Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Zusammenfassung

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Zusammenfassung

Effiziente Immunantwort ist abhängig schnelle Mobilisierung von Blut Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Untersuchung Leukozytenmigration in vivo ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Basis der Leukozyten transendotheliale Migration und Interaktion mit Gefäßendothel. Ein leistungsfähiger Ansatz beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine ​​in Zellen von Interesse.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Bildgebung Monozyten und Neutrophilen im _CX 3 CR1 ^{gfp / wt-Maus} iv mit orangefarbenen Farbstoff markierten Neutrophilen mit einem invertierten konfokalen Mikroskop injiziert. Zeitraffer-Filme gesammelt von 30 Minuten bis zu mehreren Stunden der Bildgebung ermöglicht die Analyse von Leukozyten-Verhalten in Mesenterialvenen unter beiden stationären und entzündlichen Erkrankungen. Wir beschreiben auch die Schritte, um vor Ort zu induzieren Entzündung der Blutgefäße mit TLR2 / TLR1 Agonist Pam3SK4 und Überwachung der subsequent Rekrutierung von Neutrophilen und Monozyten.

Die vorgestellte Technik kann auch verwendet werden, um andere Populationen von Leukozyten zu überwachen und zu untersuchen, Moleküle mit anderen Reizen oder transgenen Mäusen in Leukozytenrekrutierung oder Menschenhandel in Verbindung gebracht werden.

Einleitung

Neutrophilen und Monozyten sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die kontinuierlich im Blut zirkulieren. Nach Verletzung oder Infektion, Entzündungssignale induzieren Leukozyten-Diapedese in beschädigte und infizierten Geweben, die hierin Initiieren eine zelluläre Immunantwort ^1-3. Die Schnelligkeit der Mobilisierung von Leukozyten bestimmt das positive Ergebnis der Immunantworten. Diese komplizierte Prozesse stützen sich auf spezifische Moleküle (zB Selectine, Endothel-gebundenen Chemokine) auf der entzündeten Endothel vorhanden, die für die Einrichtung von Klebe Kontakte zwischen zirkulierenden Leukozyten und dem Endothel ^1-3 .Um Erkenntnisse über die Moleküle in der Leukozyten beteiligt Hilfe bekommen Einstellungskaskade ist es wichtig, um die Kinetik der Zellrekrutierung zu visualisieren und das Verhalten der einzelnen Zelle / Population verfolgen. Eine wirksame Methode beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine ​​in Zellen von Interesse.

Inhalt "> Bis heute wurden mehrere Ansätze mit Intravitalmikroskopie, um Bild entwickelt das Gefäßsystem ^4,5. So wurde beispielsweise bildgebende Ohr Dermis Gefäßsystem oder Mesenterialvenen von Intravital konfokale Mikroskopie verwendet, um das Verhalten der Mäuse-Patrouillen Ly6C ^niedrigen Monozyten und menschliche identifizieren CD14 ^dim CD16 ⁺ Monozyten auf der luminalen Seite der Blutgefäße unter stationären Bedingungen ^6-8. Die Maus Cremaster Gefäßmodell wird häufig verwendet, um das Verhalten von Neutrophilen oder entzündlichen Ly6C ^Hoch Monozyten unter entzündlichen oder ischämischen Bedingungen in transgenen Mäusen zu überwachen. In der Fall wird Cremaster über intrascrotal Injektion von IL1β, CCL2, TNFß oder fMLP stimuliert. Nach 2-4 Stunden, Gewebe werden dann chirurgisch nach außen verlagert und durch Intravitalmikroskopie ^9-11 analysiert konfokalen.

Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um Monozyten und Neutrophile gleichzeitig mit jedem Monitorinvertierten Fluoreszenz konfokalen Mikroskop. Außerdem Details unserer Methode zur Darstellung von demselben Schiff vor (Beharrungszustand) und nach Entzündungen und wie man die Kinetik der Rekrutierung von Leukozyten zu folgen. Zu diesem Zweck verwenden wir die _CX 3 CR1 ^{gfp / wt-Maus,} deren Monozyten exprimieren eGFP, IV mit einem orangen Farbstoff-markierten Maus-Neutrophilen injiziert. Unter Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop ist es möglich, (1) zu verfolgen und zu analysieren, die Patrouillen Ly6C ^niedrigen Monozyten unter stationären Bedingungen und (2), um die Einstellung beider Monozyten und Neutrophilen im gleichen Gefäß nach dem lokale Entzündung zu folgen. Hier schaffen wir die entzündlichen Erkrankungen mit Hilfe der TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 ^12. Darüber hinaus können solche Bildern dienen, die die Rolle von spezifischen Molekülen von Interesse in den verschiedenen Schritten der Leukozytenrekrutierung Kaskade bestimmen, ob auf bestimmten Knock-out-Mäusen oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpern ^6,9,13 geführt.

