Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Zusammenfassung

The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Zusammenfassung

Untersuchung der Organogenese in utero ist eine technisch anspruchsvolle Prozess in Plazentatiere aufgrund der Unzugänglichkeit der Reagenzien an Embryonen, die in der Gebärmutter entwickeln. Ein neu entwickeltes ex vivo aufrecht Tröpfchenkulturverfahren bietet eine attraktive Alternative zum Studium in utero durchgeführt. Die ex vivo Tröpfchen Kultur bietet die Möglichkeit, zu prüfen, und zelluläre Wechselwirkungen und diverse Signalwege durch Verwendung verschiedener Blockierungs- und aktivierende Verbindungen zu manipulieren; Zusätzlich können die Wirkungen der verschiedenen pharmakologischen Reagenzien auf die Entwicklung von spezifischen Organen ohne unerwünschte Nebenwirkungen der systemischen Arzneimittelabgabe in utero sucht werden. Im Vergleich zu anderen in vitro-Systemen, die Tropfenkultur ermöglicht nicht nur die Fähigkeit, dreidimensionale Morphogenese und Zell-Zell-Interaktionen zu studieren, die in Säugerzelllinien wiedergegeben werden kann, sondern auch deutlich weniger reagents als andere ex vivo und in vitro-Protokolle. Dieses Papier zeigt richtige Maus fetalen Organ Dissektion und aufrecht Tröpfchenkultur-Techniken, gefolgt von ganzen Organs Immunfluoreszenz, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu demonstrieren. Die ex vivo Tröpfchenkulturverfahren ermöglicht die Bildung von Organarchitektur vergleichbar zu dem, was in vivo beobachtet und kann genutzt werden, um auf andere Weise schwierig zu Studienprozesse durch embryonale Letalität in vivo-Modellen untersucht werden. Als Modell-Anwendungssystem wird ein niedermolekularer Inhibitor verwendet werden, um die Rolle der Vaskularisation in testikulären Morphogenese sondieren. Diese ex vivo Tröpfchenkulturverfahren ist erweiterbar auf andere fetale Organsystemen wie Lungen und möglicherweise andere, obwohl jedes Organ müssen ausgiebig untersucht werden, um alle organspezifische Modifikationen des Protokolls zu bestimmen. Diese Organkultursystem bietet Flexibilität bei Experimenten mit fetalen Organen und führt obtained mit dieser Technik hilft Forschern Einblicke in die fetale Entwicklung.

Einleitung

Organregeneration in vivo beim Menschen ist sehr begrenzt; daher, Tissue Engineering, die Entwicklung von Geweben und Organen aus einzelnen Zellen durch eine Vielzahl gespendet, wird immer eine attraktive potenzielle Therapie für Organersatz. Doch für diese therapeutische Strategie, um erfolgreich zu sein, Faktoren und zellulären Interaktionen in Morphogenese der Orgel beteiligt sind, müssen gründlich untersucht werden, und gut verstanden. Aufgrund der Unfähigkeit zur Entwicklung spezifischer Organe mit herkömmlichen Ansätzen zu untersuchen, haben die Forscher alternative gesamten Embryo oder ganze Organkulturen gedreht. Kalaskar et al. ¹ haben, in utero Entwicklung gezeigt, dass ex vivo ganze Embryokultur liefert vergleichbare Ergebnisse (in 58% der kultivierten Embryonen), was darauf hindeutet, dass die Ex-vivo-Kulturverfahren sind eine praktikable Alternative zur Organstudien.

