Einfache und Computergestützte Riechtests für Mäuse

Zusammenfassung

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

Zusammenfassung

Der Geruchssinn ist stark zwischen den Arten konserviert und ist für die Fortpflanzung und das Überleben notwendig.

Beim Menschen ist olfaction auch einer der Sinne, die mit der Alterung betroffen ist und ist ein starker Prädiktor für neurodegenerative Erkrankungen. Somit wird olfaction Testen als nicht-invasives diagnostisches Verfahren zu neurologischen Defiziten frühzeitig detektieren. Um die Mechanismen olfaktorischen Netzwerk Anfälligkeit zugrunde zu verstehen, hat Geruchsforschung in Nagetieren Dynamik in den letzten zehn Jahren gewonnen.

Hier präsentieren wir eine sehr einfache, Zeit effiziente und reproduzierbare Geruchstestverfahren der angeborenen Geruchswahrnehmung und Sensitivität in Mäusen ohne die Notwendigkeit einer vorherigen Nahrung oder Wasser Beschränkung. Die Tests werden in einer vertrauten Umgebung zu den Mäusen durchgeführt, erfordern nur die Düfte und ein 2 min-Sitzung von Geruchsbelastung. Die Analyse wird durchgeführt, Post-hoc, mit computergestützten Befehlen auf ImageJ und kann deshalb sein,, Durchgeführt von Anfang bis von einem Forscher zu beenden.

Dieses Protokoll erfordert keine spezielle Hardware oder Konfiguration und wird für jedes Labor Interesse an einem Test Geruchswahrnehmung und Empfindlichkeit angezeigt.

Einleitung

Der Geruchssinn ist einer der am weitesten entwickelten und wichtigen sensorischen Funktionen bei Säugetieren. Jede Wertminderung in olfaktorischen Aktivität kann die Nahrungsaufnahme, Sozialverhalten und im schlimmsten Fall sogar das Überleben beeinflussen. Beim Menschen ist olfaktorischen Verschlechterung altersabhängig ¹ und wird als ein starker Prädiktor für neurologische Störungen ^2-6. Die Geruchsidentifizierungstest durch die University of Pennsylvania entwickelt derzeit für eine der am meisten verwendeten, nicht-invasive und quantifizierbar, Diagnosetests, die frühen neurologischen Defiziten ⁷ Bewertung und Vorhersage mit hoher Wahrscheinlichkeit das Fortschreiten der Demenz ^8,9 kann.

Die Zugänglichkeit des olfaktorischen Systems und die Bekanntheit des Geruchssinns bei Nagetieren, hat eine intensive Forschungslinie der Bewältigung der zugrunde liegenden Mechanismen olfaktorische Funktionen ¹⁰ ausgelöst. Wir haben zuvor gezeigt, dass der Verlust in Abhängigkeit von der Signal receptoder Notch1 wirkt Geruchsvermeidung ^11. In diesem Protokoll verwenden wir Mäuse, denen die Signalisierung Liganden, Jagged1, in Neuronen oder Gliazellen zu Riechleistung zu untersuchen.

Innate Geruchssinn wird durch drei Parameter wie Wahrnehmung, Unterscheidung zwischen Gerüchen und Geruchsempfindlichkeit ⁴ definiert. Olfaktorische Tests in Nagetieren können in einer Vielzahl von Wegen durchgeführt werden, und einige Verhaltensstudien nutzen Olfaktometer, die den Geruch des Tieres an einer bestimmten Dampfkonzentrationen und in einem genauen Zeitplan ¹² liefern ^{- 14.} Dennoch ist dies Instrumentierung teuer und kann nur in spezialisierten Einrichtungen zur Verfügung stehen. In unserer Arbeit stellen wir eine einfache, schnelle und reproduzierbare Geruchstestprotokoll, das unter Verwendung von flüchtigen Duftstoffe durchgeführt wird. Die Tests beschriebene Maßnahme Wahrnehmung auf ein Lockstoff oder einer abstoßenden Geruch und die Unterscheidung zwischen dem Duft und Wasser ^11,15,16 bewerten. Unter Verwendung der gleichen Einrichtung, wE kann auch die Empfindlichkeit auf einen Geruchs bei verschiedenen Konzentrationen ^16,17 messen. Die Post-hoc-computergestützte Videoverarbeitung, inspiriert von der Arbeit der Seite und Kollegen ^18, bietet Ergebnisse ohne die Notwendigkeit der experimentellen Blendung und damit für eine einzelne Person für die Durchführung des gesamten Experiments.

