Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel

Zusammenfassung

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

Zusammenfassung

Die gezielte Abgabe von Zellen und therapeutische Mittel bei einer Vielfalt von biomedizinischen Anwendungen durch die Konzentration der therapeutischen Wirkung an der Zielstelle zu minimieren, während nachteilige Wirkungen auf off-Zielstellen zur Verfügung. Magnetischen Zell-Targeting ist eine effiziente, sichere und unkomplizierte Lieferung Technik. Superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel (SPION) sind bioabbaubar, biokompatibel, und kann in die Zellen durch Endozytose um sie auf Magnetfelder anspricht übertragen werden. Das Syntheseverfahren beinhaltet das Erstellen Magnetit (Fe _{3 O 4)} Nanopartikel durch Hochgeschwindigkeits-Emulgierung, gefolgt, um ein Poly (milch-co-glykolsäure) (PLGA) Beschichtung zu bilden. Die PLGA-Magnetit SPIONs sind ca. 120 nm Durchmesser, einschließlich der etwa 10 nm Durchmesser Magnetitkernteilchen. Wenn in einem Kulturmedium platziert werden SPIONs natürlich von Zellen Endozytose und als kleine Cluster innerhalb zytoplasmatischen Endosomen gespeichert. Diese Partikel verleihen ausreichende magnetische Masse zu den Zellenum für die Ausrichtung im magnetischen Feldern zu ermöglichen. Zahlreiche Zellsortierung und Targeting-Anwendungen werden von Rendering verschiedenen Zelltypen auf Magnetfelder reagiert, aktiviert. SPIONs haben eine Vielzahl von anderen biomedizinischen Anwendungen sowie einschließlich der Verwendung als ein medizinisches Bildgebungskontrastmittel, gezielte Arzneimittel oder Genabgabe diagnostischen Assays und die Erzeugung von lokaler Hyperthermie zur Tumortherapie oder Gewebe Löten.

Einleitung

Targeted delivery and capture of cells to specific sites within the body is desirable for a variety of biomedical applications. Delivery of neural stem cells to the brain by MRI-guided focused ultrasound has been proposed as a possible treatment option for neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and stroke¹. Mesenchymal stem cells are being studied for their ability to deliver anti-cancer drugs to tumors due to their natural tumor-tropic properties^2,3. Cardiac stem cells have been delivered to the heart as a possible treatment for myocardial infarction^4,5. Vascular stents have been developed with CD34 antibodies to capture circulating progenitor cells⁶. While promising, these cell targeting approaches present drawbacks including lack of cell specificity, inconsistent cell retention, and off-target cell delivery.

The overall goal of the current method is to enable magnetically directed targeting of cells for a variety of cell delivery and sorting applications. Magnetic targeting allows for controlled delivery of specific cells to a specific target site with minimal off-target effects⁷. The magnetic fields can be generated by implanted or external devices to safely direct the movement of magnetically-labeled cells within the body⁸. Numerous research efforts have focused on magnetically directed targeting of stem cells to injured tissues such as the heart^9-14, retina¹⁵, lung¹⁶, skin¹⁷, spinal cord^18,19, bone²⁰, liver²¹, and muscle^22,23 in order to improve regeneration outcomes.

Magnetic targeting of cells has also been studied extensively as a means to endothelialize implantable cardiovascular devices. A uniform and complete endothelium provides a barrier between the device and circulating blood elements to mitigate thrombosis and inflammation. Endothelial cells can be delivered to the device either prior to implantation or via the vascular system following implantation. In both cases, magnetic fields are used to capture cells to the surface of the device and retain the cells when subjected to the shear stress generated by circulating blood. Magnetic vascular stents^24-27 and vascular grafts²⁸ have both been fabricated and tested for this purpose.