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Protokoll

HINWEIS: Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der institutionellen Ethikkommission der Animal Care in Genf, die Schweiz und die kantonalen Veterinäramt durchgeführt. Zulassungsnummer GE / 63/14.

1. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus dem Knochenmark

1. Sacrifice Maus (8-12 Wochen alt) durch Genickbruch. Sterilisieren Sie die Hinterbeine mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Haut vor den Hinterbeinen.
2. Sezieren Maus Oberschenkelknochen und Schienbeinknochen und Gewebe zu entfernen von den Beinen mit einem Skalpell. Beine mit 90% Ethanol und Ort Spülen in eine Kulturschale mit PBS gefüllt.
3. Unter dem Kultur Kapuze, sauberen Tuch ab Oberschenkelknochen und Schienbeine mit einem Skalpell und separatem am Kniegelenk. Abgeschnitten jedes Ende der Knochen.
4. Flush Knochenmark aus jedem Knochen Verwendung einer 23G Nadel und einer 1 ml Spritze mit Präparationsmedium (Phenolrot-freiem DMEM / F12, 1% Rattenserum) gefüllt ist, in einen 50 ml Schneckenrohr. Stören Zellaggregate durch zart Passage durch die 23G needle und eine 1 ml-Spritze. Bringen Gesamtvolumen auf 25 ml mit Präparationsmedium.
5. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C. Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml Lyse der roten Blutkörperchen RBLC Puffer (8,3 g _NH 4 Cl, 1 g _NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), vollständig auf 1 l mit destilliertem Wasser, das Filter von 0,22 um) in einem 15 ml Schraubenrohr. Inkubieren Sie 30 Sekunden auf Eis.
6. 10 ml Herstellungsmedium und Zentrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendieren in 2 ml Herstellungsmedium.

2. Neutrophilen-Anreicherung durch negative Selektion

1. Fügen Sie 150 ul Maus-Neutrophilen-Anreicherungscocktail (Zellisolation Plattform-Kit wie EasySep). Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min.
2. 10 ml Phenolrot-freiem DMEM. Kehren Sie sofort und Zentrifuge 250 xg, 3 min, 4 ° C.
3. Überstand verwerfen. Pellet in 1,75 ml Herstellungsmedium in 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Fügen Sie 250 ul Biotin Auswahl Cocktail. Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min.
4. Mischen Sie den magnetischen Partikeln (aus der Zellisolation Plattform-Kit) für 30 Sekunden, um Partikel zu resuspendieren. Gib 500 & mgr; l magnetischen Teilchen an Zellen in Suspension. Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min.
5. Das Röhrchen wird in den Magneten. 3 min warten.
6. Kehren Sie die Magneten auf eine neue 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen, um die gewünschten unmarkierten Zellen zu sammeln. Nehmen Sie nicht den letzten Tropfen hängen in der Röhre. Unerwünschte Zellen wird in dem Rohr innerhalb des Magneten bleibt. Entsorgen Sie diesen Schlauch in einem biohazard Abfälle.
7. Setzen Sie die neue Röhre in den Magneten. 3 min warten.
8. Kehren Sie die Magneten auf ein neues 15 ml Schraubenrohr, um die gewünschten unmarkierten Zellen zu sammeln. Nehmen Sie nicht den letzten Tropfen hängen in der Röhre.
9. Komplette Volumen auf 5 ml mit Phenolrot-freiem DMEM.

3. Kennzeichnung von Neutrophilen

1. Mit 0,5 ul einer orangen Farbstoff wie Zell Tracker Orange (Arbeitskonzentration1 & mgr; M, CMRA - Chlormethyl-Rodol-Acetat, Lager 10 mM in DMSO). Inkubieren 2 min bei 37 ° C.
2. In 2,5 ml Herstellungsmedium. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C.
3. Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml Herstellungsmedium in einem 1,5-ml-Röhrchen.
4. Einen aliquoten mit Zählkammer zählen.
5. Inkubiere 5 min bei 37 ° C. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C.
6. Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml PBS. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C zu waschen.
7. Überstand verwerfen. Pellet als 10x10 ^{6 Zellen} pro 100 & mgr; l PBS. Halten Sie auf Eis, bis iv Injektion. HINWEIS: Die Zellen werden iv injiziert, so schnell wie möglich. 6-12x10 ⁶ Neutrophile / Maus sind in der Regel erhalten.

4. Maus Vorbereitung Intravitalmikroskopie

HINWEIS:.. Schritt 4.1) und 4.2) sollte zu Beginn des Experiments durchgeführt, um längere Wartezeit von markierten Neutrophilen zu vermeiden ice.

