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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Zusammenfassung

Schwangerschaft wird durch die Infiltration von Leukozyten in der reproduktiven Gewebe und an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Decidua basalis und Dezidua parietalis) gekennzeichnet. Diese Schnittstelle ist der anatomischen Stelle der Kontakt zwischen Mutter und Fetus Gewebe; es ist daher ein immunologisches Wirkort während der Schwangerschaft. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus Schnittstelle spielen eine zentrale Rolle bei der Implantation, Schwangerschaft Wartung, und der Zeitpunkt der Lieferung. Daher werden phänotypische und funktionelle Charakterisierung dieser Leukozyten Einblick in die Mechanismen, die zu Schwangerschaftsstörungen führen werden. Verschiedene Protokolle haben, um zu isolieren infiltrierenden Leukozyten aus der Dezidua basalis und Dezidua parietalis beschrieben; Jedoch macht der Mangel an Übereinstimmung in den Reagenzien, Enzyme und Inkubationszeiten es schwierig, diese Ergebnisse zu vergleichen. Hierin wird ein neuartiger Ansatz, der die Verwendung von sanften mechanischen und enzymatischen diss kombiniertereinigung Techniken, um die Lebensfähigkeit und Integrität der extra- und intrazellulären Markern in Leukozyten aus den menschlichen Geweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle getrennt zu bewahren. Abgesehen von Immunphänotypisierung, Zellkultur und Zellsortierung, die zukünftige Anwendungen dieses Protokolls sind zahlreich und vielfältig. Nach diesem Protokoll können die isolierten Leukozyten verwendet werden, um DNA-Methylierung, die Expression von Zielgenen, in vitro Leukozyten Funktionalität (dh die Phagozytose, Zytotoxizität, T-Zellproliferation und Plastizität, etc.), und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies zu bestimmen an der Mutter und Fötus-Schnittstelle. Zusätzlich mit dem beschriebenen Protokoll wurde dieses Labor in der Lage, neue und seltene Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zu beschreiben.

Einleitung

Schwangerschaft wird durch drei verschiedene immunologische Phasen gekennzeichnet: 1) der Implantation und der frühen Plazentation mit einer pro-inflammatorische Reaktion verbunden (dh der Implantation ähnelt eine "offene Wunde"); 2) dem zweiten Trimester und das meiste des dritten Trimesters der Schwangerschaft, wenn Immunhomöostase wird durch eine überwiegend anti-entzündlichen Zustand an der mütterlich-fötalen Grenzfläche erreicht; und 3) der Geburt, einer pro-inflammatorischen Zustand 1-7. Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Entzündungsreaktion an der Mutter und Fötus-Schnittstelle, wo ihre Fülle und Lokalisierung Veränderung während der Schwangerschaft 6-9.

Bei Menschen, die Mutter und Fötus-Schnittstelle stellt einen Bereich des direkten Kontakts zwischen mütterlichen (decidua) und fetale (Chorion oder Trophoblast) Gewebe. Diese Schnittstelle umfasst: 1) die Decidua parietalis, die Linien der Gebärmutterhöhle nicht von der Plazenta bedeckt und in Juxtapositionauf die Chorion laeve; und 2) der Dezidua basalis, in der Basalplatte der Plazenta, wo es durch interstitielle Trophoblasten 10 (1) eingedrungen entfernt. Die Intimität dieser Kontaktbereiche schafft die Voraussetzungen für die fetale Antigen-Exposition gegenüber dem mütterlichen Immunsystem 11-13. Nicht überraschend, umfassen Leukozyten bis zu 30-40% der Deciduazellen 8,9,14,15 neben typischen Stromazellen Typzellen und Drüsenzellen 8,14,16. Die Rolle der Leukozyten bei der mütterlich-fötalen Grenzfläche umfasst mehrere Prozesse, für die Begrenzung der Trophoblastinvasion 17, Umbau von Spiralarterien 18,19, Wartung der mütterlichen Toleranz 12,20 und Initiierung der Arbeits 21-26 enthalten. Leukozyten sowohl des adaptiven und angeborenen Schenkel des Immunsystems, dh T-Zellen, Makrophagen, Neutrophilen, B-Zellen, dendritische Zellen und NK-Zellen, sind in den decidual Geweben identifiziert worden, und ihreProportionen und Aktivierungsstatus wurde gezeigt, räumlich und zeitlich während der Gestation 6-10,12,14,24,27-30 variieren. Störungen in der Leukozyten-Population und / oder Funktion sind mit Spontanabort 31, Präeklampsie 32, intrauterine Wachstumsrestriktion 32,33 und Frühgeburt 7,24 verbunden. Daher wird die Untersuchung der phänotypischen Eigenschaften und Funktionen von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle die Aufklärung der immunologischen Wege in Schwangerschaftsstörungen fehlreguliert zu erleichtern.

