Instillation und Fixationsmethoden Nützlich in Maus Lung Cancer Research

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit ist es, einfache Methoden, die sich stark in den Aufbau und die Analyse von Mauslungen mit Lungenkrebs oder anderen Pathologien helfen werden zu beschreiben. Wir stellen 3-Protokolle, um einfach und zuverlässig durchführen Lungen Instillationen, Fixierung, und Lungenvolumenmessungen.

Zusammenfassung

Die Möglichkeit, Live-Agenten, Zellen oder Chemikalien direkt in die Lunge zu vermitteln, ohne zu verletzen oder die Tötung der Mäuse ist ein wichtiges Werkzeug bei Lungenkrebs Forschung. Zwar gibt es eine Reihe von Methoden, die veröffentlicht wurden, die zeigen, wie Mäusen Lungenfunktionsmessungen zu intubieren, gibt keine ohne potentielle Probleme für den schnellen Instillation großen Kohorten von Mäusen. In der vorliegenden Arbeit wird eine einfache und schnelle Methode beschrieben, die ein Ermittler ermöglicht die Durchführung einer solchen Instillationen in einer effizienten Weise. Das Verfahren erfordert keine besonderen Werkzeuge oder Beleuchtung erforderlich und kann mit sehr wenig Praxis erlernt werden. Es geht um Anästhesie eine Maus, einen kleinen Schnitt in den Hals, um die Luftröhre sichtbar zu machen, und dann direkt Einfügen einer intravenösen Katheter. Der kleine Einschnitt rasch mit Gewebekleber verschlossen und die Mäuse werden sich erholen gelassen. Ein erfahrener Student oder Techniker kann Instillationen mit einer durchschnittlichen Rate von 2 min / Maus zu tun. Sobald ter Krebs festgestellt, gibt es oft eine Notwendigkeit für quantitative histologische Analyse der Lungen. Pathologen traditionell in der Regel nicht die Mühe, Lunge Inflation während der Fixierung zu standardisieren und Analysen sind oft auf einem Punktesystem, das sehr subjektiv sein kann, basiert. Während dies einmal für grobe Schätzung der Größe eines Lungentumors ausreichend ausreichend sein, jedes richtige stereo Quantifizierung von Lungenstruktur oder Zellen erfordert eine reproduzierbare Fixierung und der nachfolgenden Lungenvolumenmessung. Hier beschreiben wir einfache zuverlässige Verfahren sowohl für die Festsetzung der Lunge unter Druck und dann die genaue Messung der Festlungenvolumen. Die einzige Voraussetzung ist eine Laborwaage, die genau über einen Bereich von 1 mg-300 g ist. Die hier so vorgestellt Verfahren könnten die Fähigkeit, in den Mäusen zu erstellen, zu behandeln und zu analysieren Lungenkrebs deutlich verbessern.

Einleitung

Für eine Reihe von Gründen, Lungenkrebs, nicht sehr stark bei der Maus untersucht. Ein Grund dafür ist, dass der Zugang zu der Lunge in vivo ist sehr schwierig, und die quantitative Analyse von festen Lungen ist nicht allgemein üblich ist. Die in diesem Dokument beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um hier Abhilfe zu schaffen. Die Ziele hier sind einfache Methoden, die sich stark in den Aufbau und die Analyse von Mauslungen mit Lungenkrebs oder anderen Pathologien helfen werden zu beschreiben. Während keiner dieser Ansätze völlig neu sind, haben sie nicht gemeinsam als eigenständiges Verfahren in der vereinfachten Weise, wie hier beschrieben dargestellt worden.

