Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

Zusammenfassung

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Zusammenfassung

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Einleitung

Die Prostata ist eine heterogene Gewebe des sekretorischen Epithels in Drüsenacini durch fibromuskuläre Stroma in erster Linie aus der glatten Muskulatur ¹ komponiert umgeben angeordnet sind. Basalzellen, sekretorischen Zellen, neuroendokrinen Zellen, Transit Verstärken und Stammzellen ^2: Die Epithelzellen Fach besteht aus fünf verschiedenen, aber organisierter Zelltypen besteht. Bei Prostatakrebs (PCa), die sich von den luminalen Epithelzellen entsteht, das Wachstum des Adenokarzinoms bewirkt eine evident allmählichen Rückgang des Stroma ^3. Aus diesen Gründen werden Gewebeproben deutliche Unterschiede im Verhältnis von stromalen und epithelialen Zelltyp auf der Basis des Ausmaß der PCa haben. Diese Unterschiede können zu Verzerrungen der Annahmen der Genexpressionsdaten von ganzen Geweben ungeachtet Mikrodissektion der gewünschten Zelltyp gewonnen führen. Daher ist es wichtig, diese Vorspannung zu entfernen, um Zelltypen vor der RNA-Extraktion und TrennungGenexpressionsanalyse.

Macrodissection oder Mikrodissektion verwendet werden, um physisch zu trennen gut charakterisierten epithelialen Bereichen von der umgebenden Stroma ^{4 -6} werden. Macrodissection wird typischerweise mit einer Rasierklinge unter einem Präpariermikroskop gemacht und funktioniert gut zum Trennen großer PCa Knötchen vom Stroma, aber ist nicht fähig zur Entfernung von gutartigen Epithel von umgebenden Stroma (siehe Beispiel benigner Prostata Histologie in Abbildung 1). Mikrodissektion mit einem Laser (LCM) wesentlich arbeitsintensiver als macrodissection, aber sehr genau sezieren gutartige Epithel ^4.

Aktuelle Veröffentlichungen aus unserem Labor haben gezeigt, dass RNA erfolgreich durch LCM entweder aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Biopsien oder gefrorenen Gewebe ^4,7-9 extrahiert werden. Die großen Herausforderungen in LCM-RNA-Extraktion sind 1), genau zu sezieren die gewünschten Bereiche des Gewebes, und 2) zur Erhaltung RNA Integrität während des LCM und Isolierungsverfahren ^4,10. RNA aus reinen Zellpopulationen isoliert können zur Genexpressionsanalyse durch mehrere Verfahren einschließlich Reverse-Transkription quantitative PCR ^(RT-qPCR) 7,8 Microarray ^{11 und} tiefe -sequencing ^12-14 verwendet werden.

Ziel dieses Protokolls ist es, Gesamt-RNA aus LCM Prostataepithel aus gefrorenem Gewebe zu isolieren, für nachgeschaltete Genexpressionsanalysen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle menschlichen Geweben für diese Experimente verwendet wurden, über ein Institutional Review Board genehmigten Protokoll und / oder Freistellung an der Universität von Illinois in Chicago erworben.