Magnetic cell targeting requires a strategy for labeling cells with magnetic carrier particles. These particles can be bound to the surface of cells via antibodies or ligand/receptor pairs or they can be endocytosed into the cells. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and readily endocytosed by a variety of cell types²⁹. These particles effectively render a cell responsive to magnetic fields and are naturally degraded over time. SPIONs provide a straightforward and safe means of magnetically labeling cells in culture for a variety of magnetic targeting and sorting applications. A method for synthesizing SPIONs with a magnetite (Fe₃O₄) core and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) shell is provided. In addition, a method for labeling cells in culture with SPIONs is provided.

Protokoll

1. Synthese von Magnetit Gel

1. Durch Verwendung konzentrierter Salzsäure gefolgt von entionisiertem Wasser, gefolgt von Ethylalkohol Waschen Sie alle Glaswaren. Trocknen lassen O / N, vorzugsweise in einem Trockenofen.
   VORSICHT! Chlorwasserstoffsäure ist schädlich - persönliche Schutzausrüstung tragen und die Arbeit in einer Abzugshaube; Ethylalkohol schädlich ist - persönliche Schutzausrüstung tragen.
2. Verwenden Sie einen Dreschelflasche durch sanft blubbernden _N 2 -Gas 30 Minuten entgasen 500 ml entionisiertem _H 2 O.
3. Set-up die Magnetit Synthesevorrichtung in einem Chemieabzug benutzen.
   1. Legen Sie einen 500 ml Dreihalsrundkolben, der innerhalb einer Heizhaube Heizung und sichern Sie den Mittelhals mit einer Schelle und Ständer.
   2. Installieren einer Gummimembran in eine der Seitenhälse des Rundkolben und einem Rückflußkühler mit einem Gummiseptum in den verbleibenden Seitenhals. Dauerbetrieb Kaltwasser durch die Rückflusskühler.
   3. Puncture the Rundkolben von Gummiseptum mit einer Nadel mit einem N _{2 -Gas-Leitung} verbunden und Durchstoß der Rückflußkühler Gummiseptum mit einer Nadel mit einer Gasleitung laufen, um eine Waschflasche verbunden (dh Kolben mit Wasser), um Gasaustritt zu visualisieren.
   4. Installieren Sie ein Stechpaddel ins Zentrum Hals des Rundkolben, der über ein Paddel-Adapter. Bringen Sie die Klinge Paddel die Welle auf einem Rührwerk auf ein Stativ montiert.
4. Spülen Rundkolben, der mit N _{2 -Gas und} verlassen N _{2 -Gas bei} einem niedrigen, aber nachweisbaren Rate fließt.
5. Entfernen Sie die Rückflusskühler aus dem Rundkolben und fügen 1,000 g Eisen (III) -chlorid, 0,6125 g Eisen (II) -chlorid-Tetrahydrat, und 50 ml entgastem _H 2 O.
   VORSICHT! Eisen (III) -chlorid und Eisen (II) -chlorid-Tetrahydrat schädlich sind - persönliche Schutzausrüstung tragen.
6. Ersetzen Sie die Rückflusskühler und rühren bei 1000 Upm unter Erwärmen auf 50° C. Rühren unter diesen Bedingungen produziert 10 nm Durchmesser Magnetit-Nanopartikel.
7. Einmal bei 50 ° C, mit 10 ml 28% iger Ammoniumhydroxidlösung durch Einspritzen durch das Gummiseptum in den Rundkolben gegeben, während noch gerührt.
   VORSICHT! Ammoniumhydroxid ist schädlich - persönliche Schutzausrüstung tragen.
   HINWEIS: Die Ammoniumhydroxidlösung verwendet, um die Magnetit ausgefällt und die Lösung sollte schwarz.
8. Die Gummischeidewand _und N 2 Gasleitung aus dem Rundkolben und Erhitzen auf 90 ° C zum Sieden aus dem Ammoniakgas während noch gerührt.
   Anmerkung: Es ist optional, um den Fluss von N _{2 in den} Rundkolben durch Punktieren der Rückflußkühler Gummiseptum beizubehalten, jedoch ist die Oxidation von Magnetit Maghemit während dieser Stufe vernachlässigbar.
9. Nachdem bei 90 ° C, 1 ml der Ölsäure zu dem Rundkolben, während immer noch gerührt. Die Ölsäure wird zum Beschichten der Magnetit napartikel Magnetit Gels.
   VORSICHT! Ölsäure ist schädlich - persönliche Schutzausrüstung tragen.
10. Ersetzen Sie die Gummimembran _und N 2 Gasleitung auf den Rundkolben, und nehmen Sie die Rückflusskühler.
11. Schalten Sie die Hitze und rühren bei 500 Upm für 2 Stunden.
12. Den Rundkolben zu entfernen aus dem Isomantel Heizung und dekantieren restliche Flüssigkeit, während mit einem starken Magneten gegen den Boden des Kolbens, um die Magnetit-Gel zu behalten statt.
    VORSICHT! Griff der starken Magneten mit äußerster Vorsicht, um Schäden oder Verletzungen zu vermeiden.
13. Erlauben Magnetit-Gel an der Luft trocknen O / N (optional).

