Phasendiagramm Charakterisierung mit Magnetic Beads als flüssige Träger

Zusammenfassung

Here, we present a protocol to investigate multi-component phase diagrams using externally controlled magnetic beads as liquid carriers in a lab-in-tube approach. This approach can aid in applications that seek to gather further information on phase change in complex liquid systems.

Zusammenfassung

Magnetischen Kügelchen, die mit ~ mittlere Durchmesser 1,9 um wurden verwendet, um Mikroliter-Volumina von Flüssigkeiten zwischen angrenzenden Flüssigkeitssegmente mit einem Rohr für den Zweck der Untersuchung Phasenänderung dieser Flüssigkeitssegmente zu transportieren. Die magnetischen Perlen wurden von außen gesteuert unter Verwendung eines Magneten, so dass für die Kugeln, um die Luftklappe zwischen den benachbarten Flüssigkeitssegmente überbrücken. Eine hydrophobe Beschichtung wurde auf die Innenfläche des Rohres aufgebracht, um die Trennung zwischen den beiden Flüssigkeitssegmente zu verbessern. Das angelegte Magnetfeld gebildeten Cluster ein Aggregat von magnetischen Kügelchen, die Erfassung einer bestimmten Flüssigkeitsmenge in dem Cluster, die als Übertrag Volumen bezeichnet wird. Ein Fluoreszenzfarbstoff wurde in einem Flüssigkeitssegment gegeben, gefolgt von einer Reihe von Flüssigkeitsübertragungen, die dann verändert die Fluoreszenzintensität in den benachbarten Flüssigkeitssegment. Auf der Grundlage der numerischen Analyse der gemessenen Fluoreszenzintensität Wechsel hat sich die Übertragsvolumen pro Masse von magnetischen Kügelchen gefunden worden,auf ~ 2-3 & mgr; l / mg ist. Diese kleine Menge an Flüssigkeit für die Verwendung von vergleichsweise kleinen Flüssigkeitssegmente von ein paar hundert Mikroliter erlaubt, die Verbesserung der Durchführbarkeit der Vorrichtung für ein Labor-in-Rohr-Ansatz. Diese Technik des Aufbringens kleine Zusammensetzungsänderung in einem Flüssigkeitsvolumen wurde für die Analyse der binären Phasendiagramm zwischen Wasser und dem Tensid C12E5 (Pentaethylenglycol Monododecylether), was zu schnelleren Analysen mit kleineren Probenvolumina als herkömmliche Verfahren aufgetragen.

Einleitung

Magnetischen Kügelchen (MB) in der Größenordnung von 1 Mikrometer im Durchmesser haben, in mikrofluidischen-basierten Anwendungen verwendet worden, ^1,2 recht oft, insbesondere für biomedizinische Vorrichtungen. In diesen Vorrichtungen sind MBs Funktionen wie Zell- und Nukleinsäure Trennung, Kontrastmittel und Medikamentenausgabe angeboten, um nur einige zu nennen. Die Kombination von externen (Magnetfeld) Steuerung und tröpfchenbasierten Mikrofluidik hat ³ Kontrolle von Immuntests unter Verwendung von kleinen Mengen (<100 nl) aktiviert. MBs haben auch gezeigt, Versprechen, wenn für die ^{Flüssigkeitshandhabung} 4 verwendet. Dieser Ansatz nutzt die MBs an Biomoleküle zwischen Flüssigkeitssegmente innerhalb eines Rohres durch ein Luftventil getrennt transportieren. Dieses Verfahren ist nicht so stark wie andere komplexere Lab-on-Chip-Bausteine ​​in der Vergangenheit gesehen, aber es ist wesentlich einfacher und erfordert bieten die Möglichkeit der Handhabung Mikroliter-Größe Flüssigkeitsvolumina. Ein ähnlicher Ansatz wurde kürzlich von Haselton Gruppe berichtet ^{5 und} biomedizinische AnwendungAssays.

