Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Zusammenfassung

De novo Lipogenese und β-Oxidation von Fettsäuren bilden Schlüsselstoffwechselwege in Hepatozyten, Wege, die in mehreren Stoffwechselstörungen, einschließlich Fettleber gestört werden. Hier zeigen wir Isolierung von Maus primären Hepatozyten und zu beschreiben, die Quantifizierung der β-Oxidation von Fettsäuren und Lipogenese.

Zusammenfassung

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.

In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via β-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling.

Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

Einleitung

Non-alcoholic fatty liver disease is one of the leading causes of liver disease in Westernized cultures^1,2. Lipid accumulation within the liver is associated with cell death, fibrosis, and liver failure via yet unknown mechanisms^3-6. In fatty liver disease, hepatocyte-mediated β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis are important determinants of net lipid accumulation^7,8. This article will, therefore, focus on hepatocyte isolation, followed by quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis.

Numerous methodologies have been developed to interrogate hepatocyte lipid metabolism. Though it is possible to measure metabolism of fat in vivo using stable isotopes^9,10, these methods are costly, and require large numbers of animals. Additionally, the ability to investigate the effect of exogenous chemicals is limited due to the nature of in vivo experimentation. In contrast, the isolation of primary hepatocytes from mouse liver provides an affordable avenue to pursue¹¹. Furthermore, studying hepatocytes in culture allows investigators to study the effects of varying chemicals on lipid processing while circumventing the difficulties of in vivo experimentation. Finally, isolated hepatocytes avoid any confounding from varying genetics since they are derived from the liver of a single animal.

Here we isolate and culture of hepatocytes, and we measure β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled palmitate. The protocol detailed below is straight forward, effective, and reproducible.

Protokoll

Alle Tierversuche sollten in Übereinstimmung mit den örtlichen und nationalen Vorschriften und mit der Zustimmung eines institutionellen IACUC und Strahlungssicherheit Verwaltung durchgeführt werden.

1. Vorbereitung

1. Einige Tage vor dem Test, tauen die 500 ml Flasche Liver Digest Medium (LDM) und wieder einfrieren ~ 35 ml Aliquots in 50 ml konischen Röhrchen. Lagerung bei -20 ° C, bis sie benötigt.
2. Einen Tag vor dem Assay, pre-sterilisiert sauberen Dissektion Tools von Autoklaven.
3. Am Tag des Assays, behandeln die notwendige Menge von 24-Well-Kulturplatten mit Collagen.
   1. 1 Teil von 3 mg / ml Rattenschwanzkollagen mit 50 Teilen PBS. In etwa 500 & mgr; l in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und Inkubation für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie die Kollagen und lassen Sie die Platte trocken in der Haube in die Luft. Wiederholen wenigstens ein weiteres Mal.
      Hinweis: Collagen-Beschichtung kann bis zu einer Woche in ad durchgeführt werdenVance und Platten bei 4 ° C in Plastikfolie abgedichtet gelagert.
4. Bereiten LDM für Assay: Thaw LDM und warm bis 37 ° C und pH-Wert auf 7,4 mit 1 N KOH. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter und in einen Umluft 42 ° C Wasserbad.
5. Warm 25 ml Leberperfusion Medium auf 42 ° C im Umluft Wasserbad.
6. Vorbereitung 90% kolloidales Siliciumdioxid, das mit Polyvinylpyrrolidon-Lösung überzogen: 1 ml 10x DPBS zu 9 ml kolloidaler Kieselsäure mit Polyvinylpyrrolidon beschichtet. Einstellen des pH auf 7,4 unter Verwendung von 0,1 N HCl. Filter mit einer sterilen 0,2 & mgr; m Spritzenfilter filtriert. Lagern bei RT.
7. Warm Plating Medium auf 37 ° C.

