A thrombotischer Schlaganfall Modell basierend auf Transient zerebrale Hypoxie-Ischämie

Zusammenfassung

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Zusammenfassung

Stroke Forschung hat viele Rückschläge bei der Übersetzung neuroprotektive Therapien in die klinische Praxis ausgehalten. Im Gegensatz dazu die reale Therapie (tPA Thrombolyse) selten produziert Vorteile in mechanischen Verschluss-basierten experimentellen Modellen, die präklinische Schlaganfallforschung dominieren. Diese Spaltung zwischen der Bank und Nacht schlägt vor, die Notwendigkeit, die tPA-responsive Modelle in präklinische Schlaganfallforschung beschäftigen. Zu diesem Zweck ist ein einfacher und tPA-reaktiven thrombotischer Schlaganfall-Modell erfunden und hier beschrieben. Dieses Modell besteht aus transienten Okklusion der einseitigen Arteria carotis communis und die Lieferung von 7,5% Sauerstoff über eine Gesichtsmaske in erwachsenen Mäusen für 30 min, während die Tier rektale Temperatur bei 37,5 ± 0,5 ° C. Obwohl reversible Ligation des einseitigen Karotis oder Hypoxie jeweils drückt zerebralen Blutfluß nur vorübergehend, die Kombination beider Beleidigungen verursacht dauerhafte Reperfusion Defiziten, Fibrin und die Blutplättchenablagerung und große Infarct in der A. cerebri media versorgten Gebiet. Wichtig ist, dass Schwanzvenen-Injektion von rekombinantem tPA bei 0,5, 1, oder 4 Stunden nach der THI (10 mg / kg) bereitgestellt zeitabhängige Verringerung der Sterblichkeit und die Infarktgröße. Diese neue Hub-Modell ist einfach und kann in Laboren standardisiert auf experimentellen Ergebnissen zu vergleichen. Ferner induziert es Thrombose ohne Kraniektomie oder zu vorgeformten Embolien. Angesichts dieser einzigartigen Verdienste ist die THI-Modell eine sinnvolle Ergänzung zum Repertoire präklinische Schlaganfallforschung.

Einleitung

Thrombolyse und Rekanalisation ist die effektivste Therapie des akuten ischämischen Schlaganfalls in der klinischen Praxis ^1. Dennoch war die Mehrheit der präklinischen Forschung Neuroprotektion in einem transienten Mechaniker Obstruktion Modell (intraluminale Naht mittleren Hirnarterie), die schnelle Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach dem Entfernen des Gefäßverschlusses erzeugt und zeigt wenig bis keine Vorteile tPA Thrombolyse durchgeführt. Es wurde vorgeschlagen, dass die zweifelhaften Wahl der Taktmodelle beigetragen, zumindest teilweise auf die Schwierigkeit bei der Übersetzung neuroprotektive Therapie für die Patienten ^2,3. Daher gibt es eine zunehmende Forderung nach Einsatz tPA-responsive thromboembolischen Schlaganfall-Modelle in der präklinischen Forschung, aber solche Modelle haben auch technische Probleme (siehe Diskussion) ^4-7. Hier beschreiben wir eine neue thrombotischer Schlaganfall-Modell auf Grund einseitiger transiente hypoxischischämischer (THI) Beleidigung und ihre Reaktionen auf intravenöse tPA-Therapie ^8.

Die THI Schlaganfall-Modell wurde auf der Grundlage des Verfahrens Levine (dauerhafte Unterbindung der einseitigen Halsschlagader, gefolgt von der Exposition gegenüber transiente Hypoxie in einer Kammer), die für Versuche mit erwachsenen Ratten im Jahr 1960 ⁹ erfunden wurde entwickelt. Die ursprüngliche Levine Verfahren in Vergessenheit geraten, weil nur erzeugt variable Hirnschäden, aber das gleiche Beleidigung verursacht konsequente Neuropathologie in Nagetier Welpen, als es von Robert Vannucci und seine Kollegen als ein Modell der neonatalen hypoxischischämischer Enzephalopathie (HIE) 1981 ¹⁰ wieder eingeführt. In den letzten Jahren einige Ermittler neu adaptierte das Levine-Vannucci Modell erwachsener Mäuse durch Einstellen der Temperatur in der hypoxischen Kammer ^11. Es ist plausibel, dass die im Widerspruch Hirnläsionen in der ursprünglichen Levine Verfahren kann von schwankenden Körpertemperaturen von erwachsenen Nagetieren in der hypoxischen Kammer auftreten. Um diese Hypothese zu testen, modifizierten wir die Levine Verfahren durch Verabreichung hypoxischen Gasdurch eine Gesichtsmaske, während die Nagetierkerntemperatur bei 37 ° C auf dem OP-Tisch ^12. Wie erwartet, strenge Kontrolle der Körpertemperatur stark die Reproduzierbarkeit der HALLO-induzierte Gehirnpathologie erhöht. Die HALLO Beleidigung löst auch Koagulation, Autophagie und Grau und weißen Substanz Verletzungen ^13. Andere Forscher haben auch die HALLO-Modell, um nach Schlaganfall Entzündungsreaktionen ¹⁴ zu untersuchen.