Eine der leistungsfähigsten Werkzeuge verwendet, um den Phänotyp und funktionellen Eigenschaften der Leukozyten zu bestimmen, ist Durchflusszytometrie Technologie, die die quantitative Analyse von mehreren Parametern gleichzeitig 34-36 ermöglicht. Leukozyten durch Durchflusszytometrie analysiert, wird die Isolierung der Leukozyten in einer Einzelzellsuspension benötigt. Daher ist ein Verfahren zur Abtrennung infiltrierenden leukocytes von der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt wird, um ihre phänotypischen und funktionellen Eigenschaften zu studieren.

Es wurden mehrere Verfahren beschrieben worden, um Leukozyten aus dem menschlichen maternofetalen Schnittstelle 10,14,25,27,37-39 isolieren. Während einige gelten mechanische Aufschlüsselung 10,25,27,38, andere verwenden enzymatische Verdauung 37,40 für Gewebedissoziation. Da mechanische Zerlegung erzeugt eine geringere Ausbeute und verminderte Lebensfähigkeit 41 und enzymatische Dissoziation kann Lebensfähigkeit und Zelloberflächenmarker Retention 42 beeinflussen, die hier beschriebene Methode kombiniert sanfte mechanische Dissoziation mit enzymatische Vorbehandlung, die Ausbeute an isolierten Leukozyten, ohne dabei die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Eine ähnliche Kombination von Methoden nachgewiesen wurde als wirksam bei der Isolation von Leukozyten aus der Dezidua-Gewebe an der mütterlich-fötalen Grenzfläche 39 ist. Daher sind die hierin beschriebenen Protokoll beinhaltet mechanische Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, die Konsistenz erhöht und spart Zeit und Arbeit, wenn die traditionellen Fleischwolf gegenüber gegnerischen Skalpelle, Rasierklingen, oder chirurgische Scheren 10,28. Die für Gewebedissoziation gewählten Enzym war Accutase. Anders als häufig verwendete Kollagenase 43, Dispase 44 und Trypsin 45, Accutase (a Zellablösung Lösung) kombiniert sowohl allgemeine proteolytischen und kollagenolytische Aktivitäten, die für eine effiziente und dennoch schonende Dissoziation 46,47 beizutragen. Nach Dissoziation werden die Leukozyten aus der Gesamtbevölkerung der Deciduazellen durch Dichtegradientenzentrifugation angereichert. Verschiedene Dichtegradientenmedien zuvor verwendet worden, von denen die häufigsten sind Percoll (eine Suspension von kolloidalen Siliciumdioxidteilchen) 48 und Ficoll (ein Polymer aus Saccharose mit einem hohen synthetischen Molekulargewicht) 49. Die überlegene Effizienz der Trennung von der Saccharose Polymer wurde previonuierlich 50 gezeigt, und die hierin weiter beschriebenen Protokoll beweist, dass diese Dichtegradientenmedien erzeugt eine ausreichend hohe Reinheit von mononukleären Leukozyten.

Daher ist das hier beschriebene Protokoll verbindet die mechanische Gewebe Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, enzymatische Verdauung mit einer Zellentfernungslösung und Leukozyten-Trennung mit einem Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml), um Leukozyten aus menschlichen Dezidua-Gewebe zu isolieren. Dieses Protokoll ist nachgewiesen worden, Zelloberflächenantigene zusammen mit Zelllebensfähigkeit zu bewahren. Die isolierten Leukozyten kann für mehrere Anwendungen, die Immunphänotypisierung mit der Durchflusszytometrie und funktionelle Untersuchungen in vitro zählen verwendet werden.

