Eine einfache Methode für die automatisierte Festphasenextraktion von Wasserproben für die immunologische Analyse von kleinen Schadstoffe

Zusammenfassung

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Zusammenfassung

Eine neue Methode zur Festphasenextraktion (SPE) des Umweltwasserproben vorgeschlagen. Der entwickelte Prototyp ist kostengünstig und benutzerfreundlich und ermöglicht eine schnelle, automatisierte und einfache SPE durchzuführen. Die vorkonzentrierte Lösung ist mit der Analyse durch Immunoassay kompatibel ist, mit einem niedrigen Gehalt an organischem Lösungsmittel. Es wird ein Verfahren zur Extraktion und Vorkonzentrierung natürliche Hormon 17β-Östradiol in 100 ml Wasserproben beschrieben. Umkehrphasen-SPE mit Octadecyl-Silica Sorbens durchgeführt, und die Elution wird mit 200 ul Methanol 50% v / v durchgeführt. Elutionsmittel wird durch Zugabe von VE-Wasser, die Menge an Methanol senken verdünnt. Nach der Vorbereitung der Säule manuell SPE wird das gesamte Verfahren automatisch innerhalb von 1 h durchgeführt. Am Ende des Prozesses wird Estradiol-Konzentration durch Verwendung eines handelsüblichen Enzym-gekoppelten Immunsorbens-Test (ELISA) gemessen. 100fach Vorkonzentration erreicht wird und der Methanolgehalt in 10% v / v. Vollständige Wiederherstellungen des Molekülswerden mit 1 ng erreicht / L versetzt entionisiertem und synthetischem Meerwasserproben.

Einleitung

Probenvorbereitung ist ein wichtiger Schritt in jedem Analyseprozess. Insbesondere die Entfernung von Matrixeffekten, Verminderung von Interferenzen, und die Anreicherung des Analyten erforderlich sind, um präzise Ergebnisse zu erhalten, und zu erreichen geringe Nachweisgrenzen. Endokrin wirksamen Substanzen (EDCs) sind von besonderer Bedeutung wegen ihrer Wirkung auf die lebenden Organismen, auch wenn in sehr geringen Konzentrationen in der Umwelt. Das natürliche Hormon 17β-Estradiol ist auf dem EU-Wasserverschmutzung Merkliste vorhanden und neigen zu der Liste der im Rahmen der Europäischen Wasserrahmenrichtlinie geregelt prioritären Stoffe aufgenommen werden. Festphasenextraktion (SPE) wird üblicherweise für die Analyse von kleinen Verunreinigungen in Wasser aufgebracht, wobei sowohl chemische ^{1-5 (Chromatographie,} Massenspektrometrie) und immunologischen Nachweisverfahren ^6-9. Letzteres gesammelt Interesse auf dem Gebiet der Umweltüberwachung, wie Immunoassays, sind in großen Vielzahl von Formaten, sind spezifisch für die target Analyten und erreicht niedrige ^{Nachweisgrenze.} 6 sind ^{7, 10, 11} verschiedenen Enzymimmuntests (ELISA) im Handel erhältlich und ermöglichen es, mehrere Proben gleichzeitig auf einem Multi-Well-Platte zu analysieren. Das Verfahren besteht in aufeinanderfolgenden Reaktionsschritte, die ein paar Stunden dauern kann. Das Endprodukt der Reaktion kann optisch detektiert werden, um die Konzentration des Zielmoleküls auf der Basis einer Kalibrierungskurve zu bestimmen.

SPE klassischen Verfahren umfassen Sorbens Vorkonditionierung, Probenextraktion, Waschen, Elution und Eindampfen des Eluats. Die zur Verdünnung des Extraktes verwendeten Lösungsmittels wird so gewählt, je nach dem Nachweisverfahren. Für immunologische Verfahren, die Menge des organischen Lösungsmittels beeinflusst stark die Empfindlichkeit des Verfahrens. ¹²

Neben der Rückgewinnung und der Pre-Konzentration Performances, muss das Verfahren auch einfach zu sein und kosteneffizient. Automation des procedure hilft, menschliche bezogene Fehler zu verringern. In unserer bisherigen Arbeit ¹³ stellten wir unsere Prototypen für die automatisierte SPE, und unsere Methode wurde auf die Analyse von dem natürlichen Hormon 17β-Östradiol in Meerwasserproben angewendet. Mit der vorliegenden Video möchten wir die technischen Vorteile unserer Methode im Vergleich zu traditionellen Offline-und Online-SPE und seiner besonderen Kompatibilität mit Nachweis durch Immunreaktionen hervorheben. Wir beschreiben die Wasserproben zum Nachweis von 17β-Estradiol verwendete Protokoll. SPE mit Octadecyl-Silica (C18) Sorptionsphase und die Elution wird mit verdünntem Methanol durchgeführt wird.

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Protokoll

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt auf 100 ml Wasserprobe mit C18 Sorbens und Elution mit 50% v / v Methanol die SPE durchgeführt. Die angereicherte Probe wird verdünnt, um 10% V / V Methanol vor der Analyse mit einem Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) -Kit erreichen.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie die Wasserproben
   1. Vor jeder weiteren Schritt, filtern jeder 100 ml Wasserprobe mit 0,2 um Porengröße Filter.
   2. Spike-Bringen der Probe mit gewünschten Konzentration durch Verdünnen geeigneten Volumen Referenzlösung in einem Volumen von Wasser. B. Vorbereitung 100 ml Wasserprobe mit 100 ng / l E2 durch Verdünnen 3,3 ul E2 Referenzlösung in einer Konzentration von 300 ug / l. Verdünnen Sie diese Lösung zehnmal um eine Probe versetzt mit 10 ng / L E2. Verdünnen dieser letzteren zehn weitere Male, um eine Probe von 100 ml mit 1 ng / L E2 zu erhalten.
   3. Legen Sie die filtrierte Probe (unmodifiziert oder Stachel) in einer Glasflasche mit GL45 Gewinde. Verwenden Sie die Probe am selben Tag. Nehmen Sie einen kleinen Bruchteil, um mit dem ELISA analysiert werden, um Anfangskonzentration zu schätzen.
2. Vorzubereiten 300 ul Elutionsmittel durch Verdünnen Methanol in entionisiertem (Di-) Wasser auf 50% v / v in einer engen Röhre.

2. Herstellung des SPE Column

1. Vorbereitung einer 20 mg / ml Suspension von Octadecyl-Silica Sorbenspartikel durch Zugabe von zunächst 1600 ul Methanol und 400 ul Di-Wasser auf 40 mg Umkehrphasenchromatographie Sorbens. Dicht schließen Sie den Deckel und rühren mit einem Wirbel.
2. Installieren der Bodenmembran in Spalte
   1. Wählen Sie eine Nylon-Membran mit einer Porengröße 11 & mgr; m und auf einer doppelten Schicht von Anti-Staub-Gewebe. Mit einem Durchmesser von 3 mm Punsch, schneiden Sie zwei kleine Teile in der Membran.
   2. Schnappen Sie sich eines der kleinen Membranen mit Flachbild-End-Filter Pinzette und legen Sie sie auf einer Seite der Säule.
   3. Schrauben Sie die Flachbodenanschluss mit dem Rohr und festziehen. Die Membran ist now an Ort und Stelle und das Sorbens sicher hinzugefügt werden. Zeichnen einen Pfeil auf dem Körper der Säule in Richtung zum Ende, an dem die Membran platziert wurde.
3. Vorbereiten des Sorbens gepackte Säule
   1. Befestigen Sie die Säule an der Halterung mit dem Pfeil nach unten. Die Spalte muss möglichst senkrecht eingestellt werden.
   2. Befestigen Sie eine leere 10 ml Einwegspritze mit dem Ende des Rohres der Spalte, indem Sie die Luer-Lock-Anschlüsse.
   3. Bereiten Sie eine Mikropipette mit einem 20-200 ul Spitze, die Lautstärke auf 100 ul. Diese Pipettenspitze Format ist auf die Größe des Sorbenskolonne hergestellt werden angepasst. Das Verfahren wäre schwieriger mit größeren Pipettenspitzen, wie beispielsweise die, die mit 1 ml Pipetten verwendet.
   4. Man schüttelt die Sorptionsmittelsuspension mit einem Wirbel, und schnell Je 100 & mgr; l in der Mitte auf der Säule. Während der Injektion, absaugen sanft alle pipettierten Lösung Trog die Membran mit Hilfe der Spritze mit der anderen Hand. Zu diesem stAlter, muss die Lösung Füllen der Spritze frei von Partikeln sein, und ein Partikelbett kann schließlich in der Säule festgestellt werden.
   5. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 weitere Male durch Rühren der Stoffsuspension zwischen allen Pipettierschritte, um homogene Suspension der Partikel in der Lösung zu gewährleisten. Die sich ergebende Spalte enthält 6 mg Sorbens.
   6. Wenn die 300 ul Suspension wurden geladen und durch Absaugen mit der Spritze getrocknet, halten Sie die Spritze in Position und legen Sie die zweite Nylon-Membran auf der Oberseite unter Verwendung der Zange mit der anderen Hand.
   7. Schrauben Sie den zweiten Verbinder mit Schlauch und entsorgen Sie die Spritze. Die SPE-Säule betriebsbereit.

3. Vorbereiten des Systems

1. Ziehen Sie die SPE-Säule auf dem Gerät mit Hilfe der Luer-Lock-Anschlüsse. Muss der Pfeil in die gleiche Richtung wie der auf dem Endgerät angezeigt werden können.
2. Schließen Sie die Flasche die Probe auf die Vorrichtung, die durch Verschrauben dervorgesehen GL45 Sicherheitskappe auf sie.
3. Laden Sie 200 ul Laufmittel in der "Eluent" Reservoir.
4. Last 800 ul von Di-Wasser in der "Verwässerung" Reservoir.
5. Legen Sie eine Flasche auf dem Abfallausgang, um das verarbeitete Wasser während der Extraktionsschritt zu sammeln. Das Format ist nicht wichtig, aber das Volumen muß ausreichend groß in Bezug auf das Probenvolumen ist.
6. Legen Sie eine kleine Ampulle an der Sensorausgang mit dem minimalen Volumen Kapazität von 1,5 ml. Ein Volumen von maximal 1 ml zu klein sein wird als Blasen an dieser Steckdose zu bilden, wenn das Sammeln angereicherten Laufmittel und Verdünnungspuffer.
7. Überprüfen der Druckregler ist in geschlossener Position, indem Sie ihn manuell, Umkehr den Uhrzeigersinn, bis eine weitere Bewegung ist nicht möglich.

4. SPE mit dem Prototype

1. Schalten Sie den Prototyp durch Drücken der Taste auf der Rückseite.
2. Herstellung der Benutzerschnittstelle und die Auswahl der Programm
   1. Öffnen Sie die Benutzeroberfläche. Auswählender Kommunikationsanschluss des Computers, an den das Gerät aus der Liste verbunden ist, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter".
   2. Geben Sie die Werte 580 für pset und 30 für dpset. Die Pumpe einzustellen, um den Druck in dem Drucksystem und Speicher bei 580 ± 30 mbar zu halten beim Laufen.
   3. Wählen Sie den automatischen Modus.
   4. Im automatischen Modus Ecke, laden Sie die Programmdatei in das Feld 'Konfigurationsdatei Pfad'.
3. Einstellen der Druckregler
   1. Starten Sie die Pumpe.
   2. Drehen Sie manuell den Druckregler, bis der Wert für die preg zu lesen ist schlechter, aber nahe bei 320 mbar.
   3. Halten Sie die Pumpe.
4. Starten des SPE-Verfahren
   1. Drücken Sie "Start" in der automatisierten Modus Ecke. Die Pumpe einschalten und die Extraktion, Elution und Verdünnungsschritte automatisch aufeinanderfolgen. Das gesamte Verfahren für eine 100 ml-Probe wird in 50 min durchgeführt.
   2. Überprüfen Sie den Wert der preg. 350 mbar während des Extraktionsschritt, um eine optimale Durchflussgeschwindigkeit zu gewährleisten - Es muss im Bereich 320 sein.
   3. Schließen Sie die kleine Phiole und lagern bei 4-5 ° C im Dunkeln bis zur Analyse. Analysen durchzuführen in der folgenden 30 Stunden, um den Abbau des Analyten zu verhindern.
   4. Entsorgen Sie das aufbereitete Wasser.
5. Reinigung des Systems
   Hinweis: Nach jedem Extraktionsverfahren das System muss gereinigt werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
   1. Bereiten Sie eine 10 ml Lösung von Methanol 70% v / v in einer GL 45 Glasflasche.
   2. Ziehen Sie das SPE-Säule und stecken Sie den Schlauch mit Anschlüssen.
   3. Im automatischen Modus, wählen Sie die Datei "Reinigung" und starten Sie es mit dem gleichen Druckeinstellungen.

5. Nachweis der Estradiolkonzentration mit ELISA

1. Vorbereitung der Eichproben mit Konzentrationen, wie im Protokoll mit dem ELISA-Kit, der verwendet wird angegeben. Bereiten Sie eine calibration mit der gleichen Matrix wie die Probe, und eine Kalibrierung mit Methanol 10% v / v eingestellt.
2. Abgeben der erforderlichen Menge der Probe in die Vertiefungen auf der Platte, nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Eichproben, unveränderten und Stachelwasserproben, die gefiltert wurden, aber mit SPE in Methanol 10% V nicht bearbeitet und angereichert Proben / v. Verwenden Sie 3 Vertiefungen pro Probe, um den Fehler mit dem Assay zu reduzieren.
3. Folgen den Hinweisen des Protokolls, das mit dem Kit für die Zugabe von Reaktanten, Inkubationszeit, Waschen und eine weitere Reaktion mit dem Enzym zur Verfügung gestellt.
4. Lesen Sie das optische Signal in jeder Vertiefung nach den Anweisungen des Herstellers Kit mit einem Plattenlesegerät Instrument und sammeln Sie die Daten.
5. Verwendung der Software des Plattenleser Instrument, um die Kalibrierungskurven, die angereicherten Proben mit Methanol 10% v passen und bestimmen die E2-Konzentration in der ursprünglichen Probe mit derselben Matrix, und / v.

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Ergebnisse

Reproduzierbarkeit der Sorbenspackung wurde durch Trocknen ausgewertet und Gewichten des pipettierten Sorbens in Glasfläschchen und das Ergebnis ist in Fig. 1 Reproduzierbarkeit der zum Zeitpunkt der Injektion gezeigt wurde 100 ml-Proben getestet, wie in Abb. 2 in der anfänglichen Konzentration und Pre- gezeigten konzentrierte stockte Proben wurden unter Verwendung eines handelsüblichen ELISA-Kit für die 17β-Estradi...

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Diskussion

Ein neues Verfahren zur Herstellung von Wasserproben, gefolgt von Analyse unter Verwendung von Immunoassay vorgeschlagen. Das Gerät ermöglicht es, Festphasenextraktion automatisiert und benutzerfreundliche Art und Weise durchzuführen.

Die Filtration der Wasserprobe vor der Injektion in das System ist kritisch. Etwaige Partikel noch in der Lösung vorhanden wäre möglicherweise verursachen Verstopfung des fluidischen Netzwerk und behindern die SPE-Säule. Ein weiterer wichtiger Schritt is...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 - 3,000 ng/L