Dieses Protokoll dient, einen Ausgangspunkt für die Untersuchung olfaktorische Verhalten bei Mäusen bereitzustellen.

Protokoll

Alle tierischen Verfahren sind in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie 2010/63 / EU über den Schutz von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet werden und werden von der lokalen Animal Care Committee (Kanton Freiburg, Schweiz) genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Versuchstiere
   1. Führen Sie Experimente an erwachsenen männlichen Wildtyp und transgenen Mäusen (C57BL / 6 Hintergrund) von 3-5 Monaten. Die drei Gruppen von Mäusen entsprechen Wildtyp-Wurfgeschwister-Kontrollen (Gruppe A, Jagged1 flox / flox ¹⁹⁾ und zwei bedingte KO Mauslinien (Gruppe B, und C Jagged1ncKO, Jagged1gcKO).
   2. Hausmäuse unter Standardlaborbedingungen in einem belüfteten Raum mit einer 12 Stunden kontrolliert hell / dunkel-Zyklus und bieten Nahrung und Wasser ad libitum.

2. Versuchsaufbau

1. Experimental-Arena
   1. Für die experimentelle Arena, mit einem sauberen sterilisiert Maus Käfig (36 cm Länge x 20,5 cm Breite x 13.5 cm Höhe) (Abbildung 1A).
   2. Ordnen Sie jedem der Maus auf ein Nummern Käfig mit frischer Bettwäsche, 3 cm hoch. Wenn Käfige wieder verwendet werden, wie in der Geruchsempfindlichkeit Test, die folgenden Maßnahmen, um Kreuzkontaminationen zwischen Gerüchen und Mäusen zu vermeiden.
      1. Markieren Sie die Wasserseite.
      2. Reinigen der schmalere Wände der Käfige mit zwei Tissue-Papiere mit 70% Ethanol, eine für jede Seite besprüht.
      3. Stapeln sich Käfige nach dem Genotyp der Mäuse und die temporäre Speicherung unter einer laminaren Haube.
2. Kamera
   1. Montieren einer Kamera auf einem Dreibeinstativ angefertigt, mit dem Ziel bei 58 cm von der Unterseite des Käfigs (1A). Fixieren Sie die Position des Stativs und des Käfigs und begrenzen mit Markierungen, damit für die Kamera auf der Oberseite des Käfigs zentriert werden.
   2. Nehmen Sie Videos auf 320 Pixel x 240 Pixel, 15,08 Bilder pro Sekunde als MOV-Dateien.
3. Gerüche
   1. Resuspendieren scents, wenn angegeben ist, in dem Lösungsmittel, in dem sie löslich sind.
   2. Für die Präferenztest Verwendung Erdnussbutter. Resuspendieren Erdnussbutter in Erdnussöl (10% w / v).
   3. Zur Vermeidung Test Verwendung reiner 2-Methyl (2-MB) Säure (98%).
   4. Für den Empfindlichkeitstest, verwenden weiblichen Urin aus der gleichen Maus Kolonie und Hintergrund (C57BL / 6).
      1. Zur Bequemlichkeit Sammeln des Urins 1-2 Tage vor dem Geruchstest. Zurückhalten, halten Sie die Maus unter der Haube mit dem Bauch über dem Käfiggitter. Unter dem Käfiggitter eine Plastikpetrischale, um die Tropfen Urin zu sammeln.
      2. Sammeln Sie den Urin von jeder Frau in einem 1,5-ml-Röhrchen und mischen Sie alle Urinproben für die Variabilität zwischen den Tieren zu normalisieren. Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung.
      3. Am Tag des Experiments wurden auftauen Urin und auszuführen 4 Verdünnungen in bidestilliertem Wasser bei einem Verdünnungsfaktor von 10 (1:10, 1: 100, 1: 1.000, 1: 10.000).