2. Isolierung von Primär Maushepatozyten

1. Einrichten peristaltische Pumpe, Schläuche und Dissektionstisch: Sterilisieren Schlauch durch Spülen mit 5 ml 70% Ethanol in destilliertem Wasser, gefolgt von 10 ml sterilem Wasser. Zeigen Schlauch in Leberperfusion Medium und führen Pumpe zu füllengesamte Rohrlänge.
2. Opfern Maus durch die institutionell genehmigten Methode.
3. Sezieren offen die Bauchhöhle: Sprühen Sie die Mausunterleib zügig mit 70% Ethanol. Verwendung blunt-end Schere, einen Mittelschnitt durch die Dermis die Länge der Bauch und seitlich reflektieren. Einen ähnlichen Schnitt in der Bauchfell, um die Eingeweide aus.
   1. Mit einem stumpfen Gegenstand vorsichtig zu verdrängen den Darm zu entlarven die Bauchgefäß Suchen Sie die Bauch untere Hohlvene (IVC) und legen Sie eine Naht unter dem Blutgefäß, distal der Nierenvenen
4. Distal des Nahtmaterials Platzieren einer Nadel und der Katheter in die IVC, Vorschieben über das Niveau des Fadens. Mit der Nadel noch vorhanden, binden die Naht um den Katheter, um es in Position zu halten. Die Nadel vorsichtig entfernen. Wenn es richtig mit Fluss durch den Katheter durchgeführt, Blut.
5. Unter Verwendung einer Pipette, füllen Sie die restliche Fläche in dem Katheter mit Perfusionsmedium, sicherzustellen,daß keine Luft vorhanden ist. Mit großer Sorgfalt, befestigen Sie den Schlauch mit dem Katheter.
6. Sezieren offen die Lunge Hohlraum: sanft spiegeln die überlegene Leberlappen, um die Membran freizulegen. Sorgfältig durchstechen die Membran mit scharfen Spitze Schere, dann machen Sie eine laterale Inzision, um die Brusthöhle freizulegen, kümmert sich um die Gallenblase und Pleura Gefäßsystem zu vermeiden. Legen Sie eine Bulldogge Schelle um den Brust untere Hohlvene gerade proximal der Lebervene.
7. Schneiden Sie die Pfortader und schalten Sie die Pumpe mit einem 3 - 4 ml / min. Perfusion der Leber Leberperfusion Medium für 5 min unter Verwendung von etwa 20 ml Perfusionsmedium.
   Hinweis: Die Leber sollten sofort von Rot zu ändern bis grau / tan. Wenn Teile der Leber rot bleiben, dürfte dies deutet auf eine schlechte Durchblutung, und die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Isolierung stark vermindert. Während der Perfusion, seien Sie vorsichtig, um das Medium nicht auslaufen zu gewährleisten, und dass keine Luftblasen geben Sie die Schläuche.
8. Nach 5 min Inkubation stoppendie Pumpe und übertragen Sie den Schlauch an Leber Digest Medium. Starten Sie die Pumpe und Perfusion der Leber für eine weitere 10 bis 15 min (bis das Medium erschöpft ist).
9. Am Ende der Durchblutung, die Pumpe stoppen. Die Leber ist ein rosa Farbton haben und scheinen etwas vergrößert. Auszuschneiden die Leber durch sorgfältige Dissektion. Entfernen Sie die Gallenblase und übertragen die Leber zu 10 cm Gewebekulturschale.
10. In einer Biosicherheitswerkbank, 10 ml Plating Medium (Tabelle 1) in die Leber. Kratzen Sie vorsichtig die Leber unter Verwendung entweder einer Pinzette oder einem Skalpell, um die Leberzellen zu entfernen. Filtern der Suspension unter Verwendung eines 100 & mgr; m Zellsieb und in ein konisches 50 ml-Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit weiteren 10 ml Plattierungsmedium und Pool in der 50 ml konischen Röhrchen.
11. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 5 min bei 350 × g, 4 ° C.
12. Saugen Sie mittel- und Pellet in 10 ml Plattierungsmedium und 10 ml 90% kolloidaler Kieselsäure mit po beschichtetlyvinylpyrrolidone. Vorsichtig mischen und Zentrifuge wie in Schritt 2.11. Nach der Zentrifugation wird eine Schicht aus toten Zellen werden auf der Oberseite der Mischung schwimmt, während die lebenden Zellen auf den Grund zu pelletieren.
13. Saugen Sie abgestorbenen Zellen und Medium. Mit 20 ml Plattierungsmedium, Zentrifuge 2.11 waschen 2 mal.
14. Die Zellen in 10 ml Medium Überzug. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und legen 9 x ¹⁰ 4 Zellen / Vertiefung in Kollagen behandelten 24-Well-Kulturschalen. Inkubieren in einem 37 ° C Brutschrank für 2 Std. Jede Platte kann entweder für die Fettsäure-Oxidation Assay oder der Lipogenese-Assay verwendet werden.
15. Optional Brunnen verändern Wartung Medium (Tabelle 1) und die Kultur bei 37 ° C. 3 Tage, ohne die Testergebnisse - Zellen für 2 kultiviert werden.