2. Reinigung von Magnetit Gel

1. In 40 ml Hexan in den Rundkolben, um die Magnetit-Gel auflösen
   VORSICHT! Hexan schädlich ist - persönliche Schutzausrüstung tragen und die Arbeit in einem Abzug.
2. Verwenden einen Scheidetrichter mit 40 ml entgastem H _{2 O,} um restliches H _{2 O} zu entfernen from die Magnetit-Lösung.
   1. Gießen Sie langsam die Magnetit-Lösung auf die _H 2 O im Scheidetrichter und schwenken Sie die Zwei-Phasen-Flüssigkeit für 5 Minuten.
   2. Ablassen und entsorgen Sie die untere wässrige Fraktion.
   3. Langsam 40 ml entgastem _H 2 O in die Trenntrichter, so dass er siedelt unter dem Magnetit-Lösung und leicht schwenken und Drain wie zuvor.
   4. Wiederholen, um ein drittes Mal zu waschen.
3. Bringen Magnetit-Lösung, um einen Erlenmeyerkolben, fügen Sie ein paar Spatel im Wert von wasserfreiem Natriumsulfat, und wirbeln, um alle verbleibenden Rest _H 2 O aus dem Magnetit-Lösung zu entfernen.
4. Filtern der Magnetit-Lösung durch 1 & mgr; m-Filterpapier in einem Filtertrichter, um das Natriumsulfat und restliches H _{2 O} zu entfernen
   HINWEIS: Vakuum-Unterstützung empfohlen.
5. Übertragen des Magnetits Lösung auf eine 50 ml Verdampferkolben und mit einem Rotationsverdampfer, um das Hexan zu verdampfen2 h unter den folgenden Bedingungen: moderate Drehzahl, Vakuum angelegt, Verdampferkolben in einem 50 ° C Wasserbad, und 24 ° C Wasserzirkulations durch den Kondensator.
   HINWEIS: Wahlweise speichern die Magnetit-Gels vor der mit PLGA Beschichtung.