1. § frisch gefroren Prostate auf PEN-Rutsche und auf Geladene Glass Slide

1. Am Tag vor oder ein paar Stunden vor dem Schneiden die Probe, saubere Werkzeuge (dh, Pinsel, Pinzette, coplins, Klingen, PEN-gerahmte Dias (falls nicht bereits RNase frei), eine ETOH sicheren Marker und ein Bleistift) und das Innere des einen RT Kryostat mit RNase-Dekontaminationslösung mit einer Sprühflasche und Lab-Wischtücher.
   1. Erlauben RNase-Dekontaminationslösung für 5 min vor wischte sitzen, Spülen mit depcH _{2 0} auf über RNase-Dekontaminationslösung und eine abschließende Spülung mit 70% EtOH (mit depcH _{2 0)} hergestellten links entfernen.
      Hinweis: Es ist wichtig, eine RNase-freie Arbeitsfläche zu erhalten. Alle coplins, Werkzeuge, gefroren Eindeckmedium, Klingen und Folien verwendet werden, sollten nur für RNase freie Arbeiten verwendet werdenund nie in einem Standard-nicht-RNase freien Umgebung verwendet. Alle Instrumente müssen mit einer RNase Dekontaminationslösung vor jedem Experiment behandelt werden.
2. Coole Kryostaten auf -24 ° C.
3. Setzen Sie die folgenden gereinigt RNase frei Instrumente innerhalb Kryostat mindestens 30 Minuten vor dem Schneiden abkühlen: slide Coplin gefüllte mit 100% Ethanol, Werkzeuge, kleine gefrorene Gewebekassetten und Montagezange.
4. Abrufen gefrorenen Prostatagewebe aus Kryospeicherung aufnehmen und in einem Trockeneis gefüllten Schaum Eimer für den Transport. Platzieren Gewebe in Kryostat Temperatur angeglichen wird für mindestens 30 min Kryostaten.
   Hinweis: Human Prostatagewebe für Laser-Capture-Mikrodissektion kann entweder frisch gefroren oder sein in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE). Die Zeitdruck und Objektträgervorbereitung sind etwas anders zwischen Gewebequellen. Hier beschreiben wir die Schritte für die Gefrierschnitten.
5. Arbeiten Sie mit einem Gewebe zu einem Zeitpunkt, und spritzen gefrorenen Einschlussmittel in die bottom der Kassette und schnell montieren Sie die gefrorenen Prostatagewebe in den gefrorenen Eindeckmedium mit den gekühlten Pinzette.
6. Legen Sie die Kassette mit dem Gewebe auf Kühler in Kryostaten für 5 min auf gefrorenen Eindeckmedium gesetzt.
7. Squirt eine kleine Menge gefrorenen Montagemedium auf dem Spannfutter und bis drücken montiert Gewebeunterseite vorsichtig auf dem gefrorenen Eindeckmedium. Lassen Sie in den Kryostaten Set für 5 Minuten, damit das gefrorene Eindeckmedium vollständig zu verfestigen.
8. Zeigen Futter in die Halterung ein und ziehen.
9. Verriegeln Sie den Griff in Sperrstellung und eine neue Klinge auf den Kryostaten. Für nachgeschaltete molekulare Endpunkte, die einen Verstärkungsschritt umfassen (dh qPCR) ist es ratsam, eine neue Klinge für jeden Patienten zu verwenden, um eine Kontamination zu verhindern (oder bewegen Sie die Klinge über den Bereich des Schaufel für die nächste Probe zu verwenden).
10. Entriegeln Sie den Griff und das Gewebe vorsichtig voran mit der Hand oder mit einem Fußpedal zu glätten und setzen das Gewebe mit 50 μm Abschnitte, bis die gewünschte Gewebe Belichtung erreicht ist.
11. Passen Kryostaten bis 5 um, schneiden ein oder zwei Abschnitte und legen Sie sie auf geladene Objektträger für die Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung (siehe Schritt 2).
12. Sofort platzieren Sie die Folie in die kalte 100% Ethanol für 2 min.
13. Entfernen Sie die geladene Objektträger aus Ethanol und trocknen lassen bei RT, bevor Sie mit H & E Färbung (Schritt 2).
14. Zeigen RT PEN-Frame-Schieber auf einem Rahmen Fan.
15. Passen Kryostaten bis 10 um und Ort Abschnitten auf die RT PEN Rahmen gleitet. Ein bis vier Abschnitte Ort auf jeder Folie je nach Gewebegröße sein.
16. Die Folie sofort tauchen Sie ein in der Kälte 100% Ethanol für 2 min.
17. Entfernen Sie die PEN-Frame-Folien aus Ethanol und speichern Sie die Folie in einer Dia-Box in einem Exsikkator Feld in einem -80 ° C Gefrierschrank bis bereit LCM. Drei Tage ist die maximale Speicherdauer für eine optimale RNA-Gewinnung.
18. Fahren Sie mit Schritt 2 nur für die geladenen Glas geschobene. Fahren Sie mit Schritt 3 für PEN-Frame-Folie.

2. Hämatoxylin und Eosin-Y (H & E) Stain zur histologischen Mark-up

Hinweis: Diese, wenn für das Gewebe auf der geladenen Objektträger und den Stift nicht Rahmen Rutsche für LCM.

