gaze, um die rasierte Fläche mit drei Wechsel scheuert von Chlorhexidin und 70% Alkoholtupfer. Übertragen Sie das Tier auf den OP-Bereich.
7. Legen Sie das Tier auf eine saubere Unterlage und positionieren Sie sie angemessen auf eine gute Anbindung an die gezielte Muskel (n) zu gewährleisten.
8. Verwenden Sie eine Pinzette mit Zahngriffe, um die Haut über den gezielten Muskel weg von der zugrunde liegenden Muskulatur anzuheben und einen Einschnitt in der Haut mit chirurgische Scheren. Sicherzustellen, dass der Einschnitt ist groß genug, um den Muskel (n) von Interesse vollständig freizulegen. Stellen Sie sicher, dass es eine minimale Unterbrechung der Faszie.
9. Verwenden Sie die MEP Fotografien geistig transponieren die Position und Form des Bereichs MEP auf den Muskel (n).
   Hinweis: Eine feine Filzschreiber könnte helfen, die MEP-Region aus der Fotografie auf den Muskel (n) von Interesse zu reproduzieren.
10. Vielfache Injektionen entlang der vollen Länge des Bereichs MEP (für Fluor-Gold, 3 bis 4 Injektionen von 1-2 & mgr; l jedes should ausreichen). Wischen Sie den Muskel (n), um Eindringen zu entfernen.
11. Bringen Sie die beiden Enden des eingeschnittenen Haut eng mit stumpfen Pinzette und schließen Sie die Wunde mit Operationsklammern. Infiltrieren 0,1 ml Bupivacain (0,5% in Wasser) (oder andere Lokalanästhetika) entlang der gesamten Spanne der Wunde.
12. Drehen Sie den Narkosegerät aus und überwachen die Tier bis es vollständig aus der Narkose erholt.
13. Warten für 14 Tage zwischen der Verabreichung intramuskuläre Injektionen und die Perfusion der Tiere.

3. Perfusionen

1. Verabreichung einer letalen Dosis von Pentobarbitonnatrium Lösung (zB Lethabarb; 150 mg / kg) dem Tier durch intraperitoneale Injektion.
   1. Das Tier genau zu überwachen, bis eine tiefe Ebene der Narkose erreicht ist, wie durch die Abwesenheit des Pedals Rückzug und den Corneareflexe bestätigt.
2. Positionieren Sie das Tier auf dem Rücken auf einem Brett über einem Seziertisch gelegt perfusion Waschbecken.
3. Verwenden Sie eine Pinzette mit Zahngriffe, um die Haut für die Basis des Brustbeins zu heben. Machen Sie einen kleinen Hautschnitt mit einem Paar starken chirurgische Schere unmittelbar unter dem Brustbein und verwenden Sie dann die Zange zu greifen den Schwertfortsatz Knorpel des Brustbeins. Beim Halten des xiphoid Knorpel vergrössern Einschnitt auf beiden Seiten der Brusthöhle, vom Brustbein zu den Achseln.
4. Schneiden Sie die Blende, um das Herz freizulegen.
   1. Injizieren 0.ml Heparin direkt in die Spitze des Herzens, um die Koagulation des Blutes zu verhindern.
   2. Schneiden die Spitze, um das Einführen einer Kanüle in die linke Herzkammer zu ermöglichen, und dann schnell zu klemmen die Kanüle an Ort und Stelle mit Hilfe eines Hämostatikums.
   3. Einen Einschnitt in den rechten Vorhof mit einem Paar von einer feinen Schere und sofort beginnen die peristaltische Pumpe. Perfusion mit 0,1 M PB, bis die aus dem Atrium strömenden Flüssigkeit ist nahezu frei von Blut und die Farbe der Leber wird hellbraun. Dann Perfusion mit Lösungention von Paraformaldehyd (4% in 0,1 M PB), bis der gesamte Körper des Tieres wird starr.