3. Beschichtung von Magnetit-Nanopartikel mit PLGA Shell

1. Aufzulösen 3,60 g PLGA (75/25 Gemisch) in 240 ml Ethylacetat, um eine 1,5% (m / v) Lösung zu schaffen. ACHTUNG: Ethylacetat schädlich ist - persönliche Schutzausrüstung tragen und die Arbeit in einem Abzug.
2. Aufzulösen 25,00 g Pluronic F-127 in 500 ml entgastem H _{2 O} unter Verwendung eines Magnetrührers, um eine 5,0% (m / v) Lösung zu schaffen.
   HINWEIS: Pluronic F-127 ist ein nicht-ionisches amphiphiles Blockcopolymer, das als biokompatibles Tensid wirkt. Es hilft, die Öl-in-Wasser-Emulsion in Schritt 3.3.2 stabilisieren.
3. Unter Verwendung eines Mikros, sammeln die Magnetit-Gel in sechs 0,040 g-Proben im gewogenen Glasfläschchen. Perform die folgende Beschichtung und Waschprozess für jedes Aliquot.
   HINWEIS: Die Aliquots erforderlich, effiziente Handhabung und magnetisches Dekantieren, die Reinheit und die Ausbeute zu maximieren, wird bei gleichzeitiger Minimierung Abbau vor der Gefriertrocknung der in Schritt 4 zu gewährleisten.
   1. Fügen Sie ein 0.040 g Aliquot der Magnetit-Gel und 40 ml des PLGA-Lösung, um einen Kunststoffbecher und beschallen in einem Ultraschall-Reiniger für 10 Minuten.
   2. 80 ml der Pluronic Lösung der Kunststoffbecher gegossen und sofort mit einem Labormischer emulgieren bei der höchsten Einstellung für 7 Minuten, um die PLGA-Beschichtung auf den magnetischen Nanopartikel als eine Öl-in-Wasser-Emulsion zu bilden.
   3. Unmittelbar verdünnen SPION-Lösung in 1 l deionisiertem _H 2 O und beschallen 1 h in einer chemischen Abzugshaube, um das Ethylacetat zu verdampfen.
   4. Legen Sie einen starken Magneten neben dem SPION-Lösung und rühren Sie bis bräunlich SPIONs am Magnet zu sammeln.
      Hinweis: Es kann notwendig sein, um Unterbrechungen für mehrere Stunden rührens vor der Lösung wird weißlich anzeigt, dass die meisten der SPIONs wurden gesammelt.
   5. Man dekantiert die wäßrige Lösung unter Beibehaltung der SPIONs in das Becherglas mit den Magneten.
   6. Wie folgt dreimal waschen Sie die SPIONs.
      1. Suspendieren die SPIONs in 1 l deionisiertem _H 2 O.
      2. Beschallen den SPION-Lösung für 20 Minuten.
      3. Legen Sie einen starken Magneten neben dem SPION-Lösung und rühren Sie bis bräunlich SPIONs am Magnet zu sammeln. Es kann notwendig sein, um intermittierend rühre mehrere Stunden, bevor die Lösung klar wird das anzeigt, daß die meisten der SPIONs wurden gesammelt.
      4. Man dekantiert die wäßrige Lösung unter Beibehaltung der SPIONs in das Becherglas mit den Magneten.
4. Sammeln Sie die SPIONs aus jeder der sechs Magnetit-Gel-Aliquoten synthetisiert in einem einzigen gewogenen Glasfläschchen als wässrige Suspension. Optional dekantieren überschüssiges Wasser magnetisch, wie gebraucht.

4. Freeze--TROCKENTUNNEL der SPIONs

1. Frieren Sie den SPION-Lösung.
2. Gefrierzutrocknen den SPION Lösung O / N in einer Gefriertrocknungsanlage.
3. Wiegen die gefriergetrockneten SPIONs. Gefriergetrocknete SPIONs kann bei -20 ° C gelagert, bis sie zur Markierung von Zellen verwendet werden.
   HINWEIS: Lagerung bei -20 ° C drastisch reduziert Abbaukinetik und erhöht die Haltbarkeit.

5. Markierung von Zellen mit SPIONs

1. Aussetzung eines Aliquots SPIONs in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einer Konzentration von 40 mg / ml und mit Ultraschall 30 Min.
2. Fügen SPION Lösung auf eine fast konfluente Kolben mit Zellen bei einer Konzentration von 5 & mgr; l / ml Zellkulturmedium. Stellen Sie sicher, gleichmäßige Verteilung durch sanftes Schütteln der Flasche.
3. Die Zellen für 16 Stunden bei 37 ° C.
4. Vorsichtig absaugen Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
5. Sammeln magnetisch markierten Zellen und verwenden für Experimente.
6. Unbenutzte SPION Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden und sollte unsinnerhalb von wenigen Monaten ed. Beschallen 30 Minuten vor jedem Gebrauch.