Ein einzigartiges Merkmal des HALLO Schlaganfall-Modell ist, dass es genau das Virchow-Trias der Thrombusbildung, einschließlich der Stauung des Blutflusses, Endothelverletzung (zB aufgrund von HALLO-induzierten oxidativen Stress) und Hyperkoagulabilität (HALLO-induzierte Blutplättchen-Aktivierung) (folgt 1A) ^15. Als solches kann die HALLO-Modell einige pathophysiologischen Mechanismen relevant, um reale ischämischen Schlaganfall zu erfassen. Mit dieser Idee im Hinterkopf, haben wir weiter verfeinert die HALLO-Modell mit reversible Ligation des unilateral Arteria carotis communis (also um einen transienten HALLO Insult zu schaffen) und testete seine Antworten auf tPA Thrombolyse mit oder ohne Edaravone. Edaravone ist ein Radikalfänger in Japan bereits genehmigt, um ischämischen Schlaganfall innerhalb von 24 Stunden nach Auftreten ⁹ zu behandeln. Unsere Experimente zeigten, dass so kurz wie 30 Minuten Transienten HALLO löst thrombotischen Infarkt, und das kombinierte tPA-Behandlung verleiht Edaravone Synergieeffekte ^8. Hier beschreiben wir detailliert chirurgischen Verfahren und methodologischen Überlegungen des THI-Modell, das verwendet werden kann, um Reperfusion Behandlungen von akutem ischämischem Schlaganfall zu optimieren.

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Protokoll

Dieses Protokoll wird von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der Emory University zugelassen und folgt den National Institutes of Health der Leitlinie für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Setup-

1. Vorbereitung des chirurgischen Bett auf Erwärmung Pad mit Wärmepumpe bei 37 ° C für mindestens 15 min vor der Operation verbunden sind. Legen Sie eine Nackenrolle mit dem Lauf 3-ml-Spritze auf dem OP-Bett. Bereiten Sie das Anästhesiegas mit 2% Isofluran in der medizinischen Luft.
2. Bereiten autoklaviertem Zangen, Scheren, Nadelhalter Mikro, Gefäßklemme, Wattestäbchen und Nähte. Bereiten Gewebekleber und Augensalbe.
3. Einrichten des Hypoxie-System und Temperaturregler mit Wärmelampe und rektale Sonde. Bereiten Hypoxie Gas mit 2% Isofluran in 7,5% O ₂ von 92,5% N ₂ ausgeglichen.
4. Eine Stunde vor der Operation werden die Mäuse durch eine subkutane Injektion einer langsamen Freisetzung: Meloxicam (4,0 mg / kg) analgesized.