1. Hydrat in den Abschnitten über die geladene Objektträger Eintauchen der Objektträger durch abgestufte Ethanol wie folgt: Tauchen Sie die Objektträger zweimal in 100% Ethanol für 3 Minuten, zweimal in 95% Ethanol für 3 min, einmal in 70% Ethanol für 3 min und zwei mal in destilliertem _H 2 O 3 min.
   1. Vorbereitung Säurealkohollösung: 99 ml 70% igem Ethanol + 1 ml 1% HCl und 0,1% ige Natriumbicarbonatlösung: 0,1 g Natriumbicarbonat in 100 ml destilliertem H _{2 O}
2. Tauchen Sie die Folie in Hematoxylin Gill II (0,4%) für 5 min.
3. Abwaschen überschüssige Beize in Steady fließendem Wasser _H 2 O 3 min.
4. Tauchen Sie die Objektträger 10 Mal in saurem Alkohol
5. In fließendem _H 2 O 3 min Waschen Sie die Folie.
6. Tauchen Sie den Schiebein 0,1% Natriumhydrogencarbonat-Lösung für 30-60 Sekunden, um die violette Farbe auf blau um.
7. In fließendem _H 2 O 3 min Waschen Sie die Folie.
8. Spülen Sie die Folie in 95% Ethanol mit 10 Dips.
9. Tauchen Sie die Folie in Eosin-Y 2-3 mal für 15 sec insgesamt.
10. Entwässern die Folie durch abgestufte Ethanol wie folgt: Tauchen Sie die Objektträger zweimal in 95% Ethanol, zweimal in 100% Ethanol und zweimal in Xylol (stellen Sie sicher, das Gewebe wird klar, welche gründliche Entwässerung anzeigt).
11. Montieren Sie den Schieber mit nicht-wässrigen permanenten Fest Eindeckmedium und Deckglas.
12. Lassen Sie die Folie trocken für 30 Minuten.
13. Ein großes, hochauflösendes Bild Scan Rutsche mit jeder ganzen Dia-Scanner und drucken auf 8 "x 11" Papier.
14. Gliederung Interessengebiete (in der Regel durch einen Facharzt Pathologen durchgeführt) mit einem Marker. Dieses Markup ist der Leitfaden für die LCM Verfahren.

3. Toluidinblaufärbung des PEN-Frame-Slides

Hinweis: Thwird am selben Tag wie der LCM durchgeführt. Verwenden depcH _{2 O} Wasser für alle Lösungen. Füllen Sie alle Schritte in RNase-free-Bereich. Alle coplins muss mit RNase-Dekontaminationslösung gereinigt werden.

1. Der Tag des LCM entfernen Sie die PEN-Frame-Folien von -80 ° C Gefrierschrank und Hydrat durch flach geneigte Objektträger in 90% EtOH für 2 Minuten, dann 75% EtOH für 2 min.
   1. Bereiten Sie 0,5% Toluidinblau durch Auflösen in der molekularen Wasser biology grade dann auswählen, sterilisieren, durch ein 0,2 um-Filter und lagern bei RT. Diese Lösung kann für bis zu 6 Monate weiterverwendet werden. Hinweis: Es wird dringend empfohlen, die Lösung vor, wie die Filtration kann ein paar Stunden dauern vorzubereiten.
2. Färben das Prostatagewebe durch flach geneigte Objektträger in 0,5% Toluidinblau für 5-30 sec. Entfärben das Gewebe durch Waschen gleitet 2 mal in depcH _{2 O} für 15 Sekunden, gefolgt von 75% EtOH für 30 Sekunden bis 3 Minuten. Hinweis: Fleck und destain Zeiten können eingestellt werden, um eine gute Färbung zu gewährleisten. Prostate neigt dazu, über Fleck.
3. Über PEN-Frame-Folien RNAase freien Trockenbehälter auf Eis.