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Protokoll

Dieses Protokoll wird für Leukozyten isoliert von den Decidua basalis und Dezidua parietalis in der Vorbereitung für Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie geeignet. Weiterhin können die isolierten Zellen für die Zellsortierung, Zellkultur, RNA-Isolierung und der Zytologie verwendet werden. Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen menschliche ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und Institutional Review Boards erhältlich. Die Sammlung und Nutzung der menschlichen Proben zu Forschungszwecken wurden von den Institutional Review Boards der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Department of Health and Human Services (DHHS genehmigt , Bethesda, MD, USA) und der Wayne State University (Detroit, MI, USA). Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen schwangeren Frauen vor der Entnahme von Gewebeproben erhalten.
HINWEIS: Während der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder GefahrenGehilfen, wie in diesem Protokoll erwähnt, ist es wichtig, dass die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden.

1. Dissection der Menschen Deziduale Tissues

HINWEIS: Die Basalplatte ist die Basis unterhalb und Plazenta befestigt und stellt die mütterliche Oberfläche. Die chorioamniotic Membranen sind das Amnion und Chorion. Die Basalplatte umfasst die Decidua basalis und das Chorion umfasst die Decidua parietalis (Abbildung 1).

  1. Decidua Basalis
    1. Sezieren ein Stück der Basalplatte von einem Keimblatt der Plazenta (1A und 1B).
    2. Legen Sie sie auf einem sterilen Schneidebrett mit den Plazentazotten nach oben zeigt. Die Seite, die die Plazentazotten ist in der Regel blutig rot mit behaarten Gewebe in Erscheinung. Die Basalplatte ist glatt und blass in der Farbe rot.
    3. Verwenden Sie scharfe, feine Punkt Schere und Pinzette, um die vill entfernenous Gewebe und Blutgefäße. Halten Sie das Gewebe in 1x PBS eingeweicht während des Prozesses (Abbildung 1c) (Ca 2+ - kostenlos - und Mg 2+). Sammeln Sie 2 bis 3 dieser Stücke und spülen Sie sie gründlich mit 1x PBS, das Blut (1D) zu entfernen.
  2. Decidua parietalis
    1. Sezieren ein Stück der chorioamniotic Membranen (ungefähr 10 cm x 10 cm, 1E). Legen Sie sie auf dem Brett mit dem Chorion nach oben zeigt. Das Chorion-Seite enthält blutigen Klumpen und ist in der Regel leicht gelblich gefärbt.
    2. Verwenden Sie fein Punkt Pinzette möglichst viele der von Blutgerinnseln wie möglich (1E) zu entfernen. Spülen Sie die Membran in sterile 1x PBS, um das überschüssige Blut aus der Membran zu reinigen, bis die 1x PBS klar ist.
    3. Verwenden Sie eine sterile Zellschaber sanft kratzen die dezidualen Schicht von der Membran. Bewerben sterile 1x PBS auf der memBrane während Abschluss dieses Prozesses (1F). Sammeln Sie die dezidualen Gewebe und legen Sie sie in einem 50 ml-Kunststoffröhrchen mit sterilem 1x PBS (1G).

2. Mechanische Disaggregation und enzymatische Verdauung

  1. In einem 50 ml-Kunststoffrohr waschen das Gewebe aus der Dezidua basalis (aus Schritt 1.1.3) seziert oder Dezidua parietalis (aus Schritt 1.2.3) mit sterilem 1x PBS. Sammeln Gewebepellets durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei RT.
  2. Saugen Sie den Überstand über dem Gewebepellet befinden vorsichtig, ohne das Pellet aufzurühren.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt werden die Pellets sehr locker, da sie rote Blutzellen enthalten. Wenn das Volumen des Pellets beträgt etwa oder weniger als 3 ml, resuspendieren das Pellet in 6 ml Zellentfernungslösung auf 37 ° C vorgewärmt. Wenn die Pellets größer als 3 ml Volumen, fügen Sie mehr Zellablösung Lösung (fügen Sie etwa 2 mal the Volumen der Gewebeproben).
  3. Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe (Decidua basalis + Zellablösung Lösung oder Dezidua parietalis + Zellablösung Lösung) zu einem C-Rohr.
  4. Legen Sie das C-Rohr in der automatischen Dissociator und führen Sie das entsprechende Programm.
    HINWEIS: Das Programm für die Decidua basalis läuft für 17 sec mit 668 Gesamt Schuss pro Lauf. Das Programm für die Decidua parietalis läuft für 37 sec mit 235 Gesamt Schuss pro Lauf. Diese Programme wurden angepasst, um Leukozyten aus der Dezidua basalis oder der Dezidua parietalis mit guter Ausbeute und Lebensfähigkeit der Zellen zu isolieren.
  5. Nach der mechanischen Disaggregation der Gewebe zu verdauen die Gewebe mit einer im Handel erhältlichen Zellablösung Lösung wie Accutase; (Ein Cocktail, der proteolytischen und kollagenolytische Enzyme enthält) für 45 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.