1. Wiegen Sie die _CX 3 CR1 ^GFP-Maus (8-12 Wochen alt).
2. Vorzubereiten 800 ul von Anästhetika (Ketamin 60 mg / kg, Xylazin 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg in PBS).
3. Anesthetize Maus. Injektion ip mit 200 & mgr; l / 20 g Maus. Steuer Anästhesie durch Zehen Kneifen und durch Überprüfung der Atemfrequenz.
4. Injizieren Neutrophilen (10x10 ^{& sup6; Zellen} in 100 ul PBS) intravenös über die laterale Schwanzvene oder den retro-orbitalen Sinus, auf den Komfort des Experimentators.
5. Setzen Sie die Maus auf Heizkissen und die Augen mit Augen Gel schützen.
6. Ein Deckglas (35 mm Durchmesser) wird in einem 10 cm Gewebekulturschale, die einen Durchmesser von 30 mm Loch setzen. Verwendung Öl wird der Gewebekulturschale in Kontakt mit dem Deckglas zu erhalten.
7. Einzuschneiden Bauchhaut mit einer Schere, um das Bauchfell aus. Einzuschneiden Peritoneum mit einer Schere auf Darm freizulegen.
8. Zugeben von 200 & mgr; l PBS (auf 37 ° C vorgewärmt) in die peritoneal Höhle. Nehmen Sie die Maus in der Hand und drehen Sie sie nach unten, so dass der Darm steigt aus der Bauchhöhle mit einem sanften Druck. Platzieren Sie die Maus in der Gewebekulturschale.
9. Deroll vorsichtig den Darm mit sterilisierten Wattestäbchen auf das Deckglas, um die Mesenterialgefäße aussetzen.
10. Schneiden Sie Papiertaschentücher in Bands und benetzen sie mit 37 ° C erhitzt PBS. Immobilisieren den Darm mit den Stücken von Papiertaschentüchern, um die Bewegungen von Peristaltik resultierenden verringern.
11. Legen Sie die Gewebekulturschale und die Maus in den 37 ° C temperiert Kammer auf die maßgeschneiderten Fach Stufe der inversen Mikroskop. Einführung einer Spritze mit Betäubungsmittel sc in das Hinterbein. HINWEIS: Zusätzlich kann die Maus Sauerstoff (0,5 L / min) mit einer Maske erhalten.
12. Kontroll-Maus für die Anästhesie durch Zehen kneifen und die Kontrolle der Atemfrequenz alle 30 min. Bei Bedarf liefern einen Schub von Anästhetika (20 ul) auf die Anästhesie richtig pflegen. NICHTE: Das Trocknen des Gefäßsystems zu vermeiden. Daher ist seine Feuchtigkeit durch regelmäßige Benetzung der verwendet wird, um den Darm mit 37 ° C wärmten PBS immobilisieren Papiertaschentücher gehalten.

5. Messung der Neutrophilen und Monozyten Verhalten in Entzündete Gefäße in vivo unter Verwendung von Intravitalmikroskopie

1. Set Laser 488- und 561- auf dem niedrigsten Leistungs notwendig, laserinduzierte Phototoxizität zu vermeiden. In unseren Versuchen ist es niedriger als 0,5%. Intensität der GFP in Monozyten und orangen Farbstoff in Neutrophilen ist so hell, dass in der Regel 0,3% ist genug. ANMERKUNG: Dies entspricht einer Laserleistung von 0,15 bis 0,25 mW mit unserem System.
2. Erwerben Sie Bilder von 512 x 512 Pixeln (dh 635 & mgr; m) in 2,2 sec mit einem offenen Lochblende unter Verwendung der 20X Trockenziel der inversen Mikroskop. Verwenden Sie einen z-Tiefe zwischen 10 bis 20 um, die eine ausreichende Signal mit den niedrigen Laserleistungen gewährleistet.
   HINWEIS: Wir in der Regel führen Experimente mit einem z-Tiefe zwischen 12 und 1656; m. Im Falle der dargestellten Zahlen und Filme, die z-Tiefe 20 um. Phasenkontrast ermöglicht die Identifizierung von endothelialen Wandungen und Abbilden auf Mesenterialvenen geführt. Seit patrouillieren Zellen bewegen ganz langsam mit einer Geschwindigkeit von 5 bis 10 & mgr; m / min ^6, Aufzeichnung eines Interessengebiet alle 20 sec ist zufriedenstellend. Mit den beschriebenen Einstellungen, ermöglicht es dem Motortisch die Aufnahme von bis zu 7 Interessengebieten gleichzeitig.
3. Platzieren Sie die Maus und die Mesenterialgefäße in der Thermostatkammer des Mikroskops werden es ihnen ermöglichen, von der Vorbereitung für 30 Minuten vor dem Erwerb des ersten Films zu erholen. Während dieser Zeit, wählen Sie mehrere Felder in der Umgebung. Konzentrieren sich auf die luminale Oberfläche des Behälters in der Nähe des Ziels. Falls erforderlich, die Vorteile der leichten Autofluoreszenz des Endothels, um den Fokus einzustellen.
   HINWEIS: Chirurgie während der Maus Vorbereitung etwas betont die Endothel. Folglich rollt von Neutrophilen und/ oder Monozyten in den ersten 15 Minuten nach der Zubereitung der Maus beobachtet werden.
4. Nehmen Sie einen ersten Film für 30 min unter stationären Bedingungen, ein Bild alle 20 sec.
   Hinweis: Die Software übernimmt jedes Interessengebiet in 2,2 s und die Motortisch fährt automatisch von einem Feld zum anderen. Es geht während der 30 min der Aufzeichnungsfilm zurück in die erste Position innerhalb von 20 sec.
5. Zur Entzündung der Blutgefäße zu initiieren, einen Tropfen von 20 ul PBS, das 100 ug TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 ¹² direkt auf die abgebildeten Gefäße.
6. Steuern Sie den Fokus für jedes Feld von Interesse.
   Hinweis: Im Verlauf der Übernahme, es gibt immer geringfügige Änderungen des Fokus auf der z-Achse. Trotz der 10-20 um z-Tiefe kann dies zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führen. Daher manuell jedes Interessengebiet am Ende jedes Films zu konzentrieren, wenn nötig. Nehmen Sie die Videos für 30 Minuten-Zeiträumen und bis zu 3 h auftal nach Beginn der Entzündung.
7. Am Ende des Experiments zu opfern anästhesierten Maus durch zervikale Dislokation.