3. Olfactory Testing

Hinweis: In diesem Protokoll Gerüche bewusst gewählt worden, die als starke Lockstoffe (Erdnussbutter und weiblichen Urin) oder starke abstoßende (2-MB-Säure) ¹⁵ wahrgenommen werden. Es ist wichtig, vor Durchführung der Präferenz und Empfindlichkeitstests, um angenehme Gerüche zu vermeiden Test, um die Möglichkeit einer Störung des Geruchsverhalten zu beseitigen. Jedoch für die der Einfachheit halber in diesem Papier Präferenz und Vermeidungstest werden beide unter der Wahrnehmungstest beschrieben. Jeder Verhaltens Sitzung beginnt mit einer Gewöhnungsphase.

1. Gewöhnungsphase
   1. Legen Sie das Tier in den Käfig sauber zugeordnet und lassen Sie es für 5 min (1B) zu erkunden. Da die Umgebung der Versuchskäfig ist dem Heimkäfig ist dies kurz genug ist, um die Gewöhnung ermöglichen.
   2. Wenn die Empfindlichkeit Test wird in einem Tag abgeschlossen, führen Gewöhnung nur einmal vor dem application der höchsten verdünnter Geruch. Wenn die Empfindlichkeit Test wird an verschiedenen Tagen durchgeführt, an jedem Tag eine Gewöhnungsphase an einem neuen sauberen Käfig benötigt wird.
2. Wahrnehmungstest
   1. Nach Gewöhnung, aktivieren Sie die Kamera und sofort pipettieren 60 ul der angenehmen Duft (Erdnussbutter) und 60 & mgr; l der neutralen Duft (Leitungswasser) auf die gegenüberliegende Wände des Käfigs bei etwa 10 cm vom Boden (1C).
   2. Lassen Sie die Maus erkunden Sie die Gerüche für 2 min (1D). Danach schalten Sie die Kamera aus.
   3. An diesem Punkt, fahren Sie mit der nächsten Maus ausgehend von der Gewöhnungsphase. Führen die Vermeidungstest genau auf die gleiche Weise, indem 60 ul des Repellents Geruch (2-MB-Säure) und 60 ul Wasser.
3. Empfindlichkeitstest
   1. Bewerten Sie die Attraktion Schwelle von männlichen Mäusen zu steigenden Konzentrationen von weiblichen Urin in der folgenden Reihenfolge: 1: 10.000; 1: 1000; 1: 100; 1:10 und pure Urin.
   2. Nach Gewöhnung, aussetzen jede Maus, um die höchste Verdünnung vom Experimentator pipettiert, wie zuvor in 3.2.1 beschrieben.
   3. Notieren Sie sich die Erkundungsverhalten von Urin im Vergleich zu Wasser, in einem 2 Minuten Zeitrahmen auf einer Videokamera. Nachdem alle Mäuse Kohorten für die höchste Verdünnung (1: 10000) getestet, aussetzen, um eine höhere Konzentration von Urin, wie oben angegeben.

4. Post-hoc Datenanalyse

Hinweis: Alle beschriebenen Verhaltenstests werden im Anschluss an die Datenanalyse Anweisungen verarbeitet post hoc.