4. Laser-Capture-Micro-Dissektion (LCM)

1. Unmittelbar vor LCM, trockenen Objektträger auf einer Trägerwärmer bei 42 ° C für 15 min. Chemische nur die Folie, die verarbeitet werden wird und der Rest auf Eis zu lagern, bis für sie bereit.
2. Schalten Sie LCM und Computer in dieser Reihenfolge, Mikroskop Macht, der Laserschlüssel, der Laserschalter und dann den Computer ein. Starten Sie die Laser Mikrodissektion Software.
3. Verwenden Sie die Software, um das Mikroskop, um die Folien und Sammelröhrchen Laststeuerung. Klicken Sie auf "unload Probenhalter", legen Sie die Folie mit den Abschnitten auf den Objektträger-Halter mit dem Gewebe nach unten und legen Sie die Objektträgerhalter in den entsprechenden Steckplatz im Mikroskop, klicken Sie dann auf "Weiter".
   1. Klicken Sie auf "unload Sammelröhrchen", Label und laden 0,5-ml-Röhrchen auf Rohrhalter und setzen Sie sie in den entsprechenden Steckplatz im Gerät. EinmalKappen gesichert sind, fügen Sie 35 ul Lysispuffer zu den Sammel Kappen und versuchen, Blasen zu vermeiden. Klicken Sie dann auf "OK".
      Hinweis: Wenn Verdunstung ist ein Problem, verdünnte den Puffer, wie folgt: 25 & mgr; l Lysepuffer mit 10 ul depcH2O.
4. In der Software, wählen Sie die Position, in der der Schieber in der Objektträgerhalter gelegt. Wählen Sie die Auffangkappe, um die LCM Probe zu sammeln.
5. Visualisieren und konzentrieren sich die Folie durch den Computer zu 10X. Verwenden Sie die Software, um den Laser, indem Sie "Laser" und dann "Kalibrierung" zu kalibrieren. Stellen Sie die Macht, Blende und Geschwindigkeit des Lasers, die Auswahl von "Laser" und dann "Control", damit der Laserstrahl die vollständig und effizient ausgewählten Bereich zu schneiden. Wiederholen Sie Einstellungen, bis die Laserschnitte vollständig durch das Gewebe.
6. Unter Verwendung des 8 "x 11" Pathologen Aufschlag als Leitfaden, benutzen Sie die "Form zeichnen" Werkzeug, um die gewünschten Bereiche der epithe umschreibenlium in der Ansicht und vermeiden Sammeln von Stroma.
   Hinweis: Mehrere Bereiche können auf einen Blick ausgewählt werden, aber nicht zu einer anderen Ansicht wechseln, ohne erste Schneid indem Sie auf das "cut shape" Werkzeug.
   1. Wenn ein Bereich nicht vollständig durch den Laser geschnitten bekommen benutzen Sie die "bewegen und schneiden" Werkzeug, um mehr als es manuell zu gehen. Bewegen Sie weiterhin das Ziel, neue Ansichten und wiederholen Laserschneiden bis Schieber vollständig seziert oder die gewünschte Menge an Gewebe gesammelt wurden (in der Regel 100 gutartigen Drüsen ergeben 150-500 ng RNA). (siehe Beispiel in Abbildung 1A).
7. Rohre aus der Sammlung Halter vorsichtig heraus, und schließen Sie die Kappen, eingedenk des Lysepuffers und Gewebe in den Kappen. Kurz zentrifugieren für 30 Sekunden, um Flüssigkeit und Gewebe in dem Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 30 min und bei -80 ° C, bis sie zur RNA-Isolierung.

5. Gesamt RNA-Isolierung mit einem Filter-basierten Kit und Qualitätsanalyse

1. Auftauen der Röhrchen auf Eis und bringe das Volumen der Lösung auf 100 ul.
2. Pre-nass das Mikrofilter eines RNA-Extraktions-Kit, indem 30 ul ofLysis Lösung auf die Mitte des Filters und lassen Sie es genießen whileperforming die nächsten beiden Schritte (mindestens 5 min).
3. In 3 ul LCM Additivlösung (im Kit enthalten) zum Lysat und mischen durch Vortexen für 5 Sekunden. Zentrifugieren für 30 Sekunden, um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln.
4. Zentrifugieren Sie die vorbenetzt Filter für ~ 30 Sekunden mit Höchstgeschwindigkeit, um Flüssigkeit zu entfernen.
5. Hinzufügen 1,25 Volumina (in diesem Fall 129 & mgr; l) von 100% Ethanol zu dem Lysat Mischung sanft Wirbel oder einer Pipette auf und ab. ** Diese Methode wird für große und kleine RNA-Spezies zu erholen.
6. Laden der Probe auf die vorbenetzte Mikrofilter und Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min, um die RNA zu dem Filter zu binden. Dann waschen Mikrofilter mit 180 & mgr; l von "Waschlösung 1, R21; Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 min.
   Anmerkung: Von diesem Zeitpunkt an alle Zentrifugationen sollte bei 13.000 xg oder maximalen Geschwindigkeit durchgeführt werden.
7. Waschfilter zweimal mit 180 ul des "Waschlösungen 2 und 3" bezeichnet, wie durch die Kitprotokoll gerichtet. Zentrifuge für 30 Sekunden, dann entsorgen Sie die Strömung durch, und drehen Sie den Filter für 1 min, um Restflüssigkeit zu entfernen und den Filter trocknen.
8. Übertragen Sie Filter, um eine neue Sammelröhrchen.
9. Warm Elutionslösung bis -95 ° C (im Kit enthalten).
10. Übernehmen 10 ul vorgewärmtes Elutionslösung in die Mitte des Filters, schließen Sie die Kappe und zu speichern für 5 min bei RT. Dann Zentrifuge für 1 min, um die RNA zu eluieren, und wiederholen Sie diesen Schritt einmal nachgeben ~ 20 ul RNA.
11. Führen die DNase I-Behandlung für 15 min bei 37 ° C.
12. Quantifizierung der RNA durch Spektralphotometer mit Absorption bei 260 nm. Das Verhältnis der optischen Dichte bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm verwendet, um die Reinheit zu beurteilenDie RNA (siehe Tabelle 1) ^15.