3. Isolierung der Leukozyten

  1. Nach der Inkubation mit 10 ml 1x PBS auf die DIGElierte Gemischs und führt es durch einen 100 um Zellsieb in einen 50 ml Kunststoffrohr. In Abhängigkeit von der Klebrigkeit des Verdauungsgemisch, kann man brauchen, um mehrere Zellsiebe für eine Mischung zu verwenden.
  2. Füllen Sie den Schlauch mit 1x PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die 1x PBS über den Zellpellets sorgfältig und resuspendieren der Pellets mit 5 ml eiskaltem FACS-Puffer.
    HINWEIS: Um die polymorphkernigen und mononukleären Leukozyten zusammen lernen, gehen Sie zu Schritt 6.1; um die mononukleären Leukozyten zu untersuchen, gehen Sie zu Schritt 3.3.
  3. 5 ml 20% Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml) in ein 15 ml-Kunststoffrohr und langsam lagern die Zellsuspension auf der Oberseite des Dichtegradientenmedien. Während Schichtung der Probe ist es wichtig, nicht die Dichtegradientenmedien mit der Zellsuspension gemischt.
  4. Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor bei 500 xg für 30 min bei 4 ° C ohne Bremse. Es ist sehr wichtig, schalten Sie die Bremse, um zu vermeiden, indem die Zellen und lOsing die Steigung. Leukozyten werden in der Schnittstelle zwischen dem Dichtegradienten Medien und der FACS-Puffer gefunden werden.
  5. Die obere Schicht, die die FACS-Puffer und Zelltrümmer enthält sehr vorsichtig mit einer Pipette. Das Band an der Schnittstelle enthält die decidual mononukleären Zellen und einen Teil der polymorphkernigen Leukozyten.
  6. Übertragen der Zellen an der Grenzfläche vollständig auf eine neue 15-ml-Plastikröhre. Fügen mindestens 3 mal mehr Volumen FACS-Puffer.
  7. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer. Pelletisieren der Zellen mit einem weiteren Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei RT.
    HINWEIS: Um die Zellkultur durchführen, finden Sie in Schritt 4. Zum Zellsortierung durchführen, finden Sie unter Schritt 5. Um Immunphänotypisierung durchführen, finden Sie in Schritt 6.

4. Anwendungen - Zellkultur

  1. Resuspendieren der Zellen aus Schritt 3.7 in 1 ml RPMI 1640 Kulturmedium Zählen der lebensfähigen Zellen using eine automatische Zellzähler oder einer Zählkammer und Trypanblau-Lösung 0,4%.
  2. Addieren der Menge an RPMI-Kulturmedium, um eine Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml zu ergeben. Die Zellen sind nun bereit für Kultur.

5. Anwendungen - Isolierung von Makrophagen für Primärzellkultur

  1. CD14 + Zellen zu isolieren, magnetisch zu markieren, die Zellen aus Schritt 3.7 mit CD14 Microbeads (20 ul Perlen pro 10 7 Zellen), die Proben für 15 min bei 4 ° C und separate CD14 + Zellen aus anderen Arten von Zellen, die durch Anlegen eines Magnetfeldes. Nach 2 Waschvorgängen mit MACS-Puffer und Entfernen des Magnetfelds eluieren magnetisch gehalten CD14 + Zellen mit MACS-Puffer.
  2. Nach der Zentrifugation resuspendieren die Zellpellets in RPMI 1640 Kulturmedium werden die Zellen bereit für die Beschichtung (2).