1. Öffnen Sie MOV-Dateien in ImageJ für Windows-Systeme
   1. Installieren Sie Quicktime für Java unter Verwendung der benutzerdefinierten Einstellungen aus http://www.apple.com/quicktime/download.
   2. Installieren Sie den Quick Time-Plugin aus dem ImageJ Website (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
   3. Importieren Sie die QTJava.zip (C: Programme Quicktime QTSystem) in die Bibliothek extensIon von ImageJ (.ImageJ jre lib ext).
   4. Kopieren Sie auch die QTJava.zip im Ordner Plugins und benennen Sie sie als QTJava.jar.
   5. Installieren Sie die sechs Skripte im Ordner Macros angebracht (ImageJ plugins Macros).
   6. Öffnen ImageJ und zu kompilieren und die Quick Time-Plugin, danach enge ImageJ.
   7. Öffnen Sie erneut ImageJ und öffnen Sie die MOV-Datei mit Datei> Importieren> mit Quick Time.
2. Video Adjustment
   1. Sobald die Videodatei in ImageJ geöffnet wird, schneiden die Video um einen konstanten 2 min Erforschung vom Zeitpunkt der Experimentator die Riechstoffe in den Käfig (T0) pipettiert erhalten. Identifizieren Sie den Rahmen entsprechend der T0 und entfernen Sie die vorhergehenden Frames mit Schritten von 1 (ImageJ Bild Stacks ToolsSlice Entferner). Verwenden Sie den gleichen Befehl, um alle Bilder Überschreitung der 2 min Exploration löschen.
   2. Stellen Sie sicher, dass der Käfig zentriert und, wenn erforderlich, mit Bild> Transformieren> Drehen Befehl, um ihn auszurichten.
3. Video Verarbeitung
   Hinweis: Video Verarbeitung ist vollständig computergestützte und verwendet diese Begleitpapier Makros Befehle.
   1. Um die Gegend auf den Käfig eines 127 Pixel x 218 Pixel Größe beschränken führen Sie den Schritt 1 Makro aus dem Plugin> Makros> Ausführen-Befehl. Bewegen Sie den festen Rechteck über dem Käfig (Abbildung 2, Schritt 1).
   2. Schneiden Sie das Gebiet des Käfigs auf dem Gebiet von Interesse (ROI) mit dem Schritt 2 Makro (Abbildung 2, Schritt 2).
   3. Verwenden Sie den Schritt 3, um den Makro-Maus Bild aus dem Hintergrund durch die Zuweisung einer Schwellenwertsignal, Entfernen von Flecken und das Filtern der Signalvarianz zu extrahieren. Die Ausgangswerte in der Z-Achse Grundstück zeigen die mittleren Grauwerte, entsprechend der Intensität des Maus-Schatten, die innerhalb der ROI des "Wasserkammer" in der 2 min Exploration. Kopieren Sie die Ergebnisse in ein Arbeitsblatt mit dem Namen nach der ROI in einem Spreadsheet-Datei (Abbildung 2, Schritt 3).
   4. Verwenden Sie den Schritt 4 Makroextrahieren Sie die mittleren Grauwerte von der Maus in die ROI "Geruchskammer". Kopieren Sie die Ergebnisse in ein Arbeitsblatt mit dem Namen nach der ROI in der gleichen Tabellendatei wie in 4.3.3 (Abbildung 2, Schritt 4).
   5. Um die Analyse der Mausbewegung in der ROI "Wasser Umfang" weiter einschränken benutzen Sie Schritt 5 Makro. Kopieren Sie das Ergebnis auf dem Arbeitsblatt mit dem Namen nach der ROI in der gleichen Tabellendatei wie in 4.3.3 (Abbildung 2, Schritt 5).
   6. Um die Analyse der Mausbewegung in der ROI "Geruch Umfang" zu beschränken verwenden Sie den Schritt 6 Makro. Kopieren Sie das Ergebnis auf dem Arbeitsblatt mit dem Namen nach der ROI-Kalkulationstabellendatei wie in 4.3.3 (Abbildung 2, Schritt 6).
   7. Alle Videos verarbeiten und überprüfen Sie die Konsistenz in der Anzahl der Bilder pro Tier. Hier Aufzeichnung aller Tiere für 1.810 Frames entsprechend einem 2 min Exploration Sitzung.
   8. Für jedes Tier und für jede ROI Art Rahmen mit mittleren Grau vaLues größer als 0 Teilen Sie die Anzahl der Frames, die durch die Werte auf 1 Sekunde entspricht und erhalten die Sekunden in jedem ROI verbracht.