Es wurden eine Reihe von Handschriften, die Verfahren zur Intubation der Mauslunge in erster Linie für den Zweck dieser Wiederholungslungenfunktion oder bronchoalveoläre Lavage in einzelnen Mäusen in Langzeitstudien beschrieben wurden. Seit diesem ursprünglichen Papier, gab es mehrere andere Papiere, die verschiedenen Ansätze zur mous beschrieben haben,e Intubation ^{1 -9.} Während alle diese Verfahren erfolgreich verwendet werden können, erfordern sie in der Regel erhebliche Ausbildung und sind oft nicht ohne eine nichttriviale Ausfallrate. Darüber hinaus, um die Durchführung Lungenfunktionsmessungen, muss die Kanüle in die Luftröhre fest genug passen, so dass es keine Luftleckage. Allerdings ist eine weitere praktische Verwendung zur Intubation gegenüber spezifischen Agenzien (Krebszellen oder andere Beleidigungen) oder therapeutische Wirkstoffe direkt in die Lunge zu liefern. Ein solches Verfahren erfordert keine eng anliegende Kanüle noch eine anspruchsvolle Lungenfunktionsgeräten. Das neuartige Merkmal dieser hier gezeigten Verfahren eine kleinere chirurgische Prozedur, die die Intubation ermöglicht, ohne die Möglichkeit der Kanüle in die Speiseröhre. Dieser einfache Ansatz ermöglicht erfolgreiche Intubation mit relativ wenig Ausbildung oder Erfahrung. Nicht weniger als 30 Mäusen / h können mit diesem Ansatz mit einer Ausfallrate gegen Null behandelt werden.

Sobald ter Mäuse sind bereit, geopfert werden, die verletzt oder Krebs Lunge kann dann zur histologischen und pathologischen Analyse entfernt werden. Um alle histologischen Variablen richtig zu quantifizieren für den Vergleich mit anderen Lunge, ist es jedoch wichtig, die Fixierung Verfahren zu standardisieren und ordnungsgemäß zu quantifizieren, die feste Lungenvolumen ^10. Dieses Papier beschreibt im Detail die einfachen Verfahren, standardisierte Befestigungsverfahren sowie eine Möglichkeit, die Festlungenvolumen zu messen, zu ermöglichen. Das Volumen ist ein wesentlicher Metrik bei der Quantifizierung der Histologie, da ohne eine solche Volumenbestimmung kann nur relative Dichten gemessen werden ^10. Sobald das Lungenvolumen ist jedoch bekannt, absolute Messungen von Zellen und anderen strukturellen Messungen in der Lunge kann dann quantifiziert werden.

Protokoll

Das folgende Protokoll beschreibt ein System, das gut funktioniert in 20-35 g Mäusen. Das Verfahren könnte problemlos an größeren oder kleineren Mäusen, indem einfach die Kathetergröße. Alle Tier Protokolle wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Lung Instillation