4. Halsmark Dissection und Vorbereitung für die Histologie

1. Legen Sie das Tierkörper auf seiner Unterleib.
2. Schneiden Sie die Haut auf die Körpermittellinie mit einem Skalpell und beziehen sie aus der Basis des Schädels, um das Niveau des Darmbein.
3. Messer durch und spiegeln die paravertebralen Muskeln, um die dorsalen Aspekt der Wirbelsäule freizulegen.
4. Identifizieren Sie die knöchernen Dornfortsatz des Atlas, der zweiten Halssegment (dh, C2), und entfernen Sie sie mit einem Paar von chirurgischen Knochenzangen oder Pinzetten, um den entsprechenden Basiswert Algan finden.
   1. Identifizieren Sie den rechten C2 root durch Färben mit einem permanenten Filzstift.
   2. Nehmen Sie die nächste Wirbel einer nach dem anderen und markieren Sie die rechten dorsalen Wurzeln mit wechselnder Farbe (also C2, C4, C6 und C8 können in grün und C3 eingefärbt werden, C5, C7, T1 kann col seinODER-Verknüpfung in blau).
5. Mit einem kleinen chirurgischen Nadel (beispielsweise 30 G Nadel) vorsichtig durchstechen die Dura, die die untere Ende des Rückenmarks. Mit der Abschrägung der Nadel nach oben, heben Sie die Dura von der Schnur während der Bewegung der Nadel rostral um einen Längsschlitz zu machen.
   1. Spiegeln die Dura.
6. Schneiden Sie das Rückenmark quer in Ein- oder Zweisegmentblöcken mit einem neuen Skalpellklinge.
   1. Lassen Sie die Rückenmarksegmente in situ und für jeden Block, sorgfältig einen kleinen Bezugsmarke auf der linken Seite jedes Blocks mit der Skalpellklinge in der Mitte zwischen zwei benachbarten Wurzeln. Sicherzustellen, dass die Bezugsmarkierung ist tief genug, durch das Gewebe, um von der ventralen Seite der Blöcke sichtbar. Machen Sie den Bezugsmarke in einem Winkel von etwa 45 ° und deutete entweder anterior oder posterior in Bezug auf Tieranatomie, um in der Orientierung der Gewebesegment folgende Dissektion unterstützen.
7. Sammeln Sie die einzelnen Blöcke in kleine, klar gekennzeichnet Flaschen, die eine Lösung von Paraformaldehyd (4% in 0,1 M PB) und lassen bei RT O / N.
8. Übertragen Sie die Bausteine ​​in sauberen, deutlich etikettierten Flaschen, die eine Lösung von Saccharose (30% in 0,1 M PB) und halten bei 4 ° C für mindestens zwei Tage.
9. Legen Sie die Segmente in Kryo-Formen und bedeckte sie mit Gewebe Einfriermedium. Für Längs histologischen Präparat, orientieren Sie die Blöcke mit der dorsalen Seite nach oben und verwenden Sie die Bezugsmarke, um den Block in der Kryo-Formen zu orientieren.
10. Frieren Sie die Kryo-Formen bei -20 ° C und schneiden mit einem Kryostat in 50 & mgr; m dicke Schnitte. Anmerkung: Die Abschnitte können direkt auf die Adhäsion von Objektträgern montiert werden und trocknen gelassen O / N. Alternativ können die Abschnitte in 48-Well-Platten mit 0,1 M PB gefüllt flotiert werden und anschließend mit Hilfe der Bezugsmarkierung, um die Gewebeschnitten auf den Objektträgern befestigt zu orientieren.

5. Lendenwirbelsäule Cord Dissection und Vorbereitung für die Histologie

1. Legen Sie das Tierkörper auf dem Rücken.
2. Führen Sie ein Mittellinienschnitt entlang der Bauch des Tieres und entfernen Sie die Eingeweide. Sezieren die Muskeln der hinteren Bauchwand, den ventralen Seite der Wirbelsäule freizulegen.
3. Suchen Sie den Kurzschwanz-Rippe und die meisten der angrenzenden Wirbelkörper T13 T13, wo der ventralen Wurzel verlässt den Knochen.
   1. Nacheinander zu entfernen einen nach dem anderen der zwei oder drei Wirbel rostral T13 (dh, T12, T11 und, falls erforderlich, T10) mit feinen chirurgischen Knochenzangen, um die T13 ventralen Wurzel bis zu seiner Eintrittspunkt in der ventralen Aspekt der ventralen Kabel zu folgen und markieren Sie es mit einem permanenten Filzstift.
   2. Von diesem Punkt an, wiederholen Sie den Vorgang, um den Ort der ventralen Wurzel Einstiegspunkte für L1, L2, L3, L4, L5, L6 und S1 zu identifizieren, mit wechselnder Farbe und färben sie.
4. Gehen Sie genauso vor, wie in Abschnitt 4,5 bis 4,10 für lum beschriebenBar Rückenmark Dissektion.

Ergebnisse

Acetylcholinesterase histochemische Färbung zeigt den Standort der motorischen Endplatten über die Breite der Muskeln. 1 zeigt die Ergebnisse einer solchen Färbung auf einem ganzen Rattenvorderbein durchgeführt. Es wird vorgeschlagen, um die Konzentration des Ammoniumsulfidlösung zu optimieren (z. B. 5-7% anstelle von 10%), wenn die nicht-spezifische Hintergrundfärbung auf die Muskelfasern zu sowie der Zeit wird die Probe in die Lösung eingetaucht trieben. 2 veranschauli...

Diskussion

Intramuskulär Targeting und anschließende Rückübertragung von therapeutischen Transgenen zu den entsprechenden α-Motoneuronen zur experimentellen Behandlung von neuromuskulären Zustand ist keine neue Strategie. Zum Beispiel hat dieses Liefermethode wurde verwendet, um die neuromuskuläre Degeneration in verschiedenen Stadien des ALS Progression SOD1 Mäusen und Ratten ^1,9-12 sowie in Mäusen mit SMA ¹³ verzögern. Obwohl vielversprechend, die Wirksamkeit dieser Gentherapie Szenarien begrenzt ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%