3. Fettsäure-Oxidationsassay

Warnung: Verwenden von Radioaktivität kann gefährlich sein. Alle Einkauf, Lagerung, Handhabung, und diEntsorgungsbetrieb von radioaktivem Material sollte in Übereinstimmung mit den institutionellen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften und Richtlinien ausgeführt werden.

1. 16 bis 20 h vor dem Assay, waschen Zellen 2 mal mit warmem PBS. Ändern die Zellen an serumfreies Serumentzugs-Medium (Tabelle 1) mit 20 nM Glucagon und Inkubation über Nacht bei 37 ° C.
   Anmerkung: Da fötales Rinderserum enthält eine unbekannte Konzentration von Stoffwechsel Hormone (zB Insulin, Glukagon), Serum hungern die Zellen keine Verwechslung sich daraus für den Assay haben kann. Zellen lebensfähig in Serumhungermedium für> 24 h. Glucagon Behandlung wird verwendet, um die Oxidation von Fettsäuren in den Leberzellen zu stimulieren.
2. Am Morgen des Tests vorzubereiten Vorinkubationsmedium: Resuspendieren eine entsprechende Menge an Natriumpalmitat in ultrareinem Wasser, um eine 100 mM Lösung und Wärme bis 70 ° C für 10 min zu machen. In der Zwischenzeit bereiten die erforderliche Menge (0,5 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte)DMEM mit 25 mM HEPES, 1% BSA Fraktion V, und 20 nM Glucagon. Wärme auf 37 ° C.
   1. Einmal solubilisiert hinzuzufügen Palmitate auf eine Endkonzentration von 250 & mgr; M zu dem Medium. Ändern Hepatozyten zu Vorinkubationsmedium und bei 37 ° C für 2 Stunden. Behalten einige Vorinkubationsmedium bei 37 ° C für die spätere Verwendung.
3. Während der Inkubation Trocknen eine geeignete Menge an ¹⁴ C-Palmitat (0,5 uCi / Vertiefung) durch Verdampfung unter Stickstoff.
   1. Zum Beispiel, um 24 Proben in einem 24-Well-Platte zu messen, Transfer 120 ul 0,1 & mgr; Ci / ml ¹⁴ C-Palmitate in ein 1,5-ml-Tube. Langsam verdampft das Ethanol-Lösungsmittel durch Einblasen von Stickstoffgas über die Lösung in einem Abstand von 3-5 cm in einem Abzug. Das Lösungsmittel sollte in etwa 30 verdampfen - 40 min, wobei Trocken ¹⁴ C-Palmitat im Boden des Röhrchens.
4. Ca. 15 min vor dem Ende der Inkubation resuspendieren ¹⁴C-Palmitate in 0,1 N NaOH (12,5 ul / & mgr; Ci). Inkubieren bei 70 ° C für 10 min. In drei Bänden der warmen Vorinkubationsmedium und mischen durch Auf-und Abpipettieren.
