Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie fluoreszenzmarkierte Proteindynamik zu Pflanzenzelloberflächen mit variablem Winkel Epifluoreszenzmikroskopie, die blinkende Punkte von GFP-markiertem PATROL1 ein Membrantransportprotein zu überwachen, in der Zelle Kortex der Stomata Komplex in Arabidopsis thaliana.

Zusammenfassung

A plant’s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed ‘residence time’) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

Einleitung

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell’s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes^1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant’s responses to environmental cues at the molecular level.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization³, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass–water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells⁵. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging^6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface⁷, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants⁶.

The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis⁸. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells⁸ and subsidiary cells⁹, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min⁹.

Protokoll

1. Herstellung von Jungpflanzen

1. Sterilisieren Sie die Samen.
   1. Vorbereitung der Sterilisationslösung durch Zugabe von 500 & mgr; l NaClO (verfügbares Chlor: 5,0%) und 1 ul 10% Triton X-100 und 500 & mgr; l sterilem Wasser.
   2. Platz ca. 10 transgenen A. thaliana Samen tragenden GFP-PATROL1 ⁸ in ein 1,5-ml-Tube.
   3. 1 ml 70% Ethanol-Lösung, und gut mischen durch Invertieren fünfmal. Lassen Sie für 1 min.
   4. Beobachten die Samen zu Boden sinken, der Röhre. In einem sauberen Sterilbank, entfernen Sie vorsichtig die 70% Ethanol mit einer Mikropipette, und fügen Sie 1 ml Sterilisationslösung. Gut mischen durch Invertieren fünf Mal und lassen Sie für 5 min.
   5. Die Samen zu waschen. Arbeiten noch unter aseptischen Bedingungen auf einer sauberen Werkbank, entfernen Sie vorsichtig die Lösung mit einer Mikropipette, und fügen Sie 1 ml sterilem Wasser. Wiederholen Sie dies fünf Mal. Die sterilisierten Samen können in sterilem Wasser bei 4 ° C für 2 Tage aufbewahrt werden.
2. Alsow den sterilisierten Samen auf einem 0,5% Gellangummi verfestigt 1/2 Murashige und Skoog Medium Platte (pH 5,8) ^9. Band der Deckel auf die Platte unter Verwendung von zwei Schichten von chirurgischem Band.
3. Inkubieren der Platte in der Dunkelheit bei 4 ° C mit einem kalten Speicherraum, O / N.
4. Übertragen Sie die Platte in eine Wachstumskammer bei 23,5 ° C mit einer 12-Stunden / 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus unter Verwendung von 100 & mgr; mol ^m -2 ^s -1 weiße Lichter gesetzt, und Inkubation für 7 Tage. Sämlinge mit Keimblättern von etwa 1 mm lang kann dann geerntet werden.

2. Sky Tropfen Montage der Cotyledon Proben

HINWEIS: Ein wichtiger Faktor bei der Probenvorbereitung für vaem Beobachtung wird die Vermeidung der Einschluss von Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas. Bubbles die Bildqualität von vaem erheblich reduzieren, indem Unterschiede im Brechungsindex. Eine einfache Methode, die wir "Himmel Drop" genannt Montage kann verwendet werden, um Blasen zu vermeidenzwischen der A. thaliana Keimblätter und das Deckglas. Dieses ist unmittelbar vor der Beobachtung durchgeführt werden.

1. Werden 30 ul Basalpuffer [5 mM 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure-Tris (MES-Tris) bei pH 6,5, 50 mM KCl, 100 uM _CaCl & sub2;] auf dem Zentrum eines Glasobjektträgers (Größe: 76 × 26 mm, Dicke: 1,0 bis 1,2 mm).
2. Entfernen Sie ein Keimblatt aus einem 7-Tage-alten Keimling mit Präparierscheren. Schwimmer den Kotyledonen mit der Beobachtungsseite nach oben auf dem Basalpuffer Abfall (Abbildung 1, Schritt 1).
3. Werden 30 ul Basalpuffer auf der Mitte eines Deckglases (Größe: 18 × 18 mm, Dicke: 0,12-0,17 mm) (Abbildung 1, Schritt 2). Drehen Sie das Deckglas auf den Kopf sanft. Die Oberflächenspannung wird die Puffertropfen herunterfällt. Halten Sie das Deckglas mit einer Pinzette an einer Kante. Platzieren der gegenüberliegenden Kante auf dem Glasträger, so dass der Puffer Abfall ist etwa über dem Keimblatt.
4. Mit der Kante des Deckglases noch auf der Folie, und immer noch das gegenüberliegende Kante mit einer Pinzette, passen die Position des Pufferabfall unter dem Deckglas, so daß es unmittelbar oberhalb des Keimblattprobe (1, Schritt 3). Lassen Sie das Deckglas. Montieren Sie einen Tropfen auf die Probe, was zu einem Präparat ohne Luftblasen.
5. Wischen Sie überschüssiges Puffer mit fusselfreien Gewebe. Beobachten Sie sofort die Vorbereitung (siehe Schritt 3).
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, um die Proben zu versiegeln.

3. vaem Beobachtung und Film-Übernahme

HINWEIS: Ein invertiertes Mikroskop ist mit einem TIRF Einheit und einer TIRF Objektivlinse mit einer numerischen Apertur von 1,49 ausgestattet: Die TIRF Mikroskopsystem ^{9 in} der vorliegenden Studie verwendet wird wie folgt beschrieben. Für computergestützte Steuerung der Lasereintrittswinkel wird ein Steuerfeld verwendet. Grün fluoreszierendes Protein (GFP) erregt wird mit einer 488 nm optisch gepumpte Halbleiterlaser und ter Fluoreszenz wird durch einen 510-550 nm Bandpassfilters erfasst wird, um die Autofluoreszenz von Chloroplasten verhindern. Die gemessene Maximalwert des Faserausgangsleistung von 13,0 bis 13,5 mW. Für den Nachweis, eine Elektronenvervielfachungs charge-coupled device (EM-CCD) Kamera-Kopf-System und ein C-Mount-Kamera Vergrößerungsänderungseinheit verwendet.

1. Kalibrieren der Laser Zentrierung und Fokussierung entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für eine präzise vaem Beobachtungen. Es wird dringend empfohlen, dass regelmäßige Kontrollen der Laserpfad Bereinigungsverfahren, die zu Ihrem Mikroskop durchgeführt werden.
   1. Bestimmen Sie die zentrale Lage mit einer Objektivlinse freie Lichtpfad an der Decke der Mikroskopie Raum beleuchtet. Um die zentrale Position zu markieren, setzen Sie einen farbigen Kreis Dichtung an der Decke (Abbildung 2, Stufe 1, 2).
   2. Beleuchten die Decke mit einer Objektivlinse (Abbildung 2, Schritt 3, 4). Bewegen Sie den illuminated Region in die Mittelstellung (Abbildung 2, Schritt 5). Fokus des Lasers (Abbildung 2, Schritt 6). Feinabstimmung der Position des fokussierten Laserstrahls auf die Mitte (Abbildung 2, Schritt 7).
2. Legen Sie ein Objekt auf den Tisch des Mikroskops und wählen Sie Zellen für die Beobachtung mit Hellfeldbeleuchtung.
3. Überprüfen Sie, dass das fluoreszierende Protein in den Zellen beobachtet werden, und stellen Sie die z-Achse Position an der Zelloberfläche unter Verwendung von Epifluoreszenz-Beleuchtung (3A).
4. Führen vaem Beobachtungen.
   1. Neigen Sie den Eintrittswinkel des Laserstrahls allmählich mit der Controller-Box. Zur gleichen Zeit, zu überwachen das Live-Bild sorgfältig. Zunächst wird das Bild unscharf werden (3B).
   2. Da die Laserwinkel zunimmt, wird die vaem Bild weniger unscharf werden, was schließlich eine klare Bild (3C und D). An dieser Stelle aufhören Increasingen die Laserwinkel. Wenn das Fluoreszenz-Signal verloren gegangen ist, zu verringern, um einen flacheren Winkel.
   3. Feinabstimmung der Lasereintrittswinkel, um ein besseres Bild zu erhalten. Feinabstimmung der Z-Achsen-Position kann auch das Bild zu verbessern. Passen Sie bei Bedarf die optischen Parameter (Laserleistung, Wellenlänge und Filtersatz) und die Bildsensorparameter [Bildgröße, Belichtungszeit, Verstärkung, Digitizer und Elektronen-Multiplikation (EM) Verstärkung].
      HINWEIS: In dem oben beschriebenen Fall der TIRF Mikroskopausrüstung, sind wie folgt repräsentativen Parametern. Vergrößerung der Linse direkt vor der Kamera: 2X; Laserleistung: 1,0 mW; Bildgröße: 512 x 512 Pixel; Belichtungszeit: 100 ms; Gewinnen: 5 x; Digitizer: 11 MHz; und EM-Gewinn: 100.
5. Erwerben Sie einen Film als eine mehrseitige TIFF-Image-Datei mit der kommerziellen Mikroskop-Software. Hierbei ist von GFP-markierten Punkte blinkt auf der Oberfläche der Spaltöffnungszellen der Film.
   HINWEIS: Vertreter Bildaufnahme Bedingungen sind wie folTiefen. Erfassungsmodus: Strom in den RAM; Anzahl der Frames: 600; und mehrseitige TIFF-Dateigröße: ~ 302 MB.

4. Kymograph Analyse zur Quantifizierung von GFP-markierten Dot Verweilzeit Mit Fiji Software

1. Installieren Fidschi ("Fidschi ist nur ImageJ) Software ¹⁰ Verwendung der Autoren Anweisungen (http://fiji.sc/Fiji).
2. Führen Fiji und öffnen Sie die erworbenen mehrseitige TIFF-Datei mit Hilfe des Fidschi-Menü "Datei-Öffnen".
3. Platzieren Sie eine Linie auf der Stelle von Interesse, mit der Fidschi-Werkzeugleiste Menü "Straight Line Selection Tool". Optional können Sie die "Segmented Linie Selection Tool" oder "Freihandlinie Selection Tool". In den hier vorgestellten Ergebnisse, wurde eine gerade Linie von 100 Pixeln (entsprechend 8,0 & mgr; m) auf einer Tochterzelle (4A) platziert.
4. Einen kymograph Bildes im Menü Fiji "Bild-Stacks-Dynamische Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (4B). Optional "Vertikal spiegeln" und "Um 90 Degrees" in einem Kontrollkästchen Fenster sind ebenfalls verfügbar (nicht in den hier vorgestellten Ergebnisse verwendet). Die x- und y-Achse in der kymograph Bild zeigen die Linienposition (100 Pixeln entsprechend 8,0 & mgr; m) und Beobachtungszeit (600 Pixel entsprechend 60 sec) bezeichnet. Wenn die kymograph Bild nicht zufriedenstellend ist, die Position und die Art (gerade, segmentiert und Freihand) der Linie auf mehrseitige Bild der geändert werden kann. Als die Linie ändert, ändert dynamisch die kymograph Bild. Speichern Sie eine kymograph Bild als TIFF-Datei über das Menü Fiji "Datei-Speichern unter-Tiff".
5. Messen der Länge des Tropfens in der Ausrichtung der Zeitachse.
   1. Zur Geräuschreduzierung durchführen, tragen Sie eine Gauß-Filter auf die kymograph Bilder mit der Fidschi-Menü "Process-Filter-Gaußschen Weichzeichner". Die "Sigma (Radius) "Parameter abstimmbar (1 Pixel Radius wird für die vorgestellten Ergebnisse verwendet).
   2. Segment die Signalbereiche durch Schwellen, über das Menü Fiji "Bild-Adjust-Threshold".
      HINWEIS: Es gibt mehrere Schwellen Algorithmen zur Auswahl. Dargestellt Ergebnissen wurde die "Yen" Algorithmus ausgewählt (4C).
   3. Bereiten Sie, um die Zeit (y) messen -Achse Länge des Blobs über das Menü "Analysieren-Set Messungen". Überprüfen Sie die "Begrenzungsrechteck" im Fenster "Set Messungen". Im Idealfall sollte die Fläche so klein wie möglich sein, um Rauschen auszuschließen. Hier wurde die Mindestfläche auf 50 Pixel festgelegt. Messen Sie die Zeit (y) -Achse Länge des Blobs über das Menü "Analysieren Analysieren-Particles". Um die Ergebniswerte zu erhalten und zu beweisen, Glaubwürdigkeit der Messbereiche, überprüfen Sie die "Ergebnisse" und "In-Manager </ em> "Boxen.
   4. Werte in der Spalte "Größe" gibt die Zeit (y) -Achse Längen für die gemessene Blob (4D). Speichern Sie die Werte mit der Ergebnistabelle Menü "Datei-Speichern unter" und berechnen und zu verarbeiten, die Datenmenge der Bild blob Dauern unter Verwendung eines statistischen Verpackung und / oder Tabellenkalkulationsprogramm (4E).

Ergebnisse

In diesem Video-Artikel, der Protokolle für vaem Beobachtung der GFP-PATROL1 in A. thaliana cotyledon Stomata komplexen Zellen werden zur Verfügung gestellt. Sky Drop Montage ist ein einfaches Herstellungsverfahren, die dazu beitragen, das Auftreten von Luftblasen in vaem Zubereitungen von A. kann thaliana Cotyledonen (Abbildung 1). Hoher Neigungswinkel der Eintritts Laser und / oder z-Positionierung von Proben für vaem liefert ein unklares Bild. Wenn das geschieht, ist es ...

Diskussion

In diesem Video-Artikel werden Protokolle zur Überwachung und Messung des dynamischen Verhaltens des GFP-PATROL1 Punkte auf der Stomata Komplex aus Arabidopsis thaliana angegeben. Wie hier gezeigt, ist vaem Beobachtung ein leistungsfähiges Werkzeug für Live-Imaging von Pflanzenzelloberflächen. Unter den für die GFP-PATROL1 Überwachungs hier verwendeten experimentellen Bedingungen gab es sehr wenig Fluoreszenzphotobleichen in der Probe für 1 Minute zur Videoaufzeichnung verwendet wird, weil die hochsensib...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser angle control box	Chuo Seiki	QT-AK
Optically pumped semiconductor laser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter	Olympus	U-FBNA
EM CCD camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual	Olympus	AX7385	Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 degrees)