5. Statistische Analyse

1. Für jeden Test überprüfen Homogenität der Varianz innerhalb der Gruppen / Genotypen von Bartlett-Test unter Verwendung des verfügbaren Formel auf http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
2. In der Anziehung und Vermeidungstest, führen Vergleiche durch zwischen die Zeiten verbrachte mit Wasser gegen Geruch innerhalb einer Gruppe unter Verwendung eines ungerichteten Student-t-Test unter der Annahme gleicher oder ungleicher Varianzen Abhängigkeit von den Ergebnissen der Bartlett-Test. Vergleichen Sie das mal mit den Gerüchen von der Zeit mit Wasser verbracht zwischen den Genotypen von Einweg-ANOVA mit Bonferroni post-hoc-Test abgezogen verbracht.
3. In der Sensitivitätstest analysieren die Vergleiche der Zeit mit dem Geruch von der Zeit abgezogen verbrachte mit wate verbrachtr zwischen den Gruppen bei einer spezifischen Verdünnungen des Urins durch Einweg-ANOVA mit Bonferroni post-hoc-Test. Vergleichen Sie die Empfindlichkeit zwischen den Gruppen auf die wachsende Geruchskonzentrationen von 2-Wege-ANOVA mit Wiederholungen mit Bonferroni post-hoc-Test.
4. Interaktion zwischen Genotypen und Behandlungen in der Anziehung und Vermeidungstest werden durch 2-Wege-ANOVA mit Bonferroni post-hoc-Test untersucht.

Ergebnisse

Die Wahrnehmung Test misst die Anziehungskraft auf Erdnussbutter und Vermeidung zu 2-MB-Säure. Drei Gruppen von Mäusen getestet und die Zeit, in der "Geruch Perimeter" verbracht werden quantifiziert im Vergleich zu Wasser. In der Präferenz-Test, in der Kontrollgruppe A zeigt signifikante Bevorzugung der Geruch im Vergleich zu Wasser (t ₈ = 2,52, p <0,05). Auf der anderen Seite, wird die Gruppe B keine signifikante Anziehungskraft auf Erdnussbutter zeigen und verbringt mehr Zeit mit Wasser (t <...

Diskussion

Die in diesem Protokoll vorgeschlagenen Tests erlauben, verschiedene Aspekte der angeborenen olfaktorische Verhalten bei Mäusen zu bewerten: Wahrnehmung von Gerüchen, die Unterscheidung zwischen Gerüche gegen Wasser und Empfindlichkeit gegenüber Gerüchen. Dieses Protokoll kann auf jeden Geruch nach den Vorlieben und Vermeidung Maßstab zuvor gezeigt ¹⁵ aufgebracht werden. Da das Protokoll auf Erkundungstätigkeit auf der Basis ist es wichtig, dass Mäuse, keine motorischen Beeinträchtigung oder Angst, d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Italplast (Italy)	1144B	36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height
Chipped wood bedding	Abedd (Austria)	LTE E-001	3 cm high
Peanut butter	Migros (Switzerland)	NA	1:10
2-Methylbutyric	Sigma Aldrich (Switzerland)	W269514	Pure
Female urine from fertile females of same mouse strain	NA	NA	Dilution series
Camera	Olympus (US)	Camedia C-8080	MOV files
Quicktime for Java (Windows)	Apple (USA)	NA	video plugin for visualizing MOV files
ImageJ for Windows	NIH (USA)	NA	Video Processing/Analysis