5. Spike jede Vertiefung mit 25 ul verdünnt ¹⁴ C-Palmitate. Mischen Sie durch vorsichtiges Schwenken der Platte und bei 37 ° C für 90 min. Dies ist die Testplatte.
6. Während der Inkubation, bereiten Sie die Filter Pappteller (Abbildung 1).
   1. Entfernen Sie die Abdeckung aus einer sterilen 24-Well-Platte. Platzieren einer 2 cm x 2 cm großes Stück Filterpapier in den Boden einer jeden der Vertiefungen. Überlagern die Platte mit einem Stück von 4 "x 7" Parafilm.
   2. Mit einem großen, rechteckigen Gegenstand, beispielsweise eine Mikropipettenspitze Box, reiben Sie die Parafilm auf den Brunnen, um den Parafilm an den gut Öffnungen perforiert und eine Abdichtung zu schaffen über den Rest der Platte. Entfernen Sie die Lochkreise Parafilm jetzt Abdecken der Brunnen. Die Platte sollte jetzt fest mit Parafilm in allen Bereichen abgedeckt werden außer dem gut openings.
7. 10 min vor dem Ende der Inkubation werden 200 ul 3 N NaOH zu jeder Vertiefung der Filterpapierplatte, so dass das Filterpapier absorbiert die gesamte Flüssigkeit.
   1. Gegebenenfalls vor dem Einfrieren, Transfer des Mediums auf eine frische 24-Well-Platte. Nach einmaligem Waschen mit PBS, lysieren die restlichen Zellen in 0,1 N HCl und berechnen Proteingehalt durch BCA-Assay.
8. Am Ende der Inkubation Schnappgefrierassayplatte in flüssigem Stickstoff. Seien Sie vorsichtig, um jede Vertiefung zu gewährleisten ist komplett eingefroren, bevor Sie fortfahren.
9. 100 l 70% iger Perchlorsäure in jede Vertiefung der Testplatte. Unmittelbar decken mit dem Filter Pappteller. Legen Sie die Platten auf einem Orbitalschüttler und Felsen am Umlaufgeschwindigkeit von 80 rpm bei RT für 2 h.
10. Nach der Inkubation der Proben zu verarbeiten:
    1. Um den CO _{2 -Anteil} zu messen, übertragen Sie die Filterpapier Quadrate, um 4 ml flüssige Szintillationsflüssigkeit in einem SzintillationszählerFläschchen und Maßnahme ¹⁴ C-Signal.
    2. Um den säurelöslichen Materials zu messen, zu übertragen 400 ul Medium in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 10 min. 100 l des resultierenden Überstandes auf 500 ul von 2: 1 Chloroform-Methanol (v / v), und kurz vortexen.
       1. Fügen Sie 250 ul Wasser zu der Mischung und Wirbel erneut. Zentrifuge Proben für 10 min bei 3.000 x g. Transfer 200 ul der oberen Phase auf 4 ml flüssige Scintillationsflüssigkeit in einem Szintillationsfläschchen und messen ¹⁴ C-Signal.