1. Wählen Kommerzielle Ein-Zoll-langen 20 g intravenöse Kanüle für die Intubation zu verwenden.
2. Ändern die Katheterspitze manuell gebogen wird, um eine leichte Krümmung in der Spitze zu erzeugen, wie in 1 dargestellt.
3. Betäuben die Maus mit einem Gemisch aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (15 mg / kg) ip injiziert, und bestätigen Anästhesie durch das Fehlen von Rückbewegung. Bewerben Veterinär Salbe auf die Augen unmittelbar nach der Narkose. Unmittelbar nach der Narkose gelten veterinär Salbe auf die Augen und geben Carprofen (5-10 mg / kg SQ) zur postoperativen Analgesie und Instillation.
4. Legen Sie die mouse in Rückenlage auf einer geneigten Plattform. Wie in 2 gezeigt, ein großes Büro Binder mit Nahtschlaufen mit Klebeband am funktioniert sehr gut.
5. Rasieren Sie die ventralen Teil des Halses und reinigen und desinfizieren die Hals-Bereich mit 70% Alkohol. Mit neuen Latex- und puderfreie Handschuhe, verwenden chirurgische Instrumente mit 70% Alkohol desinfiziert.
6. Mit Hilfe einer scharfen Schere einen kleinen chirurgischen Schnitt in den Hals ca. 12 mm unterhalb der unteren Schneidezähne.
7. Mit einer Pinzette vorsichtig die Haut im Nacken kaudal, bis die ventrale Wand der Luftröhre zu sehen.
8. Vorsichtig einfahren Zunge und legen Sie die Kanüle mit der gebogene Spitze in Richtung der ventralen Oberfläche der Maus geneigt. Wie in 1.4, ziehen Sie vorsichtig auf die Haut im Nacken, und legen Sie die Kanüle in die Luftröhre.
   HINWEIS: Mit ein wenig Übung, der Katheter wird sichtbar nach unten bewegen die Luftröhre. Wenn sie in die Speiseröhre geht, dann wird es keine visuelle Beobachtung der Bewegung des Katheters zu sein. Keine Schnittewerden in die Trachea vorgenommen.
9. Sobald der Katheter in der Luftröhre im Hals gesehen brachte er etwa 5 mm bis zuverlässig übergeben die Stimmbänder, aber immer noch deutlich über der Carina.
10. Bereiten Sie vermitteln bis zu 50 & mgr; l der Flüssigkeit durch die Injektion durch den Katheter mit einem Gel Ladepipettenspitze. Setzen Sie die Spitze in der Luer-Anschluss, aber vor der Injektion genau hinschauen, um die Bewegung der Flüssigkeit in der Spitze synchron mit der Maus die Atmung beobachten. Dann spritzen den instillate.
11. Mit einer 1-ml-Spritze, sofort zu tun ein relativ schnelles Aufblasen von 0,6 ml Luft in die Lungen durch den Katheter zu verteilen die Flüssigkeit tief in der Lunge. Entfernen Sie die Kanüle.
12. Entfernen Sie die Kanüle.
13. Verwenden Sie eine kleine Menge von Cyanacrylat-Klebstoff, um die kleine Operationswunde nach Packungsbeilage Anleitung zum Vetbond schließen. Zeigen Mäuse in Einzelkäfigen und optisch zu überwachen, bis sie aufwachen und normal zu verhalten ohne Angabe von discomfort.

2. Lung Fixation

HINWEIS: Wenn alle experimentellen Verfahren werden in einer Maus durchgeführt, können die Lungen zur histologischen Verarbeitung durch Fixierung mit Formaldehyd (oder einem beliebigen anderen Fixiermittel) vorbereitet werden.

1. Opfern Sie die Maus mit einem IACUC akzeptablen Verfahren. Für die Vertreter der Maus im Video gezeigt wird Genickbruch eines betäubten Maus.
2. Führen Sie eine Tracheotomie (falls noch nicht geschehen) durch chirurgisches Freilegen der Bauchseite der Luftröhre, indem Sie einen kleinen Schnitt und Einfügen einer 18 G-Stub Nadelspitze in die Luftröhre, und band ihn mit Gewinde.
3. Öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb mit einem Mittellinienschnitt, schneiden Sie das Zwerchfell, und entfernen Sie die seitlichen Brustwand, um die Lungen aus.
4. Verbinden Sie den Luer-Ende der Nadel in ein Reservoir an einem Ringständer Formaldehyd enthält. Siehe Abbildung 3.
5. Stellen Sie die Oberseite des Formaldehyds 25 cm über dem Niveau des mouse. Siehe Abbildung 3. Als nächstes stellen Sie sicher, dass sich keine Luft in der Fixierschlauch indem Flüssigkeit aus dem Ende einer Sperrhahn. Verbinden den Luer Ende der Luftröhrenkanüle zum Reservoirschlauch. Öffnen Sie den Wasserhahn, um die Lungen mit dem Formaldehyd aufzublasen. Lassen Sie die Lunge unter Druck für mindestens 20 min.
6. Öffnen Sie den Wasserhahn, um die Lungen mit dem Formaldehyd aufzublasen. Lassen Sie die Lunge unter Druck für mindestens 20 min.
7. Als nächstes binden Sie die Luftröhre über das Ende der Stichleitung Nadel. Es kann helfen, langsam zurück auf die Nadel ziehen, um mehr von der uncannulated Luftröhre freizulegen. Wenn fest zusammengezogen, entfernen Sie den Wasserhahn.
8. Sorgfältig sezieren die Lunge.
9. Zeigen die Lunge in Formaldehyd über Nacht. Längere Zeiten sind in Ordnung, und einige Flecken oder Verfahren können bestimmte Zeiten festlegen. Auch andere Flüssigkeiten Fixiermittel wie z-fix kann für die Instillation und Eintauchen verwendet werden.
10. Bevor weitere histologische Verarbeitung, zu messendie feste Lungenvolumen als nächstes beschrieben.

