Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Zusammenfassung

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Zusammenfassung

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

Einleitung

Das Verständnis von Proteinstrukturen auf atomarer Ebene ist der Schlüssel zur Aufdeckung der molekularen Grundlagen der biologischen Wege und Krankheiten. Röntgen Proteinkristallographie ist das am häufigsten verwendete / anwendbares Verfahren zur Bestimmung von hochmolekularen Strukturen. Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren ist, ausreichende Mengen an korrekt gefalteten, reines Protein. Dies wird ein Problem besonders bei der Arbeit mit sezerniertes Säugerproteinen, die bestimmte post-translationale Modifikationen unterzogen werden.

Bakteriell exprimierten Proteine ​​sind die Hauptquelle für kristallisierte Proteine ​​in der Proteindatenbank ¹ abgeschieden. Bakterielle Expressionssysteme sind weitgehend bevorzugt, da sie schnell, kostengünstig und erzeugen typischerweise hohe Ausbeuten an Protein. Jedoch extrazellulären Domänen von Säugerproteinen in Bakterien exprimiert werden oftmals nicht richtig gefaltet sind, zum Erhalten homogen fo in welchem ​​Fall die Rückfaltung und aufwendige Reinigungsschritte erforderlich sindlded Protein. Darüber hinaus haben viele Säugetierproteinen erfordern posttranslationale Glykosylierung, um die richtige Faltung ² zu erzielen. Obwohl die Expression und Glycosylierung in Hefe oder Insektenzellen können die Falte Problem zu überwinden, post-translationale Modifikationen einschließlich Glykosylierung, unterscheiden sich erheblich von denen von ^{Säugetierzellen} 3, wodurch Proteine, die mit fehlerhaften oder nicht homogenen Modifikationen.

Säugerzellen alle erforderlichen molekularen Maschinerie zum richtigen post-translationalen Modifikationen und Faltung zu gewährleisten; aber diese Expressionssysteme sind in der Regel nicht von den meisten Labors bevorzugt, aufgrund der begrenzten Ausbeuten und hohen Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. Polyethylenimin (PEI), ist ein Standard-Transfektionsreagenz relativ billig, aber erlegt beträchtliche Zytotoxizität und niedrige Transfektionseffizienz, was zu erhöhten Kosten in Zellmedien, DNA, und Kultivieren Ausrüstung. Viele Alternativen zu PEI sind unerschwinglich teuer. Wir sprechenDiese Probleme mit der Beschreibung einer Kombination von verbesserten Zellkulturwerkzeuge und chemisch modifizierte PEI für die schnelle und relativ kostengünstige Methode für die Expression von sezernierten Säugetierproteinen, gefolgt von der Einzelschritt-Reinigung. Das robuste Verfahren ergibt ausreichende Ausbeuten zur funktionellen und biochemischen Untersuchungen ^{4 und} in einigen Fällen führt Protein zugänglich, um die Kristallisation ohne weitere Reinigung.

Dieses Protokoll beschreibt verschiedene Techniken, um die Expression zu maximieren und die Ausbeute für sezernierte Säugetierproteinen in humanen embryonalen Nieren (HEK) 293F Zellen in Suspension gezüchtet. Transfektionseffizienz (und Kosten), Protein-Produktion und Reinigung sind alle stark von folgenden dieses Protokoll erweitert. PEI durch Zugabe von Carbamaten durch eine Einzelschritt-Ringöffnungsreaktion modifiziert (PEI-TMC-25 Synthese und Eigenschaften im Detail in Lit. ^{5 beschrieben)} verbessert Transfektionseffizienz, verringert die Zytotoxizität von kationischenMembranzerstörung und entsprechend reduziert Experiment Kosten. Weiterhin werden die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proteinexpression stark mit der Zugabe der Kultur Ergänzungen Glucose und Vitamine zuzuführen verbessert. Wichtig ist für die Herstellung von glycosylierten Proteinen, Behandlung mit kifunensine, eine ungiftige chemische Inhibitor von Mannosidase I, produziert Proteine ​​mit definierten, unreife Glycane, die durch die Endoglycosidase EndoHf entfernt werden, um Proteine ​​mit einer einzelnen N-Acetylglucosamin anstelle von zu ergeben ein voller Länge N-gebundene Glycan ^6. Schließlich wird die Sekretion von Proteinen in einem serumfreien, chemisch definierten Medium ermöglicht eine schnelle und leichte Reinigung für strukturelle und biochemische Untersuchungen. Einzelschritt-Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA-Harz) Reinigung entfernt die meisten verunreinigenden Spezies im Überstand und in einigen Fällen kann Protein mit ausreichender Reinheit für eine Kristallisation ergeben.