Einer der wichtigste Aspekt dieser Vorrichtung ist die Flüssigkeit Segmenttrennung durch die Oberflächenspannung gesteuerten Luftventil angeboten. Mikrolitervolumina von Flüssigkeit zu MBs befestigt werden durch diesen Luftspalt zwischen Flüssigkeitssegmente unter Verwendung eines extern angelegten magnetischen Feld transportiert. Mikropartikel-MBs (von ~ 0,4-7 & mgr; m im Durchmesser mit einem Mittelwert von 1,9 um) unter der Wirkung des äußeren Magnetfeldes erzeugen eine mikroporöse Cluster, die in Flüssigkeitsfallen. Die Stärke dieses Flüssigkeitseinschluss ist ausreichend, um die Kräfte der Oberflächenspannung beim Transport der MBs von einem Reservoir zu dem nächsten zu widerstehen. Typischerweise ist dieser Effekt unerwünscht, da die meisten Ansätze soll nur den Transport bestimmter Moleküle (wie Biomarker) innerhalb der Flüssigkeiten ⁶ enthalten. Wie jedoch in unserer Arbeit zu sehen ist, kann dieser Effekt verwendet werden, um eine positive Aspekt der Vorrichtung wird.

Wir haben dieses "lab-in-Rohr verwendet"-Ansatz, Der schematisch in Figur 1 gezeigt, für die Analyse von Phasendiagrammen in binärer Materialsystemen. Das Tensid C12E5 wurde als Schwerpunkt der Charakterisierung ausgewählt worden ist, wie es ist weit verbreitet in industriellen Anwendungen wie Pharmazeutika, Lebensmitteln, Kosmetika, etc. Insbesondere verwendet wurde das _H 2 O / C12E5 binären System untersucht, weil es eine reiche bietet Satz von Phasen zu erkunden. Wir haben an einem spezifischen Aspekt dieser chemischen Mischung, nämlich den Übergängen zu Flüssigkristallphasen unter bestimmten Konzentrationen ^7-9 konzentriert. Dieser Übergang wird leicht in unserer Vorrichtung durch Einbau Polarisatoren in der optischen Mikroskopie Studien, um die Phasengrenzen markieren beobachtet.

In der Lage, Phasendiagramme Karte ist ein sehr wichtiger Bereich der Studie, um die Kinetik mit Phasenübergang ¹⁰ zu verstehen. Die Fähigkeit, die Wechselwirkung der Tenside mit Lösungsmitteln eine genau bestimmennd andere Komponenten entscheidend ist aufgrund ihrer Komplexität und viele unterschiedliche Phasen ^11. Viele andere Techniken wurden zuvor verwendet worden, um Phasenwechsel charakterisieren. Der herkömmliche Ansatz beinhaltet Herstellung vieler Proben, die jeweils aus unterschiedlichen Konzentrationen und es ihnen ermöglicht, zu äquilibrieren, was lange Laufzeiten und hohe Menge an Probenvolumina erfordert. Dann werden die Proben in der Regel durch optische Methoden wie diffusive Grenzverkehr (DIT), die hochauflösende solcher Tensidzusammensetzungen ^12,13 Angebote analysiert. Ähnlich wie bei der Methode, die wir verwendet haben, verwendet das DIT-Methode polarisiertes Licht für Bild in verschiedenen Phasengrenzen.

Protokoll

1. Herstellung der einmaligen Gebrauch Materialien im Geräte-

1. Herstellung von Rohr
   1. Schneiden Sie die Rohrleitung in 15 cm-Segmente. Tubing hat 1,6 mm Innendurchmesser und 3,2 mm Außendurchmesser.
   2. Hang Rohrsegmente vertikal mit Klebeband. Zeigen Papiertuch unter Rohren, um das überschüssige Fluorpolymerlösung zu sammeln.
   3. Injizieren 100 ul Fluorpolymerlösung in die obere Öffnung jedes Rohrsegment mit Spritze, so dass er in Kontakt mit gesamten Umfang an der Innenwand kommen.
   4. Erlauben Rohrsegmente, um im Platz für 1 h hängen, um überschüssige Menge an Fluorpolymerlösung zu entfernen.
   5. Reinigen Sie jede Fluorpolymerlösung von Unterseite der Röhre, die nicht tropft hat aus. Schlauch entfernen hängenden Position und entsorgen Papierhandtücher.
   6. Ort Rohrsegmente in den Ofen bei 100 ° C für 1 Stunde, um die Fluorpolymerbeschichtungsschicht zu tempern.
   7. Entfernen Rohrsegmente aus dem Ofen. Verwenden einer Pinzette, als Rohr seggen wird heiß.
2. Herstellung von verdünnten magnetischen Bead-Lösung
   1. Berechnen Magnetperlenkonzentration, um die gewünschte Übertragsvolumen zu erreichen, wie durch die Beziehung zwischen der Übertrag Volumen und MB Masse in 2 gezeigt bestimmt.
      Anmerkung: Die ursprüngliche MB Lösung 1 g MBs in 50 ml Lösung. Unter Berücksichtigung einer Testkammervolumen von 20 ul verdünnte ursprüngliche MB Lösung mit destilliertem Wasser auf ein Verhältnis von 6: 4 (MB Lösung: Wasser), um einen Übertrag Volumen von ~ 0,4 & mgr; l zu erhalten. Passen Verdünnungsverhältnis bei verschiedenen Übertragsvolumen erwünscht ist.
   2. Legen Sie ein 20 ml Probenfläschchen auf eine Mikrowaage. Null das Gleichgewicht.
   3. Man schüttelt die magnetischen Kügelchen Lösungsbehälter, dann zurückzutreten 0,6 ml unter Verwendung einer Mikropipette.
   4. Verzichten pipettierten Lösung in das Probengefäß auf Unruh.
   5. Verzichtet werden 0,4 ml destilliertem Wasser in die Probenampulle.
3. Fluoreszenzfarbstoff lBeläge auf LCD Vorbereitung
   1. Löse 2 Gew.% Des Farbstoffes in deionisiertem Wasser durch Verwirbeln der Lösung für 1 min.