Eine individualisierte Organkultursystem, wie dieses ex vivo droplet Kultursystem ermöglicht eine ganze Organ Analyse unabhängig von systemischen Wirkungen, während eine Betätigung eines spezifischen Signalweg oder zellulären Wechselwirkungen durch Zugabe pharmakologische Reagenzien oder Antikörpern. Traditionell wurde die Untersuchung der fetalen Organentwicklung, transgene und Knockout-Maus Technologien beschränkt, die neben pharmakologische Reagenzien maternal geliefert. Allerdings gibt es technische Probleme im Zusammenhang mit diesen Techniken und Behandlungen in vivo; esten betrifft kreisen um die Effekte der Beeinflussung verschiedener Organe gleichzeitig, was oft in der embryonalen Letalität. Eine weitere Sorge der Studien manipulieren fetale Entwicklung pharmakologisch ist der mütterliche Einfluss von Drogen auf die embryonale Entwicklung in utero (zB mütterlichen Stoffwechsel des Medikaments, bevor sie den Embryo erreicht), und wenn eine solche Reagenzien können durch die plazentagängig ist.

Die ganze Organkultur-Technik beschrieben,Hier wurde aus einem Protokoll zuerst durch Maatouk et al. ^2, bei dem ganze fetalen Gonaden in ex vivo aufrecht Tröpfchenkulturen inkubiert angepasst. Ein wesentlicher Vorteil des Kultivierens fetalen Gonaden ist, dass niedermolekulare Inhibitoren können leicht Zugriff auf das ganze Organ durch einfache Diffusion. . DeFalco et al haben gezeigt, dass die Nutzung dieser ex vivo Tröpfchenkulturverfahren in Verbindung mit niedermolekularen Inhibitoren können verwendet werden, um zu studieren Signalprozessen und Interaktionen während Gonadenreifung ³ auftretende werden; Diese Verfahren würden aufgrund technischer Herausforderungen schwierig, in vivo zu untersuchen (zB Durchgang von Medikamenten durch die Plazenta oder Letalität, die mehrere Organe mit genetischen oder pharmakologischen Ansätzen).

Die Tropfenkultur ist nicht nur eine Verbesserung in bestimmten Aspekten auf die in utero Experimente, aber es ist auch eine Verbesserung gegenüber in vitro und ex vivo Systemen. Die Verwendung von Zelllinien zur Morphogenese zu studieren, ist äußerst schwierig, da sie nicht über die verschiedenen Zelltypen, nicht über eine kritische extrazellulären Matrix (ECM) Komponenten, die die Bildung von Organarchitektur zu ermöglichen, und kann Artefakte in Signalkaskaden aufweisen. Obwohl Tissue Engineering hat signifikante