Ergebnisse

Magnetitnanopartikeln sind ungefähr 10 nm im Durchmesser infolge Rühren eine wässrige Lösung von Eisen (III) -chlorid und Eisen (II) -chlorid-tetrahydrat bei 50 ° C und 1000 rpm (Abbildung 1). Diese Ergebnisse zeigen, gelungene Synthese aus Magnetit-Nanopartikel. Es ist wichtig, die Größe und die Form der magnetischen Nanopartikel aus einer kleinen Probe der Charge entnommen, wenn man versucht, die Synthese zum ersten Mal zu überprüfen. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist die bevorzugt...

Diskussion

Wie bei jedem Nanopartikelsynthese-Protokoll, die Reinheit der Reaktionschemikalien ist kritisch zur Erzielung einer hohen Qualität SPIONs das minimale zytotoxische Effekte haben wird. Es ist daher wichtig, um sehr reine Reagenzien einschließlich Ölsäure (≥99%), Eisen (II) -chlorid-Tetrahydrat (≥99.99%), Eisen (III) -chlorid (≥99.99%), Ethylacetat kaufen (HPLC-Qualität, ≥99.9% ), Hexan (HPLC grade, ≥97.0%) Ammoniumhydroxid (≥99.99%) und Natriumsulfat (≥99.0%). Es ist von besonderer Bedeutung für sehr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis	Sigma-Aldrich	338818-100ML	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Dreschel bottle, 500 ml	Ace Glass	5516-16
Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9%	Sigma-Aldrich	650528-1L	Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint	Sigma-Aldrich	Z515558	For use with rotoevaporator
Filter paper, 3 cm dia, grade 1	Fisher	09-805P	For use with glass filter funnel
Glass beakers, 1 L	Fisher	FB-101-1000	For washing SPIONs
Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL	Fisher	K954100-0344
Glass vial caps	Fisher	03-391-46	For use with glass vials
Glass vials, 2 ml	Fisher	03-391-44	For collecting magnetite gel & SPIONs
Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC)	Sigma-Aldrich	34859-1L	Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758	Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis	Sigma-Aldrich	380024-5G	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis	Sigma-Aldrich	451649-1G	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Isomantle heater, 500 mL	Voight Global	EM0500/CEX1
Laboratory mixer	Silverson	L5M-A
Lyophilizer	Labconco	7670520
Microspatulas	Fisher	21-401-25A	For transfering magnetite gel
NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in	Amazing Magnets	C1000H-M	Very strong magnet, handle with care
Oleic acid, ≥99% (GC)	Sigma-Aldrich	O1008-5G	Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment
Overhead stirrer	IKA	2572201
Overhead stirrer clamp	IKA	2664000	For use with overhead stirrer
Overhead stirrer H-stand	IKA	1412000	For use with overhead stirrer
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023
Plastic beakers, 250 ml	Fisher	02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend)	Purac	PDLG 7502	PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer
Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	P2443-250G
PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia	SciQuip	SP4018
PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle	Monmouth Scientific	PTFE Vessel Adaptor A480	For use with PTFE expandable blade paddle
Recirculating chiller	Clarkson	696613	For use with rotoevaporator
Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm	Ace Glass	5997-133
Rotoevaporator	Clarkson	216949
Rubber septa, fits 24/40	Ace Glass	9096-56
Separatory funnel with stopper, 250 ml	Fisher	10-438E
Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular	Sigma-Aldrich	239313-500G
Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml	Ace Glass	6948-16
Ultrasonic cleaner perforated pan	Fisher	15-335-20A	For use with ultrasonic cleaner
Ultrasonic cleaner, 2.8 L	Fisher	15-335-20
Vacuum controller	Clarkson	216639	For use with rotoevaporator (optional)
Vacuum pump	Clarkson	219959	For use with rotoevaporator