Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Zusammenfassung

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Zusammenfassung

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Einleitung

Rasterkraftmikroskopie (AFM) erzeugt ein Bild einer Oberfläche durch Abtasten über einen Bereich der Probe unter Verwendung eines Auslegers mit einer sehr scharfen Spitze ^1. Die Bewegung des Auslegers tastet die Oberflächentopologie der Probe. AFM wurde weithin an biologische Moleküle aufgebracht - einschließlich Proteinen, DNA und Membranen, die aufgrund ihrer Flexibilität bei der Analyse von festen Proben in Luft oder nahezu native Zustand in flüssiger ^2-5.

Abgesehen von seiner hochauflösenden Imaging-Fähigkeit im Nanometerbereich, wirkt der AFM Cantilever als Feder, um Wechselwirkungskräfte (Adhäsion und Repulsion) und mechanischen Eigenschaften der Probe ^5,6 sondieren. Dies wird als Kraftspektroskopie bekannt. In diesem Modus wird zuerst nähert die Sonde die Probe und übt eine Kraft auf, dann zurückgezogen wird, bis er den Kontakt verliert mit der Probe (1A). Die erzeugten Kurven zeigen Kraft als Funktion der Entfernung des Auslegers sowohl für den AppRotauge und Einfahren. Mehrere Objekte einschließlich des Elastizitätsmoduls, die Steifigkeit eines Materials zu messen, und Adhäsionskräfte ableiten.

Unterstützte Lipid-Doppelschichten sind biologische Modellmembranen auf einem festen Träger liegend - in der Regel Glimmer, Borosilikatglas, Quarzglas, oder oxidierten Silizium ^7. Sie werden mit verschiedenen Techniken wie Vesikel Abscheidung hergestellt, Langmuir-Blodgett-Verfahren und Spin-Coating ^8,9. AFM verwendet wurde, um die Bildung dieser abgestützt Doppelschichten ¹⁰ zu folgen, und der Sonde unterschiedliche Strukturen von Membranen unterschiedlicher Zusammensetzungen ^11-15 gebildet.

Darstellende Kraftspektroskopie auf unterstützten Doppelschichten führt zu einer Spitze in der Ansatz-Kurve. Dieser Peak zeigt die Kraft, die benötigt, um die Doppelschicht zu durchdringen, und heißt Durchbruch Kraft. Die Doppelschichtdicke kann auch über die Kraftkurve ⁶ gemessen werden. Die typische Durchbruchkraft von DoppelschichtenBereich zwischen 1-50 nN ^6. Diese Eigenschaften hängen von Lipidpackung (flüssig oder Gelphase) und Struktur (Acylkettenlänge und Grad der Ungesättigtheit) von membranaktiven Mittel ¹⁶ verändert. Die Theorie hinter dem Bruch wurde erläutert, ¹⁷ und andere experimentelle Parameter wie Cantilever Weichheit, Spitzenradius und Annäherungsgeschwindigkeit auch die bahnbrechende Kraft ^15,16,18 beeinflussen. Kraftspektroskopie wurde verwendet, um die Eigenschaften der verschiedenen Lipidphasen ^11,19, Zusammensetzung abhängigen Änderungen ^12,20 sowie Wirkungen anderer Biomoleküle wie Peptide zu analysieren, auf die Stabilität der Membran ^21.

Die flache Orientierung unterstützt Doppelschichten ist für die Kombination von AFM mit anderen Verfahren wie Oberflächenplasmonresonanz ²² und der Fluoreszenzmikroskopie ^11,19 eine bessere Charakterisierung Struktur und die Eigenschaften von Membranen vorteilhaft.