Verbesserungen bei der Schaffung von Gerüsten Simulation ECM gemacht, der Mangel an Wissen in Bezug auf die Signale von jedem Zelltyp während der Organogenese erforderlich macht es schwierig, ein Organsystem in vitro zu bauen. Andere ex vivo-Systeme wurden bereits eingerichtet worden, um die Organogenese zu studieren, oder genauer gesagt die Morphogenese und sehr erfolgreich für die Bildgebung von fötalen Organen in Agar ⁴ gewesen, Transwells ^5, Filter ^{6 und} anderen Gerüst Matrizen ^7,8. Der Vorteil des Tröpfchens Kultursystems ist, dass es die Untersuchung der Morphogenese durch Bereitstellen der Fähigkeit, weniger Reagenzien, die o sind, zurückgegriffenften teuer, sondern auch was die Orgel Oberflächenspannung, die wichtig für das Wachstum und Signalisierungsfunktionen ^{9 ist.}

Bei der Maus findet Anfangs Hoden Morphogenese zwischen embryonalen (E) inszeniert E11.5 und E13.5; diese Stufen umfassen die optimale Zeitfenster für die Prüfung Faktoren, die geschlechtsspezifische Differenzierung beeinflussen. Unter den kritischen Prozessen, die während testis Bildung auftreten, sind die Erzeugung von Testis Kabel Architektur und die Bildung einer Hoden-spezifische vaskuläre Netzwerk. Verwendung dieses ex vivo ganze Organ Tröpfchenkultursystem ist in der Lage, eine männlich-spezifische Vaskularisierung verändern und hemmen testis Morphogenese durch die Verwendung eines niedermolekularen Inhibitor blockiert die Aktivität der Rezeptoren für vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF); VEGF-vermittelte vaskuläre Remodeling ist entscheidend für die Hodenentwicklung ^10-12. Diese Technik kann erfolgreich auf andere Organe angewendet werden und kann bestimmten ZeitzielFenstern der Entwicklung. Ganzkörper-Halterung Organ Bildgebung ermöglicht die Visualisierung von lebenswichtigen Strukturen sowie strukturelle und zelluläre Veränderungen nach der Verabreichung verschiedener Inhibitoren resultieren. Wichtig ist, dass dieses System den Vorteil, dass der Forscher können potentielle verwirrende Wirkungen von Arzneimittelverabreichung mütterlichen oder systemischen Störungen beim in vivo Zielgen Strategien umgehen. Somit kann diese ganzen Organs ex vivo Tröpfchenkultursystem die Fähigkeit, die Wechselwirkung und die Signalisierung, die spezifisch in bestimmte Organe während der fetalen Entwicklung auftreten Verständnis deutlich zu verbessern.