2. Transiente zerebrale Hypoxie-Ischämie (1B)

1. Betäuben 10-13 Wochen alten männlichen C57BL / 6-Mäuse mit einem Gewicht von 22 bis 30 g in der Narkose Kammer mit 3% Isofluran, bis das Tier nicht reagiert zu Fuß Squeeze, und entfernen Sie die Haare auf der rechten Hals mit Hilfe eines elektronischen Rasierer.
2. Platzieren Mäuse auf dem chirurgischen Bett mit 2% Isofluran in medizinischer Luft mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 L / min verbunden. Sichere Vorderbeine gestreckt entlang Nackenrolle an den Seiten mit einem Pflaster.
3. Reinigen Sie die Operationsstelle für Schnitt mit betadine gefolgt von Alkohol und Wattestäbchen.
4. Unter Binokular, Machen Sie einen 0,5 cm rechten Hals-Schnitt mit einem geraden Pinzette und ein Mikro Schere etwa 0,2 cm seitlich von der Mittellinie der Haut.
5. Verwenden Sie ein Paar fein gezackten Pinzette auseinander die Faszie und Gewebe zu ziehen, um die rechte Arteria carotis communis (RCCA) aussetzen. Sorgfältig trennen die RCCA vom Vagusnerv unter Verwendung eines Paares von feinen glatten Pinzette.
6. Live-Knoten zwei vorgeschnittene 5-0 Seidennaht (lösbare) auf der RCCA und nähen Sie dann die Haut mit 4-0 Nylon Monofilamentnahtmaterial (Abbildung 1c).
7. Bewerben Augensalbe auf beiden Augen bis zur Trockenheit zu verhindern.
8. Schnell übertragen die Mäuse auf Hypoxie-System und setzen Nase und Mund in Gesichtsmaske mit 2% Isofluran in 7,5% O ₂ bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 bis 1 l / min für 30 min.
   1. Bei Hypoxie Verwenden Temperaturregler mit Heizlampen, die rektale Temperatur bei 37,5 ± 0,5 ° C zu steuern. Überwachen Sie die Atemfrequenz bei 80-120 Atemzüge / min. Die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur über 37 ° C während der Hypoxie die Konsistenz der Hirninfarkt erstellen. Niedrige Atemfrequenz geschieht in der Regel nach 20 min Hypoxie. Entfernen Sie die Gesichtsmaske und lassen normale Luftzufuhr, wenn die Atemfrequenz unter bis 40. Das dauert 1-2 Minuten und nicht in die 30 min Hypoxie Dauer zu zählen.
9. Nach Hypoxie, zu übertragenMäuse auf eine chirurgische Bett und lassen Sie die beiden Fäden aus RCCA. Schließen Sie die Wunde mit Gewebekleber, und zurück in den Käfig Mäuse dann. Schließen Sie die Tiere, wenn beide von zwei Live-Knoten unerwartet nach Hypoxie freigegeben.
10. Überwachen Sie die Mäuse für 5-10 Minuten, um von Hypoxie und Anästhesie zu erholen. Setzen Sie den benetzten Essen im Käfig und senden es an Tierstation.
    Hinweis: Tiere, die leichte bis schwere Drehverhalten bei 24 Stunden nach THI mit Gehirn Verletzung korreliert. Die meisten Tiere mit Anfallssymptome sterben, bevor der 24-Stunden-Zeitpunkt nach THI.

3. Laser Speckle Contrast Imaging

Anmerkung: Obwohl dies nicht ein wesentlicher Vorgang des THI-Modell kann eine zweidimensionale Laser-Speckle Kontrastbildgebungssystem ¹⁶ verwendet werden, um die Änderungen des zerebralen Blutflusses (CBF) während oder nach transienter Hypoxie-Ischämie zu charakterisieren. Um die Veränderungen des CBF unter Thi unmittelbar nach der st dokumentieren, Rekordep 2.6. Alternativ zu CBF Erholung nach THI Beleidigung zu vergleichen, diese Verfahren nach dem Schritt 2.10 durchgeführt werden.

1. Ein anästhesierten Maus in die Bauchlage und führen eine 1 cm lange Inzision auf die Kopfhaut mit dem Schädel belichtet, jedoch ungeöffnet.
2. Überwachen CBF in beiden Gehirnhälften unter einem Blutfluss Imager nach Herstellerprotokoll und starten Sie die Aufzeichnung der Hirndurchblutung unmittelbar nach dem CCAO Operation (Schritt 2.6). Fahren Sie für 50 min.
3. Die ausgewählten Bereiche mit der MoorFLPI Software nach den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2) zeigen CBF-Bild mit beliebigen Einheiten in einem 16-Farbpalette und in Echtzeit zu analysieren.
4. Nach Aufzeichnung der CBF Bild, schließen Sie die Kopfhaut mit Gewebekleber und senden Sie das Tier in den Käfig.

4. tPA Verwaltung

1. Injizieren Tiere am Schwanzvene mit dem Lösungsmittel oder 10 mg / kg rekombinanten tPA (220-300 &# 956; l von 1 mg / m tPA) bei 0,5, 1, oder 4 h nach tCCAo zuzüglich Hypoxie (Abbildung 4).

5. Brain Damage Erkennung mit verschiedenen Optionen

Hinweis: Um die Gehirnproben zu sammeln, einschläfern die Mäuse bei 1, 4 oder 24 Stunden nach der THI.