Diese ausführliche Video protocol soll unterstützten Lipiddoppelschichten bereiten Vesikel mit Abscheidung und mit AFM und Kraftspektroskopie zu analysieren. Während Vesikel in verschiedenen Größen verwendet werden, um Doppelschichten herzustellen, konzentriert sich dieses Protokoll auf kleinen und großen unilamellaren Vesikeln. Unterstützte Doppelschichten, die in flüssige Phase bestellt (L _o) und flüssige ungeordneten (L _d) Phasentrennung wurden ^11,15 aus. 2: 1-Verhältnis die Membran aus Di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC), Sphingomyelin (SM) und Cholesterin (Chol) bei 2 besteht. Diese Zusammensetzung Modelle die Lipid Rafts, die vorgeschlagen werden, um als Plattform für wichtige Proteintransport und Sortierung, Zellsignalisierung und andere zelluläre Prozesse ^23,24 verhalten.

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Protokoll

1. Vorbereitung der unterstützten Lipiddoppelschichten (SLB) ^11,12,21

1. Herstellung von Lipid-Mischung und Multilamellare Vesikelsuspensionen
   1. Bereiten Sie die folgenden Puffer vorher.
      1. Vorbereitung PBS-Puffer bei Konzentrationen von 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH ₂ PO _4, 8 mM Na ₂ HPO ₄ und 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Vorbereitung SLB (unterstützte Lipiddoppelschicht) Puffer bei Konzentrationen von 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.
      3. Es wird eine Lösung von 1 M CaCl _2.
   2. Man löst die folgenden Lipide in Chloroform in einer gewünschten Konzentration: beispielsweise Di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC) bei 25 mg / ml, Sphingomyelin (SM) bei 25 mg / ml und Cholesterin (Chol) bei 10 mg / ml.
   3. Nehmen 18,38 ul DOPC 17,10 ul SM und 11,30 ul Chol, um eine Lösung mit 1 mg Gesamtlipiden in einem 2 zu machen: 2: 1 DOPC: Molverhältnis Chol: SM. Variieren die Volumina entsprechend auf der Grundlage der concentrations der in 1.1.2 hergestellten Lipide. Behält jedoch das Molverhältnis von 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol als Änderung des Molverhältnisses wird die Phaseneigenschaften der Membran ²⁵ zu ändern.
   4. Mischen Sie die Lösung vollständig durch Vortexen. Hinzufügen eines fluoreszierenden lipidischen Farbstoff bei 0,05 Mol-%, wenn man die Doppelschicht mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen wünscht.
      Hinweis: Die Familie von langkettigen dialkylcarbocyanines, mochte, DiI und DiO umfassen einen weiten Bereich von Wellenlängen und können idealerweise verwendet werden, um Lipidmembranen zu markieren. Alternativ können fluoreszenzmarkierten Lipiden, wie Rhodamin- Phosphatidylethanolamin oder BODIPY-Cholesterin verwendet werden. In jedem Fall sollte die Konzentration des Farbstoffs gemäß der Mikroskopie Einstellung optimiert werden, wenn man bedenkt, dass hohe Konzentrationen des Fluorophors an das Lipid gebunden ist, kann die Lipid Verhalten ¹⁹ zu ändern.
   5. Trocknen Sie das Chloroform unter Verwendung von _N2-Gas (oder einen beliebigen verfügbaren Inertgas wie Ar und He).
   6. Weitere dry-Ter Lipidgemisch unter Vakuum für mindestens 1 Std.
      Hinweis: Wenn das Speichern dieser Lipidmischung, Spülluft mit Inertgas (N _2, Ar oder He) und bei -20 ° C. Aliquot überschüssige Lipide-in-Chloroform in kleine braune Fläschchen. Trocknen Sie sie in einer ähnlichen Weise wie die Lipid-Mischung, verdrängen Luft mit Inertgas (N _2, Ar oder He) und bei -20 ° C.