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Protokoll

Alle Mäuse, die in diesen Studien verwendet wurden, waren CD-1-Mäuse von Charles River Laboratories erhalten. Vorherige Kulturexperimenten auch andere Stämme, wie C57BL / 6J (Daten nicht gezeigt) durchgeführt, jedoch jeder Stamm verwendet werden. Pregnant erwachsenen Frauen waren etwa 2-3 Monate alt und wurden durch _CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte und bilaterale Thorakotomie vor Embryoentnahme euthanasiert. Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien untergebracht und experimentelle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Cincinnati Kinder-Hospital Medical Center bestätigt.

1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte

1. Bereiten Sie eine 70% Ethanollösung. Autoklaven entionisiertem Wasser (für die Herstellung befeuchteten Kammern und für die Herstellung / Verdünnung Lösungen). Sterilisieren Dissektion Werkzeugen (Zangen, Scheren und 27 G-Nadel Spritzen) durch Spritzen nach unten mit 70% Ethanol.
2. Bereiten10X Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) mit Calcium und Magnesium (80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g _Na 2 _HPO 4, 2,4 g KH _{2 PO 4,} 6,75 ml 1 M _CaCl 2, 3,75 ml 1 M MgCl ₂ ). Stir in 1 L sterile autoklaviertem Wasser zu lösen und dann mit Filterpapier filtern. Verdünnen Sie das 10-fache mit Wasser auf 1 × PBS zu machen.
3. Wärme inaktivieren fötalem Rinderserum (FBS) bei 55 ° C für 30 min und Filter sterilisieren mit einem 0,22 & mgr; m Spritzenfilter filtriert.
4. Bereiten Sie 38 ml 1X komplettem Kulturmedium (genannt kompletten DMEM, cDMEM), bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% gefiltert hitzeinaktiviertem FBS und 1/100 Verdünnung von Penicillin-Streptomycin Lager. Dies sollte in der Regel frisch verwendet werden, kann jedoch bei 4 ° C für 1 Monat gelagert werden.
5. Rekonstituieren Sie den VEGFR Tyrosinkinase-Inhibitor II (TKI II) in DMSO für eine Stammkonzentration von 5 mg / ml, und verdünnte Aktie mit cDMEM um eine Arbeitslösung zu machen. Die endgültige conZentrierung für diese Untersuchung ist 1,875 & mgr; g / ml in cDMEM. Gemäß den Empfehlungen der Gesellschaft sind Stammlösungen für bis zu 6 Monate bei -20 ° C stabil. Wie für Arbeitslösungen, machen frisch und verwenden Sie am selben Tag.
   Anmerkung: Die Konzentration dieses Wirkstoffs in der Arbeitslösung sollte das Zweifache höher als die gewünschte Endkonzentration (da sie zweifach in dem Tröpfchen zu verdünnen). Zur gleichen Zeit, bereiten Sie das gleiche Volumen cDMEM das gleiche Volumen an DMSO für die "Kontrolle" Behandlung enthält.
6. Bereiten Sie die tail Aufschlussreagenzien (50 mM NaOH, 1 M Tris-HCl [pH 8,0]), die getrennt in destilliertem Wasser.
7. Machen Sie eine 25 uM Lager der XY-PCR-Primer (XY Vorwärts 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'und XY umge 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3') zusammen in Nuklease-freies Wasser.
8. Bereiten 50X TAE-Puffer (242 g Trizma Basis, 57,1 ml Essigsäure, 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,5, und Wasser bis zu 1 l final Volumen). Bereiten 1X TAE Laufpuffer (20 ml 50X TAE verdünnt mit Wasser auf 1 L Gesamtvolumen).
9. Um ein 2,5% Agarose-Lösung (0,625 g Agarose, 0,5 ml 50X TAE-Puffer, 24,5 ml Wasser), Wärme Agarose-Lösung in der Mikrowelle zum Kochen zu schaffen, dann abkühlen lassen, bis etwa 55 bis 65 ° C (in der Lage zu berühren). Nach dem Abkühlen, fügen Sie 2 ul 1% Ethidiumbromidlösung, und gießen Gel.
   VORSICHT! Ethidiumbromid ist mutagen und teratogen; benutzen Sie bitte Nitril-Handschuhen und Sicherheitsprotokoll bei der Handhabung. Alternativ können andere möglicherweise weniger toxisch Gel Trennmittel oder Farbstoffe verwendet werden.
10. Vorbereitung Blocking Solution (PBS mit 0,1% Triton X-100, 10% fötales Rinderserum [FBS] und 3% Rinderserumalbumin [BSA]) für die Immunfluoreszenz.
11. Vorbereitung Waschlösung (PBS mit 0,1% Triton X-100, 1% FBS, 3% BSA) für Immunfluoreszenz.
12. Vorbereitung PBTx (PBS mit 0,1% Triton X-100) für die Immunfluoreszenz.
13. Bereiten Sie die Inkubationskammern für culture. Füllen großen (Durchmesser 100 mm) Petrischalen mit 35 ml autoklaviertem Wasser. Ort in der Nähe, wo Dissektion und Kulturen durchgeführt.