6. Generierung von Filmdateien und Verfolgung von Leukozyten

HINWEIS: Die Nikon Erfassungssoftware erzeugt .nd2-Dateien, aber die folgende Vorgehensweise wäre ähnlich mit anderer Software und Marken sein.

1. Export-Dateien als TIFF-Serie.
2. Zum ImageJ Software (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importieren Sie das tiff-Serie. Jeder Kanal als eine andere Datei.
3. Tragen Sie eine Medianfilter mit einem Radius von 2,0 Pixel für den grünen und roten Kanälen, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren (Process> Filter> Median ...).
4. Dateien zu konvertieren in binäre (Process> Binary> Make Binary). Kann die Software den Schwellenwert für jedes Bild zu berechnen.
5. Merge-Kanälen zu einem Bild-Serie (Bild> Farbe> Merge Kanäle ...). Wählen Sie die Monozyten im green-Kanal, die Neutrophilen im roten Kanal und das durchgelassene Licht in der Grau Kanals.
6. Konvertieren gestapelten Bildern in RGB-Farben (Bild> Farbe> Stapeln zu RGB).
7. Datei speichern unter .avi
8. Die Daten werden importiert und in Imaris Software (Bitplane) zusammengestellt. Bewegungen von Monozyten und Neutrophile werden dann mit Hilfe der Spot-Tracking-Wizard verfolgt.

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Ergebnisse

Das Manuskript beschreibt ein optimiertes Protokoll einfach das Verhalten von Monozyten und Neutrophilen in den Mesenterialvenen der narkotisierten Mäusen in Echtzeit überwachen. Die Verwendung eines 37 ° C-thermostatisierten Kammer ist obligatorisch, um die Temperatur der Maus erhalten und auch aufgrund der temperaturabhängigen Bewegung der Leukozyten. Vorbereitung der Maus ist in Abbildung dargestellt 1. Abbildung 2 zeigt die ganze Fläche unter dem Mikroskop zu sehen. Durchlicht ...

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Diskussion

Die in dieser Handschrift beschriebenen Methoden bieten einen konsistenten Ansatz für Monozyten und Neutrophilen Verhalten effizient studieren in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Erkrankungen.

Der entscheidende Schritt der Herstellung ist die Immobilisierung des Darms mit PBS-befeuchtete Tücher. Wenn sie richtig durchgeführt wird, werden Mesenterialgefäße schön auf dem Deckglas für die Bildaufnahme ausgesetzt ist. Dies ermöglicht die Auswahl von mehreren Bereich...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml polystyrene round bottom tubes	Beckton Dickinson	352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm	Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm	Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye	Life Technologies	C34551
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit	Stem Cell Technologies	19762
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
FCS	PAA	A15-042
Immersion Oil Type A	Nikon		any viscous oil
Life Box Temperature Control System	Life Imaging
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NH4Cl	Sigma Aldrich	A9434
Nikon A1R confocal microscope	Nikon	A1R	inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS	Life Technologies	D8537
phenol red free DMEM/F12	Life Technologies	21041-025	any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	reconstitute in PBS
Rat serum	Stem Cell Technologies		included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100	TPP	93100