2. Vorbereitung der Versuchsaufbau für Fluoreszenzexperimente

1. Herstellung der Schlauchvorrichtung.
   1. Legen Sie eine Luer-Lock-Anschluss an einem Ende des Schlauchs.
   2. Das Röhrchen wird in einem Luer-Lock-Spritze, die eine 3 ml Volumen und 0,1 ml Graduierung hat.
   3. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe und stellen Sie die Vorschubgeschwindigkeit bei 2 ml / h.
   4. Zum genauen Einführen von Flüssigkeiten in den Schlauch, zu verwenden, die Spritzenpumpe, um die Lösung, welche die magnetischen Kügelchen und Fluoreszenzfarbstoff zurückzuziehen.
   5. Legen Sie 20 ul magnetischen Kügelchen-Lösung in das Rohr mit Spritzenpumpe Rückzug. Diese Flüssigkeit Segments wird als die Testkammer (Testkammervolumen je nach Experiment variieren) bezeichnet. Mischen Sie den Behälter mit Magnet-Bead-Lösung für 1 min und dann von Hand rühren während der Rückzug-Zyklus, um eine einheitliche MB Dispersionen bilden.
   6. Nach der Testkammer Flüssigkeit Einsetzen abgeschlossen ist, zurückziehen 6 l Luft in den Schlauch. Dieses Luftvolumen bildet später ein Ventil zwischen den beiden Flüssigkeitssegmente.
   7. Nach dem Luftspalt Einsetzen abgeschlossen ist, beginnen Rückzug 180 ul der Flüssigkeit mit Fluoreszenzfarbstoff. Dieser Flüssigkeitssegment wird als Reservoir bezeichnet. Reservoirvolumen kann je nach Experiment variieren. Größere Behältervolumen ist vorteilhaft, die Änderung der Farbstoffkonzentration zu minimieren.
   8. Platzieren eines zweiten weiblichen Luer-Lock-Stecker an dem anderen Ende des Rohres.
   9. Entfernen Sie die Rohrvorrichtung aus der Spritze.
   10. Zeigen Luer-Lock-Kappen an beiden Enden des Geräts.
2. Optics Setup für Fluoreszenzexperimente
   1. Schalten Sie alle an das inverse Mikroskop angeschlossenen Komponenten.
   2. Schalten Sie den Computer und öffnen Sie das Mikroskop Imaging-Software.