2. Isolierung von fetalen Hoden aus Mus musculus

1. Jeden Morgen Überprüfen Sie die weibliche Maus für vaginale Steckern. Uhr am Tag, an dem die Vaginalpfropf erkannt wird gilt als E0.5. Euthanize der schwangeren weiblichen Maus am E11.5, im Einklang mit genehmigten Tier Protokolle.
2. Sprühen Sie die Mausunterleib mit 70% Ethanol.
3. Öffnen Sie die Bauchhaut und Bauchfell mit einem V-förmigen Einschnitt mit einer feinen Schere und ziehen Sie Klappe des Gewebes zu inneren Organen aus.
4. Auffinden der Eierstöcke an beiden Enden des Uterushorns. Mit einer Schere, schneiden Sie am Eierstock und das Bindegewebe um die Gebärmutter, die die Embryonen aus dem Körper der Mutter zu trennen.
5. Öffnen Sie die Uteruswand durch leichtes Schneiden der Seite gegenüber der Plazenten, Freilegung der Dottersäcke. Achten Sie darauf, puncture Dottersack zu beschädigen oder zu verlieren Embryonen zu vermeiden.
6. Schneiden Sie in der Nähe der Plazenten, um den Embryo enthaltenden Dottersäcke zu entfernen und legen Sie sie in eine Schale mit PBS mit Calcium und Magnesium. Die Anwesenheit von Calcium- und Magnesiumionen wird dazu beitragen, Zelladhäsionsmoleküle, um Gewebe-Architektur erhalten und zu verhindern, dass das Gewebe aus Festhalten an den Dissektion Werkzeuge.
7. Mit einer Pinzette, entfernen Sie den Dottersack und Amnion aus dem Embryo durch vorsichtiges Durchstechen der Dottersack, ein Loch in dem der Embryo kann gleiten erstellen. Sobald der Embryo außerhalb der Dottersack, die Nabelschnur.
8. Von diesem Punkt an, mit einem Mikroskop in einem sterilen Gewebekultur Haube. Entfernen Sie den Kopf des Embryos und entsorgen durch Kneifen mit einer Pinzette auf beiden Seiten des Halses.
9. Entfernen Sie den Schwanz aufnehmen und in neue Mikrozentrifugenröhrchen für die XY-PCR-Analyse zum Geschlecht des Embryos zu bestimmen.
   Hinweis: Obwohl es optimal ist Kultur Gonaden so bald wie möglich nach der Ernte ist es auch poslich, Schwanz-DNA zu entfernen und führen XX / XY Genotypisierung vor Kultur, so dass das Geschlecht jedes Embryos bekannt ist und nur das gewünschte Geschlecht muss kultiviert werden. Während die Genotypisierung getan wird, können Embryonen getrennt gehalten werden (so dass sie können aufgespürt werden) bei 4 ° C oder auf Eis, bis sie zur Kultur. Ein Nachteil ist, dass diese Zeit draußen in utero oder Kulturbedingungen kann möglicherweise während der Kultur beeinflussen Lebensfähigkeit für Kultur oder folgende Entwicklung.
10. Sichern Sie den Embryo in Rückenlage gegen den Boden der Kulturschale durch Pinning den Achseln der Embryo mit einer Pinzette (in der Regel die Zange in der schwachen Hand gehalten). Pflegen Sie diese Zange in Ort, um den Embryo während der gesamten Dissektion Prozess noch halten.
11. Mit anderen Pinzette, entfernen Sie Haut, die Bauch und entfernen Sie vorsichtig Leber, Darm und anderen Organen zu entlarven zurückKörperWand.
12. Als die Gonaden werden auf der hinteren Körperwand auf beiden Seiten der dorsalen Aorta befinden,ein großes Blutgefäß entlang der Mittellinie des Körpers läuft, Schaufel unter dem Urogenitalleiste mit geschlossenen Pinzette und entfernen Sie die Urogenitalleiste durch Öffnen der Pinzette und anheben. Da die Keimdrüsen werden lose an der Wand befestigt werden, darauf achten, nicht zu schnell, ohne dass diese Verbindungen hochziehen oder die Gonaden können strecken, was zu Schäden an den Organen.
13. Bewegen Sie den Urogenitalleiste in cDMEM in einer Schale, um Gewebe zu Medien akklimatisieren.
14. Trennen Sie die Gonaden-Mesonephros-Komplex aus dem Rest der Urogenitalleiste mit 27 G Nadeln. Verwenden Sie eine Nadel durch Drücken abgeholzt, und mit der anderen, um das Gewebe richtig zu führen, um eine optimale Trennung zu ermöglichen. Vermeiden Sie das Sägen Bewegung gegen die Schale unten, so scharf, Nadeln Scherben aus Kunststoff, die mit dem Gewebe haften kann. Achten Sie auf die Mesonephros vollständig auf die Gonaden angebracht halten.

3. Kultivierung der Gonade mit einem niedermolekularen Inhibitor

1. Stellen Sie zwei 20 μl Pipetten zu je 15 ul. Schneiden Sie etwa 1-2 mm an einer der Sperrpipettenspitzen mit einem sauberen, sterilisiert Rasierklinge für die Übertragung der Keimdrüsen und der Zugabe von Steuer cDMEM, während die andere Pipette werden ausschließlich für Arzneimittel behandelten cDMEM verwendet werden.
2. Line up Gonaden mit ihren langen Achse parallel zur Pipettenspitze so dass sie leicht mit dem Cut-off-Spitze pipettiert werden. Seien Sie vorsichtig, der Gonaden Festhalten an der Innenseite der Pipettenspitze.
3. Kennzeichnen einen Seite als Steuertröpfchens und der andere als der wirkstoffhaltigen Tröpfchen. Nur zwei Tröpfchen auf einem 35 mm Schalendeckel passen. Stellen Sie sicher, dass die Etiketten auf Deckel passen Sie die Etiketten auf Schwanzgewebe haltigen Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Pipette 15 ul cDMEM die ein einzelnes Gonade in einem Tröpfchen auf dem Deckel einer kleinen (35 mm) Petrischale (verwenden nur die Deckel, wie die Böden sind zu groß, um in einem befeuchteten Petrischale Kammer passen). Legen Sie zwei separate gonad haltige Tröpfchen auf beiden Seiten der Schale, gut getrennte from einander. Check unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Keimdrüsen an die Tröpfchen übertragen.
5. Auf den als Steuer bezeichnet Tröpfchen, fügen Sie eine zusätzliche 15 ul cDMEM enthält DMSO (in Schritt 1.5 gemacht), um ein Tröpfchen mit einer 30 & mgr; l Gesamtvolumen. Verwenden Sie nur die "Kontrolle" Pipette, die nicht in Kontakt mit den Drogen.
6. Auf die andere Tröpfchen (Arzneimittel behandelten Probe), fügen Sie 15 ul TKI-II-haltige cDMEM, um ein Tröpfchen mit einer 30 & mgr; l Gesamtvolumen. Verwenden Sie nur das für Arzneimittel behandelten Proben bezeichnet Pipette.
7. Mit der Pipette, verteilt die Tröpfchen in einem expandierenden kreisförmigen Muster, bis sie etwa 15 bis 18 mm im Durchmesser und die Gonaden wird etwa in der Mitte befindet. Richten Sie die Gonaden, so dass es auf seiner Seite liegt und die Gonaden und Mesonephros sind leicht zu unterscheiden. Richten Sie die Lunge, so dass die zwei Lappen lag flach.
   1. Obwohl Tropfendurchmesser können leicht variieren, sicherzustellen, dass Gonaden nicht floating und werden durch Oberflächenspannung gehalten. Stellen Sie sicher, dass Tröpfchen sich nicht gegenseitig oder die Seite des Deckels berühren. Ohne die Oberflächenspannung, werden die Organe auf den Deckel während der Kultur zu wachsen und zu glätten, so verzerren Organmorphologie.
8. Vorsichtig die Kulturschalendeckel enthält, der Tröpfchen aufrecht auf der Oberfläche des Wassers in der großen (100 mm) Befeuchter Schale. Sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter dem Boden des Deckels eingeklemmt, und dass es auf der Oberfläche des Wassers liegen flach. Kehren Sie nicht die Deckel und achten Sie darauf, lassen Sie kein Wasser berühren Sie die Oberseite des Deckels, wo die Tropfen entfernt.
9. Um einen kleinen, feuchten Kammer zu schaffen, sofort mit dem Deckel des größeren Befeuchter Teller abdecken, um die Gonaden Kulturen einzuschließen. Handeln, so schnell wie möglich, die Verdunstung von Medien zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass die kleinere Schüssel hat Raum zwischen ihm und dem Deckel der größeren Schüssel frei bewegen; Andernfalls kann es zu Kondensation einer Dichtung und b zu machenSchloss Luftaustausch an das Gewebe.
10. Sobald zwei kleine Deckel werden in die Kammer gebracht, sofort platzieren die Kammer in den Inkubator. Die Tröpfchen Kulturen für 48 Stunden in einem befeuchteten CO _{2 -Inkubator} bei 37 ° C.

4. Polymerase-Kettenreaktion zur Bestimmung des Geschlechts des Embryos

1. Fügen Sie die embryonale Schwänze zu Boden eines 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Hinzufügen zu jedem Röhrchen wurden 200 ul 50 mM NaOH.
3. Stellen bei 95 ° C für 15 Minuten oder bis die Gewebe vollständig gelöst ist.
4. In 50 ul 1 M Tris-HCl und Wirbel leicht und kurz.
5. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, einen frischen PCR-Mastermix durch Multiplizieren jedes Volumen durch die Gesamtzahl der Proben: 0,5 ul 25 uM Primer-Lösung, 2,5 ul 10x Taq-Puffer, 0,5 ul 10 mM dNTPs (Nukleotide), 19,3 ul nuclease- freies Wasser, 0,2 & mgr; l DNA-Taq-Polymerase. Gut mischen.
6. In 23ul PCR-Master-Mix in Röhrchen gegeben, 3 ul Lysat verdaut tails der PCR.
7. Flick Rohre, um sie zu mischen, dann einen kurzen Spin, um die Proben auf den Boden des Röhrchens zu bringen.
8. Führen XY (Short) PCR-Programm (Tabelle 1).
9. Laden Sie die Proben (mit 5-fach-Farbstoff) und Leiter in einem 2,5% igen Agarosegel in 1 × TAE-Puffer.
10. Führen Sie die Agarose-Gelelektrophorese, bis XX und XY Bands aufgelöst werden kann.
11. Bild das Gel mit UV-Licht und Bilderfassung.
12. Analyse der X-Chromosom-spezifischen vs Y-Chromosom-spezifischen Banden (X Chromosom = 331 Basenpaaren [bp] und XY = 302 bp) ^13; XY (männlich) Proben werden zwei Banden von 331 und 302 bp aufweisen, während XX (weiblich) Proben wird als eine einzelne 331 bp-Bande erscheinen.

5. Ganze Berge Orgel Immunfluoreszenz

Tag 1:

1. Entfernen Sie die Gonaden aus der Kultur mit einem 1000 ul Pipette mit einem Cut-off Spitze. Falls gewünscht, kann sie in derin eine Schüssel mit PBS zu waschen Medien und Reagenzien gelegt. Legen Sie in PBS in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Der kleinere Schlauchgröße wird Reagenzien zu sparen und machen es einfacher, den Überblick über Proben in der Röhre zu halten.
   1. Achten Sie darauf, Kontrolle und behandelten Proben sowie XX und XY Proben zu halten, in getrennten Röhren und entfernen Sie sie aus der Kultur mit getrennten Gruppen von Pipetten, um potenzielle Wirkstoff Kontamination zu vermeiden.
2. Zweimal mit PBS waschen Sie die Gonaden. Von diesem Punkt an, kann dieses Protokoll 1X PBS verwenden ohne Calcium und Magnesium. Um sie zu waschen, damit die Keimdrüsen, auf den Boden des Rohres (durch die Schwerkraft) sinken und dann die Flüssigkeit über. Seien Sie vorsichtig, nicht zu verlieren Gonaden durch Pipettieren zu nah an ihnen.
3. Zu entfernen, so viel wie möglich von PBS Rohres. Fügen Sie 250 ul 4% Paraformaldehyd in PBS, das 0,1% Triton X-100, und lassen inkubieren O / N bei 4 ° C auf einer Wippe. Alternativ kann diese Fixierung für 2 h bei 4 ° C auf einem Schüttler durchgeführt werden. VORSICHT! Parafor-Formaldehyd ist eine giftige Substanz, so folgen Sie Sicherheitsprotokoll bei der Handhabung.

Tag 2:

4. Zweimal Spülen Sie die Gonaden in 250 ul PBTx bei RT.
5. 3 Mal Waschen Sie die Gonaden mit 250 ul PBTx für jede 10 min bei RT auf einer Wippe.
6. Blockieren die Gonaden mindestens 1 Stunde in 250 ul Blockierungslösung bei RT auf einer Wippe.
7. Färben die Gonaden O / N bei 4 ° C auf einer Wippe in 250 ul primären Antikörper in Blockierungslösung verdünnt.

Tag 3:

8. Zweimal Spülen Sie die Gonaden in 250 ul Waschlösung.
9. 3-mal mit 250 ul Waschlösung je 10 min bei RT auf einem Schüttler waschen den Gonaden.
10. Sperrung der Gonaden 1 h in 250 ul Blocking Solution bei RT auf einer Wippe.
11. Decken Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie, um fluoreszierende Sekundärantikörper vor Licht zu schützen.
12. Inkubieren Sie die Gonaden 2-4 h bei RT auf arocker in 250 ul sekundären Antikörper in Blockierungslösung enthält Hoechst 33342. Alternativ verdünnt, führen sekundäre Antikörper und Hoechst 33342 Inkubation O / N bei 4 ° C auf Wippe.
13. Zweimal Spülen Sie die Gonaden in 250 ul PBTx.
14. 3 Mal Waschen der Gonaden in 250 ul PBTx für jede 10 min bei RT auf einer Wippe.
15. Unter Verwendung eines Cut-off-Pipettenspitze, übertragen Gonaden auf einen Objektträger mit minimaler Flüssigkeit. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit Pipette, aber stellen Sie sicher, dass Gewebe trocknet nicht aus.
16. Richten Sie die Gonaden mit einer Pinzette in gewünschter Weise, und schnell einen Tropfen Eindeckmedium auf die Gonaden auf dem Objektträger zu montieren. Sicherstellen, dass die Befestigungsmittel Mäntel alle Proben komplett; ist es wichtig zu verhindern, dass Proben austrocknen.
17. Verwenden Deckgläser (Nummer 1.5-Stil) von geeigneter Größe, um sanft bedecken Proben. Lassen Sie die Montage Medien Ausbreitung auf die gesamte Oberfläche des Deckglases zu kontaktieren. Falls erforderlich, sehr leicht auf den Ecken des Deckglases, so dass drückenes gibt keine großen Luftblasen.
18. Verschließen Sie die Dias mit klarem Nagellack an den Rändern um die Verdampfung der Befestigungsmittel zu reduzieren. Shop gerahmte Dias im Dunkeln bei 4 ° C.

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Ergebnisse

Die ex vivo Tropfenkultur ermöglicht eine ganze Organe, wie zB die Gonaden zu manipulieren, um zelluläre Wechselwirkungen und Dynamik zu studieren. 1 zeigt, in einer schrittweisen Art und Weise, wie man eine E11.5 gonadalen Tropfenkultur herzustellen. Die ersten Schritte in dem Kulturprotokoll umfassen die anfängliche Entfernung des Embryos enthaltenden Uterus der Mutter Maus (1A und 1B). Nach Entfernung der Gebärmutter der Mutter wird die Gebärmutterwand geschnitten und d...

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Diskussion

Diese Studie zeigt eine ex vivo ganze Organ Tröpfchenmethode, die viele mögliche Anwendungen für die Untersuchung der fetalen Entwicklung hat. Diese Technik kann für mehrere Organe der Forscher verwendet werden und erlaubt es, biologischer Fragestellungen, die schwierig zu prüfen unter Verwendung von in vivo-Vorgehensweisen, werden wegen Unzugänglichkeit von Embryonen und Potential embryonaler Letalität adressieren. Diese Kultur-Methode hat zusätzliche Vorteile gegenüber anderen I...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)	Fisherbrand	12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible	Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps	GeneMate	T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L	Gilson	FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
Fine Scissors	FST	91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles	BD PrecisionGlide	309623
10 ml syringe	BD	305559
0.2 μM PES syringe filter	VWR	28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm	Whatman	1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish	Falcon/Corning	353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)	VWR	25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator	Eppendorf	CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet	Nuare	NU-425-400
Mini-centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL	GeneMate	R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel	Eppendorf	950040015
SMZ445 stereomicroscope	Nikon	SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software	Alpha Innotech Corporation	Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol	Fisher	BP2818-500
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4	Fisher	S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S671-3
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma	C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9938
XY PCR Primer	IDT	N/A
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP2482-1
1% Ethidium bromide solution	Fisher	BP1302-10	Toxic
Agarose	GeneMate	E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	367176-2.5KG
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions	Thermo Scientific	R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer	Denville	CB-4050-3
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500	Toxic
FluorMount-G	Southern Biotech	0100-01
Hydrogen Chloride (HCl)	Fisher	A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation	Bioexpress	0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered	Fisher	03-600-511	Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered	Sigma	D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem	EMD Millipore	676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody	Millipore	AB5535	Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody	BD Pharmingen	553370	Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signaling	9661S	Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)	Life Technologies	13-1900	Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate	Invitrogen (Molecular Probes)	H1399	Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-165-153	Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A31572	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21206	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21208	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Life Technologies	A31573	Use at dilution: 1:500