6. Genexpressionsanalyse

Hinweis: Gene Expression lange RNA-Spezies (wie mRNAs und lncRNAs) im Schritt 6.1 und kurze RNA-Spezies (wie miRNAs) gezeigt in Schritt 6.2. Verschiedene Kits sind für die RT-qPCR zur Verfügung und die Menge der RNA erforderlich variiert je nach Kit (so wenig wie 10 ng). RNA-Sequenzierung Analyse ist in 6.3 beschrieben.

1. Revers transkribieren (RT) die RNA in cDNA, indem 5 ul 20 ng / ul RNA-Probe mit 5 & mgr; l des RT Master Mix (RT-Puffer, dNTPs, Zufallsprimer, RT-Enzym, RNase-Inhibitor). Inkubieren der Reaktion für 25 min bei 25 ° C, dann 120 min bei 37 ° C und 5 min bei 85 ° C.
2. Verdünnen Sie die RT-Reaktion im Verhältnis 1:10 mit RNase-freiem Wasser und verwenden Sie 2,5 ul pro 10 & mgr; l qPCR Reaktion mit Primer oder Primer / Sondensätze für die Gene von Interesse.
   Hinweis: Zur Analyse von teilweise abgebauten RNA erleichtern, ist es ratsam, Primer fo verwendenr kürzere Amplikons (weniger als 100 bp) ^16. (Tabelle 2B)
   1. Für microRNA-Expressionsanalyse führen Sie die RT-Reaktion durch Mischen von 5 & mgr; l von 2-10 ng / ul RNA-Probe mit 5 & mgr; l des RT Master Mix.
      Hinweis: Jeder handelsüblichen PCR-basierte microRNA-Detection-Technologie erfordert den Einsatz von proprietären und spezifische RT-Primer.
3. Alternativ oder zusätzlich zur RT-PCR, der nächsten Generation verwenden Sequenzierung (RNA-seq oder kleinen RNA-seq), um verschiedene Arten von RNAs zu quantifizieren. Typischerweise verwenden 500 ng RNA für dieses Verfahren (Tabelle 3) und die Durchführung des Verfahrens, wie vom Hersteller und Nachweisinstrument.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

In einer früheren Studie haben wir gezeigt, die Verwendung von LCM zu epithelialen und stromalen Gewebe zu sammeln, um Expression Profiling durch RT-qPCR von mRNA und microRNA aus gefrorenen und FFPE Prostatagewebe des gleichen Patienten ⁴ zu vergleichen. LCM ist zeitaufwendig, vor allem, wenn große Menge an RNA ist für die nächste Generation Sequenzierungsanalyse gesammelt werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um den Arbeitsraum zu halten und Tools kostenlos RNase. Es wird empfohlen, um die ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Genexpressionsprofile von Humanproben kann eine Herausforderung sein, nicht nur für die Qualität oder Quantität von Gewebe zur Verfügung, sondern auch für die verschiedenen histologischen in einem bestimmten Gewebeprobe vorhanden Entitäten. Dies ist eine besondere Herausforderung in der Prostata, in der gutartigen Gewebe sind weitgehend stromalen Geweben und Bereichen Krebs frei von Stroma. LCM ermöglicht physikalische Trennung Prostatastroma und Epithel-RNA für eine genauere Signatur der zwei verschiedenen Zell...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111