6. Anwendungen - Immunphänotypisierung

  1. Um die Zellen auf immunophenot verwendenyping, resuspendieren der Zellen aus Schritt 3.7 in 1 ml 1 × PBS. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder einer Zählkammer und Trypanblau-Lösung 0,4%.
  2. Beschriften Sie die Zellen mit einem fixierbaren Lebensfähigkeit Farbstoff (Abbildung 3). Wasche die Zellen zweimal mit FACS-Puffer und Resuspension der Zellen in Puffer Fleck. Inkubieren mit einem FcR-Blocker für 15 min bei 4 ° C.
  3. In der extrazellulären Antikörpern gegen Fluorochrome konjugiert. Zum Beispiel wird in diesem Protokoll verwendet anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 und anti-CD56-Antikörpern (Tabelle 1). Inkubieren für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln.
  4. Nach 2 Waschvorgängen mit 1x PBS werden die Zellen in 500 ul Puffer Fleck unter Verwendung eines Durchflusszytometers analysiert. Eine Darstellung der Gating-Strategie verwendet, um die Leukozyten-Subpopulationen in der Dezidua-Geweben zu analysieren, ist in 4 gezeigt.

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Ergebnisse

. Die Präparation von menschlichen Geweben auf der mütterlich-fötalen Grenzfläche (Dezidua basalis und Dezidua parietalis) ist in Abbildung 1 dargestellt Dieses Verfahren umfasst die Präparation der Grundplatte, die Decidua basalis (1A - D) enthält. Decidua basalis wird durch Entfernen des Plazentazotten (fötales Seite) von der basalen Platte (1C) erhalten. Decidua parietalis wird durch leichtes Abkratzen der Chorionmembran (1E -...

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Diskussion

Charakterisierung der funktionellen und phänotypischen Eigenschaften der Infiltration von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle ist wesentlich für das Verständnis der Immunmechanismen, um eine Schwangerschaft zu Störungen führen. Es wurden mehrere Techniken, um Leukozyten aus dem menschlichen mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft 10,14,25,28,37,42,43 isolieren beschrieben. Jedoch jede dieser Techniken unterscheidet, verwendet verschiedene Enzyme oder...

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Offenlegungen

The authors disclose no conflicts of interest.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development, NIH / DHHS unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt, teilweise von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal-Kind-Gesundheit. Wir danken Maureen McGerty (Wayne State University) für ihre kritische Messwerte des Manuskripts.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers Any vendor20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)Life Technologies(1X PBS)
Large and small Petri dishesAny vendor
Dissociation
AccutaseLife TechnologiesA11105-01(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubesAny vendor
50 ml conical centrifuge tubesAny vendor
100 µm cell strainersFALCON/Corning352360
5 ml round bottom polystyrene test tubesAny vendor
Transfer pipettesAny vendor
C tubesMiltenyi Biotec130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640 Life Technologies22400-089(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slidesThermo Scientific177437
IncubatorThermo Scientific CorporationHEPA Class 100
Water bathFisher ScientificISOTEMP 110
Cell counterNexelcomCellometer Auto2000
MicroscopeOlympusOlympus CKX41
Cell Separation
MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Cell separatorMiltenyi Biotec130-042-109
30 μm pre-separation filtersMiltenyi Biotec130-041-40
MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
15 ml safe-lock conical tubesAny Vendor
MACS buffer (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR BlockingMiltenyi Biotec130-059-901(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies BD Biosciences(Table 1)
Bovine serum albumin SigmaA7906
LIVE/DEAD viability dyeBD Biosciences564406
Lyse/Fix buffer BD Biosciences346202
FACS buffer (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer BD Biosciences554656
Trypan Blue solution 0.4%Life Technologies15250-011
FicollGE Healthcare17-1440-0220% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shakerThermo ScientificMAXQ 4450
Flow cytometerBD BiosciencesLSR-Fortessa
Centrifuge Beckman CoulterSpinChron DLX
Vacuum systemAny vendor
Automatic tissue dissociator Miltenyi BiotecgentleMACS Dissociator

Referenzen

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