1. Führen Quantifizierung der Infarktvolumen von in-vivo-2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Verfahren bei 24 Stunden nach der THI Beleidigung als vorherige beschrieben. ¹⁷
   1. Intraperitoneal injizieren Tiere mit 1,4 M Mannit-Lösung (~ 0,1 ml / g Körpergewicht) 30 Minuten vor transkardialer Perfusion. Transkardialer perfuse Mäuse mit PBS, gefolgt von 10 ml 2% TTC.
   2. Entfernen Sie das Gehirn von Tieren, die mit chirurgischen Instrumenten nach 10 Minuten aufnehmen und in 4% Paraformaldehyd für die Fixierung über Nacht und Abschnitt in 1 mm Dicke mit einem Vibratom.
   3. Machen Sie ein Reihe von vier geschnittene Gehirn gleitet durch Digital-Mikroskop und quantify das Infarktvolumen als das Verhältnis der Infarktfläche (weißer Bereich in der rechten Seite), um den Bereich der unbeschädigt ist, mit der kontralateralen Hemisphäre ImageJ Software.
2. Alternativ führen Thrombosebildung durch Immunfluoreszenz bei 1 Stunde nach THI Beleidigung.
   1. Frieren Sie den festen Gehirn in OCT-Verbindung und Abschnitt die Gehirne bei 12 & mgr; m Dicke mit Hilfe eines Kryostaten.
   2. Inkubieren des Gehirns Schlitten mit Kaninchen-anti-Fibrinogen-Antikörper (1: 100) gefolgt von Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluro 488 Farbstoff (1: 200), um die Fluoreszenz an einem Fluoreszenzmikroskop zu beobachten.
3. Alternativ führen Gefäß Behinderung durch Schwanzveneninjektion von 100 ul 2% Evans-Blau-Farbstoff in 4 Stunden nach THI Beleidigung.
   1. Euthanize die Mäuse und schnell geschnitten Kopf, um Gehirn nach Evans blue Injektion in 4% Paraformaldehyd zu entfernen. Hinweis: Es dauert 5-10 Minuten für Evans blue Zirkulation mit blauer Farbe sowohl von Vorder- und Hinterbeine.
   2. Abschnitauf festen Gehirn bei 100 & mgr; m Dicke mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms und beobachten Sie die Fluoreszenz unter Verwendung eines 680 nm Emissionsfilter auf einem Fluoreszenzmikroskop.

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Ergebnisse

Zweidimensionale Laserfleckenkontrast-Bildgebung (LSCI) ¹⁶ wurde verwendet, um die Änderungen des zerebralen Blutflusses (CBF) durch 30-minütiges transienten einseitige Carotisokklusion (tCCAO), 30 min Einwirkung von Hypoxie (7,5% Sauerstoff) und 30 min einseitigen Vergleichs Karotis-Ligation unter Hypoxie (THI). Dieses Experiment zeigte, dass unter Normoxie tCCAO drückte die CBF auf der Carotis, ligiert Hemisphäre zu ~ 50% des Ausgangswertes, der schnell auf über 85% nach dem Lösen der Carotisokklusion...

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Diskussion

Schlaganfall ist ein großes gesundheitliches Problem von wachsender Bedeutung für jede Gesellschaft mit einer alternden Bevölkerung. Weltweit ist Schlaganfall die zweithäufigste Todesursache mit einem geschätzten 5,9 Millionen tödlichen Ereignisse im Jahr 2010, das entspricht 11,1% aller Todesfälle ^18. Schlaganfall ist die dritthäufigste Ursache für Behinderungen bereinigte Lebensjahre (DALYs) verloren global im Jahr 2010, die sich aus dem fünften Platz im Jahr 1990 ^19. Diese epidemiologi...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
adult male mice	Charles River	C57BL/6	10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901807	anesthesia
Medical air (Compressed) air tank	Airgas	UN1002	anesthesia
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-25	anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem	Surgivet	V703501	hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank	Airgas	UN1956	hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp	Cole Parmer	EW-89000-10	temperature controllers
Rectal probe	Cole Parmer	NCI-00141PG	temperature controllers
Dissecting microscope	Olympus	SZ40	surgical setup
Heat pump with warming pad	Gaymar	TP700	surgical setup
Fine curved forceps (serrated)	FST	11370-31	surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)	FST	11373-12	surgical instrument
micro scissors	FST	15000-03	surgical instrument
micro needle holders	FST	12060-01	surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats	FST	13008-12	surgical instrument
5-0 silk suture	Harvard Apparatus	624143	surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture	LOOK	766B	surgical supplies
Tissue glue	Abbott Laboratories	NC9855218	surgical supplies
Puralube Vet ointment	Fisher	NC0138063	eye dryness prevention
MoorFLPI-2 blood flow imager	Moor	780-nm laser source	Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol	Sigma	M4125	in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877	in vivo TTC
Vibratome	Stoelting	51425	brain section for in vivo TTC
Digital microscope	Dino-Lite	AM2111	whole-brain imaging
O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	Immunohistochemistry
Cryostat	Vibratome	ultrapro 5000	brain section for IHC
Evans blue	Sigma	E2129	Detecting vascular perfusion
Microtome	Electron Microscopy Sciences	5000	brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	euthanasia
Fluorescent microscope	Olympus	DP73
Meloxicam SR	ZooPharm		NSAID analgesia