   7. Auflösung der getrockneten Lipide in einem PBS-Puffer auf eine Konzentration von 10 mg / ml.
   8. Wirbel die Mischung kräftig für etwa 20 sec bis 1 min, um eine trübe Suspension zu erhalten, mit einem multilamellaren Vesikeln. Stellen Sie sicher, dass die keine Lipidfilmen Festhalten an den Seiten des Fläschchens.
   9. Verteilen Sie diese Suspension in 10 ul Aliquots (1 mg Lipid macht 10 Teilmengen).
   10. Lagerung bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
2. Herstellung unilamellare Vesikel
   Anmerkung: Verschiedene Größen von unilamellare Vesikel können mit dem Beschallungsverfahren oder dem Extrusionsverfahren hergestellt werden. Beschallung verwendet sound Energie, um das Gemisch zu rühren und trenne die Schichten des multilamellaren Suspension. Dies wird durch Bereinigung der trübe Suspension angezeigt. Extrusion zwingt die multilamellaren Vesikeln, um durch einen Membranfilter mit einer bestimmten Porengröße bestehen.
   1. Beschallungsverfahren
      1. Nehmen Sie die 10 ul multilamellaren Lipidsuspensionen und fügen Sie 150 ul SLB-Puffer.
      2. Übertragen Sie die Mischung in kleine (2 ml) bedeckten Glasfläschchen und Dichtung mit Parafilm.
      3. Beschallen des Gemisches bei Raumtemperatur in einem Ultraschallbad für 10 min oder bis sie klar wird, kleine unilamellare Vesikel (SUVs mit einem Durchmesser unter 50 nm) zu erhalten.
   2. Extrusionsverfahren
      1. Nehmen Sie die 10 ul multilamellaren Lipidsuspensionen und fügen Sie 150 ul SLB-Puffer.
      2. Übertragung der Suspension in einen kryogenen Röhre.
      3. Einfrieren der Lipidsuspension durch Eintauchen des kryogenen Schlauch für ein paar Sekunden in flüssigen Stickstoff.
      4. AuftauenLipidsuspension durch Eintauchen des kryogenen Rohr in einem Wasserbad bei Raumtemperatur oder 37 ° C für ein paar Minuten. Wiederholen Sie die Frost-Tau-Stufen mindestens 10-mal.
      5. Um die Lipidsuspension zu extrudieren, mit einem Polycarbonatmembran mit 200 nm Porengrße (andere Porengrößen sind verfügbar, wie 100 nm oder 400 nm) und einem kommerziellen Extrusionsvorrichtung ^26.
         Hinweis: Zur Zeit gibt es zwei Extruder Geräte im Handel erhältlich: ein Handbuch Extruder ist für kleine Volumen (200 ul auf wenige ml) erhältlich. In diesem Fall wird die Probe durch die Membran durch manuelles Schieben der Suspension hin und her zwischen zwei Spritzen extrudiert. Je nach Hersteller, würde Lipid Aliquots müssen kombiniert werden, um Mindestvolumen von der Einrichtung zu erreichen. Für größere Mengen (bis zu 50 ml) ausgefeiltere Vorrichtungen verwendet werden, in dem die Suspension durch die Polycarbonat-Membran mit Hilfe von Druckgas gepresst. Aufbau und Extrusionsbedingungen können entsprechend der mod ändernel. Beachten Sie die Hinweise des Herstellers beachten. Dieses Protokoll bezieht sich auf die manuell bedienbarer Extruder für kleine Volumina.
      6. Ins Gleichgewicht des Extruders in Wasser, indem Wasser durch den Extruder. Tauchen Sie die Membran in Wasser.
      7. Platzieren der Membran zwischen den beiden Kolben, montieren die Vorrichtung und im Gleichgewicht belassen, Puffer, indem man den Puffer durch den Extruder von einer Spritze zur anderen. Zusätzlich ermöglicht dieser Schritt die Prüfung der Undichtheit des Systems. Wenn sie undicht ist, zerlegen und wieder zusammenbauen es wieder Veränderung der Membran.
      8. Nehmen Sie die Lipidsuspension mit Hilfe einer Spritze des Extruders ("Schmutzseite").
      9. Befestigen Sie die Spritze mit der Lipidsuspension auf einen Kammer und die leere Spritze auf der gegenüberliegenden Kammer.
      10. Schieben Sie die Spritze an einem Ende. Übergeben Sie die Lösung durch die Membran und in das gegenüberliegende Spritze. Dies ist der ^1. Pass ab.
      11. Führt es durch die Membran für eine Gesamtzahl von 31 mal solchendaß die Lösung endet an der gegenüberliegenden Spritze ("saubere Seite").
          Hinweis: Prüfen Sie die Membran nach dem Extrudieren. Wenn es war gebrochen, dann Extrusionsverfahren war nicht erfolgreich und muss wiederholt werden.
      12. Leeren Sie die Spritze in einem Röhrchen. Große unilamellare Vesikel (LUVs) sind für 1-2 Tage stabil, wenn sie bei 4 ° C gehalten.
3. Herstellung von Mica und Deckgläser
   1. Waschdeckgläschen erst in Wasser und dann in Ethanol. Luftgetrocknet.
   2. Nehmen Glimmerscheiben und ziehen Sie die äußere Schicht mit Klebeband.
   3. Befestigen Sie die Glimmerscheibe auf dem Deckglas. Transparente optische Klebstoffe sind optimal, so dass man die Doppelschichten mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüfen.
   4. Bringen Kunststoffzylinder (2,5 cm Außendurchmesser, 2 cm Innendurchmesser und 0,5 cm Höhe) mit optischen Kleber / Fett. Stellen Sie sicher, dass alles dicht ist und keine Lecks vorhanden sind. Verwenden Sie Fett zu wollen, wenn Wiederverwendung der Zylinder, da sie leicht von th abgelöst werdene Deck und gewaschen. Wobei die Abmessungen der Kunststoffzylinder, abhängig von der Größe des AFM Cantileverhalter und sollte entsprechend eingestellt werden.
4. Ablagerung von unilamellare Vesikel auf einem festen Träger
   1. Pipette das gesamte Liposomenlösung direkt auf den Glimmer. Noch ein SLB Puffer auf ein Volumen von 300 & mgr; l zu erreichen.
   2. Add 0,9 ul 1 M Calciumchlorid-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 3 mM Ca ²⁺ erreichen.
   3. Inkubieren bei 37 ° C für 2 min und dann bei 65 ° C für mindestens 10 min. Immer decken die Doppelschichten mit Puffer. Kontakt mit Luft und Luftblasen zu zerstören. Während der Inkubation fügen weitere Puffer, wenn notwendig, insbesondere, wenn die Inkubation bei höheren Temperaturen.
      Anmerkung: Die Inkubationstemperaturen je nach den Lipidmischungen und Phasen erforderlich. Inkubationszeit von mindestens 10 min erforderlich ist, um getragen Doppelschichten zu bilden, aber es länger sein könnte, abhängig von der Temperatur und Zusammensetzung.
   4. Wäschedie Doppelschicht mit heißem (65 ° C) SLB Puffer 15-20 mal Calcium und nichtkondensierten Vesikeln zu entfernen. Seien Sie besonders vorsichtig während der Waschschritte, um die Doppelschicht unter Puffer zu halten und vorsichtig pipettieren der Waschlösung zu verhindern die Zerstörung der Doppelschicht.
   5. Coole unterstützt Doppelschichten auf Raumtemperatur vor AFM-Messungen. Dies ist erforderlich, um die unterschiedlichen Phasen der Membran sowie bilden Minimierung thermischer Drift im Gerät.

2. Rasterkraftmikroskopie-Messungen ^11,12

1. Imaging
   Hinweis: Führen Sie die Rasterkraftmikroskopie-Bildgebung im Kontaktmodus oder Tapping-Modus. Bild unterstützt Doppelschichten in Lösung; erlauben keine Lösung vollständig verdampfen, da dies die Doppelschichten zu zerstören. Wie man es mit einem Puffer zu arbeiten, beachten Sie bitte Vorsichtsmaßnahmen, dafür zu sorgen, dass jeder AFM Teil von Flüssigkeiten geschützt.
   1. Wählen Sie ein weiches Ausleger (unter 0,2 N / m Federkonstante wird empfohlen) und montieren Sie ihn auf ter AFM. Die Wahl des Auslegersteifigkeit für die Kraftspektroskopie kritischer (und dies wird später diskutiert werden).
   2. Montieren Sie die Probe auf der Bühne AFM und stellen Sie sicher, dass alle Schwingungsisolationsmodule eingeschaltet sind. Wartezeit von mindestens 15 min äquilibrieren und verringern die thermische Drift des Systems. In Abhängigkeit von der AFM-Set-up kann Tuning und Imaging-Spezifikationen variieren. Wenden Handbuch des Herstellers.
   3. Nähern Sie sich der Probe mit der AFM-Spitze bis zum Kontakt.
   4. Da Lipiddoppelschichten sind in der Regel 4 nm in der Höhe, verwenden die Z-Bereich des Instruments, die den höchsten z-Auflösung (beispielsweise 1,5 um) erhalten wird.
   5. Wählen Sie eine Region, die dem Bild. Um einen Überblick über die Lipiddoppelschicht, eine 50 & mgr; m × 50 & mgr; m oder 25 & mgr; m × 25 & mgr; m-Region wird ein guter Ausgangspunkt, um sein Bild zu bekommen. Wenn kleinere Features erscheinen, kann man Bild in kleinere Bereiche (10 & mgr; m × 10 & mgr; m oder 2 um x 2 um). Die Wahl der Abbildungsbereich hängt auch von der Arbeits range des piezoelektrischen Scanner. Bitte konsultieren Sie die Instrumentenhand dafür.
   6. Als Doppelschichten sind sehr zerbrechlich, den Sollwert der AFM-Spitze einstellen während der Bilderzeugung, die Kraft bei minimalem und richtig für thermische Drift zu halten, dabei ständig in Kontakt mit der Probe. Im Kontaktmodus, den Sollwert zu minimieren. Im Tipp-Betrieb, den Sollwert zu maximieren.
   7. Prozessbilder durch Anbringen jeder Scanlinie zu Polynom Ausgleichsfunktionen. Führen Linienentfernung für Scans, die Kontakt mit der Membran unter Verwendung der proprietären Software der AFM-Produktionsunternehmen zu verlieren.
2. Kraftspektroskopie
   1. Kalibrieren des Auslegers entsprechend den Anweisungen nach dem Protokoll des Herstellers. Kalibrierung ermöglicht die Umwandlung des elektrischen Signals der Photodioden, um eine Kraft (1B).
      1. Kalibrieren Sie die Empfindlichkeit der Spitze zur Ablenkung als z-Piezo-Bewegung (in Längeneinheiten) zu messen, anstatt elektrische Signal in Volt.
         Anmerkung: AFM detektiert Änderungen in der Auslenkung des Auslegers mit Hilfe eines Lasers auf der Rückseite des Auslegers reflektierten. Der Laser erreicht eine Photodiode, die die Position des Laserspots räumlich erfassen kann. Eine Änderung in der Durchbiegung des Auslegers, da es bei Kontakt mit der Probe biegt durch diese Fotodiode als "vertikale Ablenkung" erkannt, und dies ist in den Einheiten der Spannung. Da der Ausleger durch den z-Piezo bewegt wird, wird die vertikale Ablenkung auf die Bewegung in der z-Piezo verwandt. Das Verhältnis von vertikalen Ablenkung und z-Bewegung Empfindlichkeit genannt und wandelt Spannung an Distanz.
      2. Berechnung des Auslegerfederkonstante mit dem thermischen Rauschfrequenzverfahren, in der Regel in der AFM-Software integriert. Bei diesem Verfahren zeigen die Amplitude der Schwingung von Rauschen mit Bezug auf die Frequenz der Schwingung, wodurch eine spektrale Leistungsdichteverteilung. Dieses Grundstück wird eine Spitze um die Resonanzfrequenz zu zeigen. Die Frequenz, bei der die Amplitude idas Größte ist die Resonanzfrequenz. Setzen Sie eine Lorentz-Funktion rund um den Gipfel zu berechnen automatisch die Federkonstante durch die Software. Hier werden einige nützliche Ressourcen für die Theorie des thermischen Rauschens Verfahrens sind in den Artikeln ^{27 bis 30} angegeben.
   2. Nach der Bebilderung eine Fläche von der Doppelschicht, wählen Sie eine 5 um x 5 um-Bereich in der Doppelschicht auf Kraftspektroskopie durchzuführen.
   3. Einrichten des AFM so, dass es Kraftkurven in einem 16 x 16 Raster von der Region. Dies führt zu 256 Kraftkurven pro Region. Der Raum zwischen zwei benachbarten Punkten sollte ausreichen, um zu vermeiden, dass die Membranfläche von einem Punkt untersucht würde mit dem nächsten Punkt übereinstimmt. Dies ist abhängig von der Spitzenradius. A 100 nm Abstand zwischen zwei Punkten wäre ideal. Teilen Sie die 5 & mgr; m × 5 & mgr; m Bereich in 16 x 16 Gitter. Abhängig von der Größe der Phasen kann man einen kleineren oder größeren Bereich auszuwählen, und dann entsprechend an die Rastergröße.
   4. Stellen Sie z-Piezoverschiebung zu400 nm. Dies bestimmt die maximale Reichweite der Bewegung des z-piezo. Sie sollte groß genug sein, um sicherzustellen, dass der Ausleger vollständig weg von der Probe in zwischen den Messungen eingefahren werden.
   5. Stellen Annäherungsgeschwindigkeit bis 800 nm / sec und zurückzuziehen Geschwindigkeit bis 200 nm / sec. Verwenden Sie eine Annäherungsgeschwindigkeit von 400 bis 6000 nm / s in Abhängigkeit von der Doppelschichtzusammensetzung und Lipidphase zu unter ^6,16 werden.
   6. Nach dem Einstellen aller Parameter, erwerben Kraftkurven, durch Drücken der Taste "RUN" der AFM-Software.
   7. Sparen Kraftkurven als Kraft-Höhenkurven (ein Maß der z-Piezo-Bewegung). Dies berücksichtigt nicht die Biegung des Auslegers in Kontakt mit der Probe zu nehmen. Während der Datenverarbeitungsschritt, kann der AFM-Software-Korrektur für Auslegerbiege zu Kraft-Spitze und Probe-Kurven (Abbildung 1c), die richtigen Werte für die Doppelschichtdicke zu geben erhalten. Die Korrekturwerte werden in der Regel im calibr eingeation, die mit jedem Kraftkurve gespeichert wird. Berechnen Spitze und Probe durch Subtrahieren der vertikalen Ablenkung vom piezoBewegung an einem gegebenen Punkt.
      Anmerkung: Der Peak in der Annäherungskraft-Kurve (der Kraftwert sinkt, auch wenn die Auslegerbewegung noch auf dem Ansatz-Zyklus) ist die Bruchkraft der Membran, während die Differenz zwischen der Position der Spitze und der Position des Punktes wo die Kraft zu steigen beginnt wieder stellt die Dicke der Membran.
   8. Erwerben Sie mindestens 500 Kraftkurven für jede Bedingung, um gute Statistiken zu erhalten. Zeichnen Sie ein Histogramm der Werte mit Programmen wie Origin oder MatLab, und passen Sie die Histogramme zu einer Gauß-Verteilung, um die Spitze und Breite der Verteilung zu erhalten.

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Ergebnisse

Unterstützte Lipid-Doppelschichten von DOPC zusammengesetzt: SM: Chol (2: 2: 1) wurden in AFM abgebildet (Abbildung 2 AC). Aufgrund der Lipidzusammensetzung wurden SM / Chol reiche L _o und DOPC reiche L _d Phasen beobachtet. Das Höhenprofil der AFM-Bildgebung kann wichtige Informationen über die Membranstruktur zu schaffen. Indem man die Höhenprofils kann die Dicke der Doppelschicht in Anwesenheit von Defekten in der Membran (2B), oder die Differenz in der Höhe...

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Diskussion

SLBs composed of DOPC:SM:Chol (2:2:1) were formed on mica after vesicle adsorption and rupture induced by calcium chloride. This lipid composition separated into L_d and L_o phases. The L_o phase is enriched in sphingomyelin and cholesterol and is less fluid/more viscous (Figure 1A) than the L_d phase¹¹. The separation of L_o from L_d phase manifests as circular structures elevated above the surrounding (Figure 1B, C)...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
[header]
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200