4. Lipogenese-Assay

1. Der Abend vor dem Test, waschen Sie die Zellen 2 mal mit warmem PBS. Ändern Sie die Hepatozyten, um Serumhungermedium mit 100 nM Insulin. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
   Anmerkung: Da fötales Rinderserum enthält eine unbekannte Konzentration von Stoffwechsel Hormone (zB Insulin, Glucagon), Zu verhungern Serum die Zellen keine verwirrende Auswirkungen dies auf den Assay haben können, zu entfernen. Zellen lebensfähig in Serumhungermedium für> 24 h. Insulin wird in diesem Test verwendet werden, um die Lipogenese zu stimulieren.
2. Machen Lipogenese Medium: Serumhungermedium mit 100 nM Insulin, 10 & mgr; M kaltem Acetat und 0,5 & mgr; Ci ³ H-Acetat pro Vertiefung. Wechselzellen Lipogenese Medium und bei 37 ° C für 2 Std. Fügen Sie alle Verbindungen von Interesse getestet werden.
3. Nach der Inkubationszeit, waschen Zellen 2 mal mit PBS. Lysieren Zellen durch Abschaben in 120 ul 0,1 N HCl. Reserve 10 & mgr; l für die Protein-Assay (Beurteilung durch BCA-Test), und Transfer 100 ul bis 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Extrakt Lipide durch Zugabe von 500 ul von 2: 1 Chloroform-Methanol (v / v). Vortex kurz und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Fügen Sie 250 ul Wasser, Wirbel und Inkubation bei Raumtemperatur für weitere 5 min. Centrifuge Proben 10 min bei 3.000 xg, RT. Sorgsamübertragen untere Phase bis 4 ml flüssige Szintillationsflüssigkeit in einem Szintillationsfläschchen und messen ³ H-Aktivität.

Ergebnisse

Hepatozyten-Isolierungen führen in der Regel in 1-3 x 10 ⁷ Zellen insgesamt. Nach Inkubation über Nacht werden die Zellen hexagonal, von denen viele binukleären werden (Figur 2) angezeigt werden. Gesunde Zellen sollten frei von Granulationen oder Blasen, was auf Zelltod sein.

Im allgemeinen wird die Oxidation von Fettsäuren Assays in drei bis vier Wiederholungen pro Testverbindung ausgeführt. Zählungen für die CO _{2 Proben} sind etwa ein Fünftel d...

Diskussion

Die Zeit vom Opfer Perfusion sollte weniger als 3 min für ideale Perfusion und Kollagenaseverdau der Leber. Sobald Perfusion mit Perfusionsmedium eingeleitet wird, sollte die Leber sofort Aussehen von rot bis hell ändern. Nach ca. 10 min Inkubation mit LDM, wird die Leber geschwollen und rosa angezeigt. Im Falle, dass die Perfusion unzureichend ist, kann die Leber nicht zeigen diese Änderungen, und dies wird in der Regel in einem unteren Hepatozyten Ausbeute führen.

Nach den Waschschritt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liver Perfusion Medium	Life Technologies	17701038
Liver Digest Medium	Life Technologies	17703034	Aliquot and store at -20 °C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Collagen	Life Technologies	A1048301
Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone	GE Life Sciences	17-0891-01
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-CI
Penicillin / Streptomycin	Cellgro	30-001-CI
Insulin	Sigma	I0516-5ML
Dexamethasone	Sigma	D2915-100MG
Albumin (BSA), Fraction V	MP Biomedicals	103703
24-Well Culture Dish	Corning Falcon	353047
Tygon S3 Tubing	Cole Parmer	06460-34
Male Leur Lock to 200 Barb Connectors	Cole Parmer	45518-00
24 G x 3/4" Catheter	SurFlo	SROX2419CA
Perma-Hand Silk Suture	Ethicon	683G
Cell Strainer	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath	Fisher	13-874-3
MasterFlex C/L Peristaltic Pump	MasterFlex	HV-77122-24
Microclamp	Roboz	RS-7438	Pre-sterilize in autoclave
5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors	Roboz	RS-6810	Pre-sterilize in autoclave
24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors	Roboz	RS-5912	Pre-sterilize in autoclave
4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5130	Pre-sterilize in autoclave
4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5137	Pre-sterilize in autoclave
60 ml Syringe	Becton Dickinson	309653
50 ml conical tubes	Corning Falcon	352070
BCA Protein Assay	Thermo Scientific	23225
Biosafety Cabinet
CO2 Incubator
Serological pipets
1,000, 200, 20 μl pipet and tips