"> 3. Versuchsdurchführung für Fluoreszenzexperimente

1. Nehmen anfängliche Fluoreszenzintensität Messung der Testkammer und das Reservoir mit dem inversen Mikroskop. Bei der Analyse der Fluoreszenz der Probe, zu gewährleisten, dass der Fokus in der Mittelstellung (in beiden Richtungen x und y) des Flüssigkeitssegment in dem Rohr. Nehmen Sie Messungen im Datentabellenkalkulation.
2. Zeigen Gerät über Oberseite des Würfels Magneten, so dass die magnetischen Beads alle zu trennen, um einen Bereich in der Testkammer. Übertragen Sie die Perlen in den Vorratsbehälter, indem Sie das Gerät über Oberseite des Magneten (~ 10 sec). Die 1-Zoll-Neodym-Würfel-Magnet ist Grad N48 mit einer Zugkraft von 45,6 kg.
3. Sobald Magnetkügelchen Cluster wird durch den Luftspalt und in das Reservoir überführt, schüttelt die magnetischen Kügelchen indem die Vorrichtung über die Oberseite des Magneten und sich dreht, um die Flüssigkeit, die innerhalb des Clusters eingeschlossen zugeben. Weiterhin Rühren der magnetischen Beads bis zur Homogenisierung des Reservoirs wurdeabgeschlossen (~ 30-45 sec).
4. Setzvorrichtung über die Oberseite des Magneten derart, dass die magnetischen Kügelchen in dem Reservoir alle entmischen einem Bereich. Übertragen Sie die Magnetic-Bead-Cluster zurück in die Testkammer.
5. Sobald der Cluster die Testkammer erreicht, rühren die magnetischen Kügelchen, indem das Gerät über Oberseite des Magneten und Drehen, um die eingeschlossenen fluoreszierenden Flüssigkeit innerhalb lösen. Weiterhin Rühren der magnetischen Beads bis zur Homogenisierung der Testkammer abgeschlossen ist (~ 30-45 sec).
6. Nehmen Fluoreszenzintensitätsmessungen sowohl der Testkammer und das Reservoir mit dem inversen Mikroskop. Nehmen Sie Messungen im Datentabellenkalkulation.
7. Schritte 3,2-3,6 werden wiederholt, bis die beiden flüssigen Segmente konvergieren ähnliche Fluoreszenzintensitäten (~ 100 Zyklen).

4. Numerische Analysis von Fluoreszenzdaten

1. Mit dem Fluoreszenzintensitätsdaten in eine Tabelle gespeichert ist, durchführen numerische Analyse mit MATLAB.
2. Derive Gleichungen, um einen theoretischen Wert der Fluoreszenzintensität in sowohl dem Reservoir und Testkammer zu berechnen. Integrieren Sie die folgenden Gleichungen in eine MATLAB Skript-Datei:
   wobei I die Fluoreszenzintensität (AU) ist, V Volumen (ul), n ist die Anzahl der Übertragungen, R ist der Behälter, T ist die Testkammer und C Verschleppung.
3. Mit MATLAB erzeugen Grundstücke und zu analysieren, um die Übertragsvolumen für alle Versuche zu bestimmen. Verwenden Sie diese Daten, um Abbildung 2 zu produzieren.

5. Vorbereitung der Versuchsaufbau zur Surfactant Experimente

1. Herstellung der Schlauchvorrichtung.
   1. Setzen Sie einen weiblichen Luer-Lock auf ein Ende des Schlauchs.
   2. Das Röhrchen wird in einem Luer-Lock-Spritze.
   3. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe und stellen Sie die Vorschubgeschwindigkeit bei 2 ml / h.
   4. Zum genauen Einführen von Flüssigkeiten in den Schlauch, zu verwenden, die Spritzenpumpe, um die Lösung, welche die magnetischen Kügelchen und su zurückzuziehenrfactant.
   5. Legen Sie 20 ul magnetischen Kügelchen-Lösung in das Rohr mit Spritzenpumpe Rückzug. Diese Flüssigkeit Segments wird als die Testkammer (Testkammervolumen je nach Experiment variieren) bezeichnet. Man schüttelt den Behälter mit Magnet-Bead-Lösung mit der Hand während der Widerrufszyklus zu einheitlichen MB Dispersionen bilden.
   6. Nach der Testkammer Flüssigkeit Einsetzen abgeschlossen ist, zurückziehen 6 l Luft in den Schlauch. Das Luftvolumen wird später als Luftspalt bezeichnet.
   7. Nach dem Luftspalt Einsetzen abgeschlossen ist, beginnen Rückzug 180 ul des reinen C12E5 Tensid. Dies wird später als Reservoir bezeichnet.
2. Optics Setup für Tensid-Experimente.
   1. Bewegen Spritzenpumpe mit Schlauchvorrichtung, so dass die Testkammer mit Magnetkügelchen ist im Fokus mit dem Stereo-Mikroskop.
   2. Legen Sie ein Blatt Polarisatorfilm oben auf einem LED-Lichtquelle. Schieben Sie die LED-Lichtquelle unter dem Rohr befestigtDie Spritzenpumpe.
   3. Befestigen weiteres Polarisatorfilm zum Objektiv des Stereomikroskops mit Klebeband. Achten Sie darauf, dass die beiden Polarisationsfolien haben eine 90-Grad zueinander versetzt.
   4. Montieren Sie einen CCD (Charge Coupled Device) Kamera mit dem Stereomikroskop. Schließen Sie die Kamera an den Computer an und öffnen Sie die Imaging-Software.

6. Versuchsdurchführung für Surfactant Experimente

1. Legen Sie die Würfel-Magnet neben der Testkammer, während der Magnet auf einem Ständer montiert.
2. Nachdem die magnetischen Kügelchen einen Cluster bilden, beginnt das Pumpen von Flüssigkeiten in das Rohr an der Zufuhrrate von 2 ml / h, so dass die magnetischen Kügelchen Cluster aus der Testkammer bewegt wird, über den Luftspalt und in das Tensid Reservoirkammer.
3. Sobald die Magnetkügelchen-Cluster den Mittelpunkt der Vorratskammer erreicht, beenden Sie den Pump auf der Spritzenpumpe.
4. Bewegen Sie den Würfel-Magnet weg von der Röhre, so dass für magnetische Kügelchen in eine separatend verringern die Diffusion der Flüssigkeit in dem Magnetperlengruppe eingeschlossen.
5. Sehen Sie den Bildschirm, um die _H 2 O / C12E5 Mischung durchlaufen verschiedene Phasen beobachten.
6. Sobald die Diffusion und Phasenänderung der Flüssigkeit abgeschlossen ist, stellen den Magneten in seinem alten Ziels durch den Behälter, so dass die magnetischen Kügelchen zu bilden, in einem Cluster.
7. Verwendung der Spritzenpumpe, die Flüssigkeiten zurückziehen, so dass die magnetischen Kügelchen Cluster aus dem Tensid Reservoir übertragen wird, über den Luftspalt und in die H _{2 O} Prüfkammer.
8. Sobald die Magnetkügelchen-Cluster den Mittelpunkt der Testkammer erreicht, beenden Sie den Pump auf der Spritzenpumpe.
9. Bewegen Sie den Würfel-Magnet weg von der Röhre. Dies ermöglicht Magnetkügelchen zu trennen und wird dazu beitragen, die Diffusion der Flüssigkeit in dem Magnetperlengruppe eingeschlossen reduzieren.
10. Sehen Sie den Bildschirm, um die _H 2 O / C12E5 Mischung durchlaufen verschiedene Phasen beobachten.
11. Sobald die Diffusion und Phasenänderung der Flüssigkeit abgeschlossen ist, stellen den Magneten in seinem alten Ziels durch die Testkammer, so dass die magnetischen Kügelchen zu bilden, in einem Cluster.
12. Wiederholen Sie die Schritte 6,2 bis 6,11, bis die Testkammer zeigt eine Phasenänderung.

Ergebnisse

Unter Verwendung des Lab-in-Rohr-Ansatz für den Transport von ul-Volumen Flüssigkeitsmengen mit Magnetkügelchen zusammen mit MATLAB für die numerische Analyse, das durchschnittliche Liquiditätsübertrag Bände, als eine Funktion der magnetischen Kügelchen Masse, gefunden wurden (Abbildung 2). Höhere Masse von magnetischen Beads bietet eine höhere Übertragsvolumen in der Höhe von 2-3 & mgr; l / mg. Der Versuchsaufbau (Abbildung 1) wurde verwendet, um Phasenwechsel innerhalb...

Diskussion

In den meisten üblichen Techniken zur Phasendiagramm Untersuchung von mehreren Proben mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Verhältnisse müssen bereit und müssen thermodynamischen Gleichgewicht, die ein langwieriger Prozess und eine erhebliche Menge an Material führt zu erreichen. Einige Herausforderungen können durch DIT (diffusive Grenzverkehr) Methode gelöst werden unter Verwendung von Flach Kapillare und die Infrarot-Analyse-Methode, aber keiner von ihnen kann alle Herausforderungen, die mit niedrigen K...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuBead	Bioneer Inc.	TS-1010-1	Magnetic beads
C12E5 Surfactant	Sigma-Aldrich	76437
Thermo Scientific Nalgene 890	Fisher Scientific	14176178
Cube Magnet	Apex Magnets	M1CU
Polarizer Film	Edmund Optics	38-493
Teflon AF	Dupont	400s1-100-1	Fluoropolymer solution
Keyacid Red Dye	Keystone	601-001-49	Fluorescent dye
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-12	Female
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-56	Male
Syringe	Fisher Scientific	14-823-435	3 ml
Syringe Pump	Stoelting	53130
Stereo Microscope	Nikon	SMZ-2T
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U	The filter cube used had an excitation wavelength range from 540-580 nm and a dichroic mirror at 585 nm, allowing for photoemission ranging from 593-668 nm.
Balance	Denver Instruments	PI-225D
Microscope-Mounted Camera	Motic	5000