3. Messung der Fest Lung Volume

1. Messen Sie das Lungenvolumen mit Archimedes Prinzip wie in 4 dargestellt ist. Entfernen Sie den Fest Lunge aus dem Formaldehyd und sezieren das Herz und andere nicht-Lungengewebe.
2. Verwenden Sie einen zuvor konstruierten einfache hausgemachte Drahtstützeinrichtung, die verwendet wird, um die Lungen vollständig unter Wasser zu halten.
   HINWEIS: Dieses Gerät muss mit je nachdem, was Balance verwendet wird in Einklang gebracht werden. Eine in 5 gezeigte typische Vorrichtung ist aus Plastikpipetten und dünn (20 G) Draht. Dieses System funktioniert gut, wobei der Rest in dem Video verwendet, könnte aber leicht an die meisten Laborwaagen angepaßt werden.
3. Stellen Sie ein Becherglas mit ≈200 ml Wasser auf die Waage und tarieren mit dem Tragkäfig anstelle im Wasser. Siehe Abbildung 6 Entfernen Sie den Metallkäfig. legen Sie die Lunge auf der Wasseroberfläche und drücken Sie unter Wassermit dem Käfig.
4. Das Gewicht auf die Waage. Diese Zahl entspricht dem Volumen Wasser versetzt und ist somit ein direktes Maß für die Lungenvolumen. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Lunge oder Nahtmaterial oder einen Teil der Drahtkäfig nicht die Seiten oder Boden des Bechers berühren zu machen.
5. Für Richtigkeit, wiederholen Sie diese Messung. Entfernen Sie die Lunge aus dem Wasser, und trocknen auf einem Gewebe. Tarieren das Becherglas mit Käfig in Position und wiederholen Sie den Lungenvolumenmessung. Die beiden Volumenmessungen sollte dann gemittelt werden.
   HINWEIS: Wenn die Lungen im Formalin für mehr als eine Woche bleibt, wird die Luft in der Lunge in der Flüssigkeit gelöst werden. Wenn dies geschieht, wird der Lungen sinken, so ist es nicht mehr notwendig, irgendeine Vorrichtung wie in Figur 5 zu verwenden, um die Lunge eingetaucht zu lassen. In einem solchen Fall kann die Lautstärke einfach durch Halten der Lunge von einer der Naht Strings, bis es vollständig eingetaucht ist, wie in Figur 4 dargestellt, gemessen werden.

Ergebnisse

Das Verfahren beschreibt in dem ersten Protokoll nicht von selbst zu irgendeinem generali Ergebnissen führen. Es beschreibt nur ein sehr zuverlässiges Mittel zur Substanzen direkt in die Luftröhre zu vermitteln. Figur 7 zeigt ein Beispiel einer Lunge, in dem Trypanblau wurde mit dem hier beschriebenen Verfahren eingeimpft. Gibt es weit verbreitete Verteilung des Farbstoffs, ähnlich wie es mit anderen Farbstoffen oder Tracer direkt in die Trachea oder Mäusen ^11,12 gegeben...

Diskussion

Die hier beschriebenen Verfahren haben mehrere Vorteile. Zuerst die erforderliche Ausrüstung ist einfach und kostengünstig. Zweitens kann die Intubation schnell mit wenigen Fehlern durchgeführt werden. Drittens erlaubt die Fähigkeit, in die Lunge bei einem konstanten Druck zu fixieren, und dann den Festlungenvolumen korrekte Quantifizierung von Strukturen oder Zellen in der Lunge ^10.

Ein möglicher Nachteil der Intubation ist die kleine Chirurgie. Dies kann die Möglichkeit, d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors