Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

Zusammenfassung

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Zusammenfassung

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H₂O₂ into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H₂O₂ compared to a no H₂O₂ control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H₂O₂. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Einleitung

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress^1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics^5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway^4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)^1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway¹⁰. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin¹¹. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)¹², which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway¹³. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin¹¹.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa¹². Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent¹². Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions¹⁴. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time¹, or oxidative stress disc diffusion assays¹⁵. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H₂O₂ and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

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Protokoll

1. Herstellung von Kulturmedien, Antibiotika, und 2- [2-Nitro-4- (trifluormethyl) benzoyl] -1,3-cyclohexandion (NTBC)

1. Machen LB-Brühe (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl in H _{2 O) und} Aliquot in angemessenen Mengen. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren. Lagerung bei Raumtemperatur.
2. Auf 100 ml LB-Agar (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl, 1,5% Agar _in H 2 O) in 250 ml-Kolben. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. Stellen Sie sicher, dass der Agar wird vor dem Gießen in Platten geschmolzen.
   HINWEIS: Kolben, die 100 ml LB-Agar-Platten werden 4 ergeben. Die Menge des LB-Agar kann verändert werden, um der Anzahl von Platten für den Assay benötigt entsprechen.
3. Machen PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na _{2 HPO 4,} 2 mM KH _{2 PO 4)} ^16. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren oder Filtration und bei Raumtemperatur lagern.
4. Bereiten Sie die Antibiotika-Stammlösungen für Gentamicin, Kanamycin, eind Tobramycin.
   1. Bereiten entsprechenden Antibiotikum stock Konzentrationen für P. aeruginosa-Stämme, die 100 mg / ml Gentamicin, 30 mg / ml Kanamycin und 10 mg / ml Tobramycin. Lösen Sie den Antibiotika in Wasser, Filter zu sterilisieren (0,2 um), und bei 4 ° C. Ändern Sie die Antibiotika und Konzentrationen je nach Bakterium untersucht.
5. Bereiten Sie die NTBC Stammlösungen. Auflösen 10 mg NTBC in 400 ul DMSO. Dies ergibt eine Konzentration von 75,9 mM NTBC. Shop NTBC Stammlösungen bei -20 ° C. Tau-Lösungen bei Raumtemperatur nach Bedarf.
   HINWEIS: Verschiedene Quellen von NTBC haben Unterschiede in der Löslichkeit. Bestimmen Sie das passende Fahrzeug, in dem die NTBC basierend auf den Empfehlungen des Herstellers zu lösen und anpassen Schritt 1.5 entsprechend.

2. NTBC Titrationen von Bakterienstämmen

1. Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme zu testen. 2 ml LB-Brühe zu 16 x 150 mm Teströhrchens (einer pro-Stamm) und zu impfen mit 1 isoliert Kolonie aus jedem Stamm. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Belüftung auf einem Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator.
2. Am folgenden Tag vorzubereiten Titrationen von NTBC in LB-Brühe. Starten Sie mit einem Bereich von 0 bis 900 um NTBC da verschiedene Stämme haben Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber NTBC.
   1. 1 ml LB-Medium auf 4 bis 5 Teströhrchen (16 x 150 mm) pro Stamm.
   2. Fügen Sie den NTBC Stammlösung (75,9 mm), um die Teströhrchen (16 x 150 mm) in einem Bereich von Konzentrationen. Siehe Tabelle 1 für NTBC Konzentrationen und entsprechende Aktienvolumen auf 1 ml LB-Brühe hinzufügen.
3. Messen Sie die _OD600 der Übernachtkulturen. Kulturen vor der Einnahme von OD ₆₀₀ Lesungen zu beseitigen in den Medien präsent pyomelanin waschen.
   1. Die Kulturen durch Zentrifugieren von 1 ml der Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 2 min waschen. Entfernen Sie den Überstand und keine lose pelletierten Zellen miteine Mikropipette und Resuspendieren der festen Zellpellet in 1 ml LB
4. Impfen Titration Röhrchen bei OD ₆₀₀ 0.05. Berechnung der Menge der Kultur gewaschen erforderlich, um die Rohre anzuimpfen.
   HINWEIS: Verwenden Sie die gewaschenen Kulturen für Impfungen seit pyomelanin sollte nicht vorhanden sein.
5. Die Titration Rohre etwa 24 h bei 37 ° C inkubieren mit Belüftung unter Verwendung einer Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator.
6. Fotografieren Sie die Titration Rohre und vergleichen Pigmentproduktion innerhalb und zwischen den Stämmen, die Menge an NTBC bestimmen, die für MIC und oxidativer Stress-Tests zu verwenden. Verwenden OD ₆₀₀ Lesungen, die Menge an pyomelanin in zellfreien Kulturüberstand zu bestimmen, und um die Zelldichte zu bestimmen.
   HINWEIS: Der OD _{600-Verhältnis} von pyomelanin in Kulturüberstand von Zellen berechnet werden kann, um Unterschiede in pyomelanin Produktion nach Behandlung mit NTBC quantifizieren.

3. Antibiotika Mindest InhibiTory-Konzentration (MIC) Assay in 96-Well-Platten

1. Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme in LB mit und ohne NTBC getestet werden.
   HINWEIS: Dieses Protokoll wird mit dem repräsentativen Niveau von 300 um NTBC beschrieben. Die angemessene Höhe der NTBC verwendet werden in Schritt 2.6 festgelegt.
   1. In 300 um NTBC bis 2 ml LB Fügen Sie eine gleichwertige Menge von Vehikel (DMSO) auf 2 ml LB für die kein NTBC Zustand.
   2. Mit einer sterilen Zahnstocher, zu impfen Rohre mit einem isolierten Bakterienkolonie. Es wird eine Kultur mit NTBC und einer Kultur ohne NTBC für jeden Stamm sein. Inkubieren über Nacht bei 37ºC unter Belüftung mit einem Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator.
2. Am nächsten Tag machen LB + NTBC und LB + DMSO Stammlösungen für die Einrichtung des MIC-Assay. Hinzufügen NTBC bei einer Konzentration von 600 & mgr; M, wie dies zweifach verdünnt, als Impfmaterial zugesetzt werden, wodurch man eine Endkonzentration von 300 uM.
   1. Einem antibi testenOhr für einen Stamm, fügen 600 um NTBC bis 2 ml LB und mischen, um den NTBC Stammlösung zu machen. Fügen Sie eine gleichwertige Menge von Vehikel (DMSO) auf 2 ml LB und mischen, die keine NTBC Stammlösung zu machen. Mit diesen Lösungen für die Erstellung Antibiotikum Stammlösungen als auch für den Aufbau der Verdünnungsreihe in 96-Well-Platten.
      HINWEIS: Die Stammlösung Formulierungen zusätzliche Lösung für Pipettierfehler-Konto zu erhalten. Die Stammlösungen kann nach oben oder unten skaliert, wie abhängig von der Anzahl von Antibiotika und getesteten Stämmen erforderlich.
3. Bereiten Sie die Antibiotika-Lösungen in den LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen.
   HINWEIS: Die Konzentration des Antibiotikums in diesen Lösungen sollte das Doppelte der gewünschten Endkonzentration sein. Genug Lösung sollte, um 100 & mgr; l bis vier Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen übertragen.
   1. Bereiten Gentamicin +/- NTBC Stammlösung bei 64 ug / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen Sie 0,288 & mgr; l von Gentamicin Lager (100 mg / ml) auf 450ul LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösung.
      HINWEIS: Die maximale Konzentration von Gentamicin für P. aeruginosa PAO1 beträgt 32 & mgr; g / ml.
   2. Machen Sie das Kanamycin +/- NTBC Stammlösung bei 256 ug / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen 3,84 & mgr; l Kanamycin Lager (30 mg / ml) und 450 & mgr; l LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen.
      HINWEIS: Die maximale Konzentration von Kanamycin für P. aeruginosa PAO1 beträgt 128 ug / ml.
   3. Bereiten Tobramycin +/- NTBC Stammlösung bei 8 & mgr; g / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen 0,36 & mgr; l von Tobramycin Lager (10 mg / ml) und 450 & mgr; l LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen.
      HINWEIS: Für P. aeruginosa PAO1, die maximale Konzentration von Tobramycin beträgt 4 & mgr; g / ml.
      HINWEIS: Die Antibiotika und Konzentrationen eingestellt, damit das Bakterium getestet werden kann.
4. Füge 100 ul je 2x Antibiotikalösung zu vier Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Legen Sie diese Lösungen in der Reihe A. Für example sollte Gentamycin in den A1 bis A4 platziert werden sollte Kanamycin in A5 bis A8 angeordnet werden und Tobramycin sollte A9 bis A12 gelegt werden. Siehe 1A für ein Schaltbild einer 96-Well-Platte einzurichten.
   HINWEIS: Mehrere Antibiotika kann in einer Platte getestet werden, aber nur ein Stamm sollte pro Platte getestet, um das Risiko einer Kreuzkontamination von anderen Stämmen zu beseitigen.
5. In 50 ul der LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösung, um Zeilen B bis H der 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass eine Platte LB + NTBC und eine Platte LB + DMSO. Siehe 1A.
   1. Verwenden Sie LB + NTBC für die Antibiotika in LB + NTBC. Verwenden Sie LB + DMSO für die Antibiotika in LB + DMSO.
6. Mit einer Mikroführen zweifachen Reihenverdünnungen der Antibiotika durch die Übertragung von 50 ul der Lösung von Reihe zu Reihe A B. Mischen Sie die Lösung, ändern Sie die Pipettenspitzen, und übertragen Sie 50 ul der Lösung von Reihe B C. Wiederholen Sie zum zu rudern die remaining Zeilen. Nach Verdünnen Reihe G, entfernen Sie 50 ul der Lösung aus dieser Reihe und entsorgen. Verwenden Reihe H als ohne Antibiotika-Steuerung für das Bakterienwachstum. Siehe Abbildung 1B.
   HINWEIS: Jedes der gut in den Reihen A bis G enthält nun 50 ul von Antibiotika in LB + NTBC oder LB + DMSO bei 2X die endgültige gewünschte Konzentration. Row H enthält LB + NTBC oder LB + DMSO ohne Antibiotika.
7. Messen Sie die _OD600 der Übernachtkulturen. Alle Kulturen vor der Einnahme von OD ₆₀₀ Lesungen in den Medien präsent pyomelanin beseitigen waschen.
   1. Die Kulturen durch Zentrifugieren von 1 ml der Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 2 min waschen. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und Zellpellet in 1 ml LB
8. Verdünnen Sie die Übernachtkulturen zu 2.75x10 ⁵ CFU / ml in LB.
   HINWEIS: Es sei angenommen, dass eine OD _600-Einheit ist das Äquivalent von 1x10 ^{& sup9; CFU} / ml von P. aeruginosa. OD, um CFU / ml Umwandlungen können d werdenifferent in anderen Bakterien.
9. Dann werden 50 ul der verdünnten Bakterienkultur zu dem geeigneten gut.
   HINWEIS: Kulturen in NTBC wachsen sollten an die Vertiefungen, die NTBC und Kulturen in DMSO wachsen sollten an die Vertiefungen, die DMSO hinzugefügt werden, hinzugefügt werden. Siehe Abbildung 1B.
   1. In Bakterien drei Brunnen für jeden Stamm und Antibiotikakonzentration. Dann werden 50 ul LB dem vierten gut, um als Kontrolle für die bakterielle Kontaminierung zu handeln. Siehe Abbildung 1B.
   2. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Mikropipette, um die Brunnen zu impfen. Sicher, dass die Pipettenspitzen sich in der Nähe der Boden der Vertiefungen beim Hinzufügen Inokulum um eine Kontamination benachbarter Vertiefungen zu verhindern.
      HINWEIS: Durch Hinzufügen Bakterienkultur in die Vertiefungen wird der Antibiotikum und NTBC Konzentrationen zu verdünnen zweifach.
10. Decken Sie die 96-Well-Platten mit Parafilm und Inkubation etwa 24 Stunden bei 37 ° C. Inkubieren Platten mit 96 Vertiefungen statisch in einem Luft Inkubator.
11. Untersuchendie Platten für das Bakterienwachstum in den Vertiefungen. Die MHK ist die niedrigste Konzentration des Antibiotikums in der kein Bakterienwachstum wird für alle drei Wiederholungen jedes Stammes gesehen.
    1. Optisch prüfen Sie die Platte für das Wachstum oder lesen unter Verwendung eines Plattenlesegerät-Set bis zu einer OD _600.

4. Spot-Platten-Assay für die oxidative Stressreaktion

1. Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme in LB mit und ohne NTBC wie in Schritt 3.1 beschrieben, getestet werden.
2. Am nächsten Tag vorzubereiten LB-Agarplatten, die H _{2 O 2} als oxidative Stressor. Eine Reihe von _H 2 O _{2 -Konzentrationen} von 0 auf 1 mM ist ein guter Ausgangspunkt.
   1. Schmelzen Sie die LB-Agar-Kolben. Kühles Medium auf etwa 50 ° C bei Raumtemperatur.
   2. Hinzuzufügen H _{2 O 2} direkt an den gekühlten Medien in den gewünschten Konzentrationen. Swirl Flaschen zu mischen. Siehe Tabelle 2 für die Konzentration von H _{2 O 2}und Volumina konzentrierter H _{2 O 2} zu. Diese Werte beziehen sich auf 100 ml LB-Agar basiert.
   3. Platten gießen unmittelbar nach Zugabe von H _{2 O 2} und Flamm der Oberfläche, um Blasen zu entfernen. Die Ausbeute beträgt 4 Platten pro 100 ml LB-Agar. Markieren die Platten mit dem H _{2 O 2 -Konzentration.}
   4. Legen Sie die Platten in einer biologischen Flow-Haube mit dem Lüfter läuft für 30 Minuten unbedeckt, um überschüssige Feuchtigkeit aus den Platten zu entfernen.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Platten am selben Tag sie hergestellt werden. Bei Nichtbeachtung kann zu inkonsistenten Daten führen.
      HINWEIS: Oxidativer Stressfaktoren wie Paraquat für H _{2 O 2} in diesem Test ausgewechselt werden. Die für andere oxidative Stressoren verwendeten Konzentrationen kann anders als die für _H 2 O 2 verwendet wird.
3. Waschen Sie und Messen der OD _{600 der} Übernacht-Kulturen wie in Schritt 3.7 beschrieben.
4. Normalisieren die _OD 600 von der ganzen Nacht cultures auf den niedrigsten Wert für die Menge der Stämme getestet. P. aeruginosa hat im allgemeinen eine OD ₆₀₀ von etwa 2,5, wenn über Nacht in LB + NTBC oder LB + DMSO gewachsen.
   1. Bestimmung der Kulturvolumen benötigt wird, um die Kultur auf die niedrigste OD ₆₀₀ in einem Gesamtvolumen von 1 ml zu verdünnen. Zum Beispiel, wenn eine Kultur eine OD ₆₀₀ von 3 und der niedrigste OD ₆₀₀ für die Menge der Stämme ist 2.5, die folgende Rechnung aus: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen platziert werden.
   2. Berechnung der Menge an LB + NTBC (300 uM) oder LB + DMSO benötigt, um das Kulturvolumen auf 1 ml zu bringen. Zum Beispiel in Schritt 4.4.1 wird die Menge an LB + NTBC oder LB + DMSO zu der Kultur gegeben wäre 0,167 ml (1 ml Gesamtvolumen - 0.833 ml Kultur) sein. Machen Stammlösungen LB + NTBC und LB + DMSO für diese Verdünnungen auf der Basis des zum Verdünnen aller Stämme benötigte Volumen zu verwenden.
   3. Mischen Sie die Kultur und LB + NTBC oder LB + DMSO durch Vortexen.
5. Kulturen in einer konstanten Konzentration von NTBC oder DMSO zu erhalten, auszuführen zehnfache serielle Verdünnungen der normalisierten Übernachtkulturen in PBS + NTBC oder PBS + DMSO.
   1. Machen Stammlösungen von PBS + NTBC und PBS + DMSO. Für einen Satz von Verdünnungen für einen Stamm, mix 300 um NTBC oder eine gleichwertige Menge von DMSO mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 720 & mgr; l zu ergeben. Skalieren Sie diese Aktien nach oben oder unten, je nachdem, wie viele Stämme getestet.
   2. Label-Mikrozentrifugenröhrchen für 10 ^{-1 bis 10} -7 Verdünnungsreihen. Werden 90 & mgr; l PBS + NTBC oder PBS + DMSO in die entsprechenden Tuben. Verwenden PBS + NTBC für die Stämme in LB + NTBC gewachsen und benutzen PBS + DMSO für die Stämme in LB + DMSO gewachsen.
   3. Zugabe von 10 & mgr; l der Kultur in die entsprechende ¹⁰ -1 Verdünnungsröhrchen. Vortexen und übertragen 10 ul der ¹⁰ -1 Verdünnung auf ¹⁰ -2 Verdünnungsröhrchen. Wiederholen, bis alle Verdünnungen wurden perfoRMED. Ändern Pipettenspitzen zwischen Verdünnungen.
6. Spot 5 ul der 10 ^{-3 bis 10} -7 Verdünnungen auf LB + H _{2 O 2} Platten in doppelter Ausführung für jeden Stamm. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, wenn Flecken überzogen von den meisten zu verdünnen, um mindestens verdünnter ⁽¹⁰ -7 bis 10 ^-3). Nicht kippen oder neigen Sie die Platte, bis die Flüssigkeit in die Platte getrocknet.
7. Die Platten für 24-48 h bei 37 ° C (Luftinkubator) in Abhängigkeit von der Belastung.
   HINWEIS: P. aeruginosa PAO1 wird recht großen Kolonien auf LB nach 24 Stunden Inkubation haben. Stämmen inkubieren, bis sie Kolonien etwa die gleiche Größe wie PAO1.
8. Fotografieren Sie die Platten unter Verwendung einer CCD-Kamera über einem transluminator. Bearbeiten Sie optional die Fotos für Kontrast und Ernte auf die gleiche Größe. Zählen die Anzahl der Kolonien in jedem Spot zu Veränderungen in der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress zu bestimmen.

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Ergebnisse

NTBC Titrationen

Die NTBC Titrationen wurden verwendet, um festzustellen, ob NTBC konnte pyomelanin in P. reduzieren aeruginosa, und auch die Konzentration von NTBC, die eliminiert oder reduziert pyomelanin Produktion für die Verwendung in weiteren Assays identifizieren. Es können Variationen in der Höhe der pyomelanin in verschiedenen Replikationen hergestellt sein, aber allgemeine Trends konstant bleiben. Die NTBC Titrationsassay könnte auch modifiziert werden, um and...

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Diskussion

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates¹² (Figure 2). The...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble in H2O.  Filter sterilize.