Protokoll

1. Herstellung von Milligramm-Mengen von Plasmid-DNA für eine groß angelegte Transiente Transfektion

1. Klonierung des Proteins von Interesse in einer hohen Kopienzahl Säuger-Expressionsvektor unter Verwendung von Restriktionsstelle Klonierung oder andere geeignete Technik.
   1. Für optimale Ergebnisse verwenden pHLsec ⁷ Vektor, der hat einen eingebauten in C-terminal 6His-tag, ein starker Promotor Kozak-Sequenz und eine optimierte Sekretionssignal.
2. Verwandeln Sie das Plasmid auf kompetente Zellen.
   1. Mit 20 ul kompetenter E. coli-Zellen auf 1 & mgr; g Plasmid-DNA und Inkubieren auf Eis für 30 min.
   2. Hitzeschock-Zellen bei 42 ° C für 35 sec, dann auf Eis für 2 min inkubiert.
   3. Werden 300 & mgr; l mikrobielle Wachstumsmedium (SOC) und bei 37 ° C für 45 Minuten, bei 220 UpM schüttelnd.
   4. Platte Zellen auf Agar-Platte mit geeigneten Antibiotika-Selektion.
      1. Verwenden von 100 & mgr; g / ml Carbenicillin, wenn das Plasmid in der pHLsec vector.
3. Kultur Kolonien in 250 ml Luria Broth (LB) Medium, ergänzt mit 100 ug / ml Antibiotikum (Carbenicillin) O / N bei 37 ° C, bei 220 Upm Schütteln.
4. Reinigen DNA aus der Kultur unter Verwendung von Hallo-Geschwindigkeit Plasmid Maxi Kit nach Herstellerprotokoll.
   1. Eluieren der DNA in Puffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) anstelle von Puffer TE.
   2. Aliquots des gereinigten Plasmids an Menge für die Transfektion und Speicherung erforderlich bei -20 ° C.

2. Großflächige, Kultur und transiente Transfektion von Zellen 293F

1. Supplement 1 L 293F Medien mit 10 ml Glutamin und 5 ml Pen / Strep (beide 100x). Lagerung bei 4 ° C. 5 ml Pen / Strep ist eine ausreichende Festigkeit in serumfreien Bedingungen und das reduzierte antibiotische Konzentration verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen während der Transfektion, die Proteinausbeute verbessert.
2. Kultur 293F-Zellen in 300 ml Medium in 1 L Polycarbonat Erlenmeyer-Kolben mit belüfteten Kappes bei 37 ° C und 8% _CO 2, während sie in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator Schütteln.
3. Verdünnte Zellen bis 5 x 10 ⁵ / ml Dichte einen Tag vor der Transfektion.
4. Am Tag der Transfektion Ergänzung Kulturmedium durch Zugabe von 10% Volumen von 2% w / v Cell Boost in 293F Medien.
   1. Messung der Glucosekonzentration unter Verwendung einer Glukoseüberwachungsvorrichtung gemß den Anweisungen des Herstellers und die Verwendung Ergänzungsmittel erforderlich, um eine Glukosekonzentration von 500 mg / dl zu erreichen.
5. Hinzufügen kifunensine (1 ug / ml Endkonzentration) bei diesem Schritt zu Proteinglykosylierung steuern.
6. Berechnung des Volumens von DNA 1 & mgr; g Plasmid pro 1 x ¹⁰ 6 Zellen benötigt. Unter sterilen Bedingungen, verdünnte DNA in 5 ml serumfreiem Medium.
7. Berechnen Sie Volumen von Transfektionsreagenz für 1 & mgr; g Plasmid pro 2 ul Transfektionsreagenz erforderlich. Unter sterilen Bedingungen, verdünnten Transfektionsreagenz (PEI-TMC-25) in 5 ml serumfreiem Medium.
8. HinzufügenTransfektionsreagenz in die DNA-Lösung in 1 ml-Schritten, Mischen sanft. Inkubation 30 min bei RT Reagenz-DNA-Komplexe zu bilden. Dann fügen Sie die Lösung auf die Zellen in einer tropfenweise Mode.
9. Erlauben transfizierten Zellen an Protein für 72 bis 96 h zum Ausdruck bringen. Ergänzung mit ~ 10% Volumen Cell Boost Medien täglich, oder wie erforderlich, zu halten Glukosemesswert von 400 bis 600 mg / dl.

3. Reinigung

1. Dekantier-Kultur in ein Zentrifugenflasche, Zentrifuge für 20 min bei 1.300 × g Zellen zu pelletieren und zu sammeln, dann den Überstand. Wenn nötig, drehen ein zweites Mal und / oder verwenden 0,22 um Filter, um Überstand zu klären.
2. Zugabe von 10% Volumen 10x Ni-NTA-Bindungspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 MK _{2 HPO 4,} 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM Imidazol).
3. Vorbereitung einer Schwerkraftsäule durch Zugabe von 2 ml von Ni-NTA-Aufschlämmung in einer Spalte und Äquilibrieren mit 10 Säulenvolumina (CV) des 1x Bindungspuffer. Wenn möglich, alle Spalten Schritte in einem 4 ° C Raum. AlternativEly, Chill-Protein und alle Puffer auf Eis vor der Spalte Schritt, und halten Protein und gesammelt Durchfluss auf Eis.
   Anmerkung: Ni-NTA-Aufschlämmung beträgt 50% Harz nach Volumen und angegebenen Bindungskapazität des Herstellers beträgt 50 mg / ml. Für mehrfachen Gebrauch Ni-NTA-Perlen kann wieder aufgeladen werden
4. Fließt der Überstand über das Harz und sammeln Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt.
5. Waschen mit 10 CV Waschpuffer (300 mM NaCl, 50 mM K _{2 HPO 4,} 20 mM Imidazol, pH 8).
6. Eluieren des Proteins in 5 CV Elutionspuffer (300 mM NaCl, 50 mM K _{2 HPO 4,} 250 mM Imidazol, pH 8).
7. Wenn Deglykosylierung ist erforderlich:
   1. Bis zu einem Endvolumen von 0,5 ml Konzentrat Eluat 0,43 ml unter Verwendung einer Zentrifugation Konzentrator. Wenn Niederschläge gebildet, pelle jede Trümmer durch Zentrifugation bei 16.000 × g und 4 ° C.
   2. In 50 ul 500 mM Na-Citrat pH 5,5.
   3. Mit 20 ul EndoHf (1 x ¹⁰ & sup6; U / ml). Inkubation bei RT für 2 h.
      NichtE: Das Enzym arbeitet optimal bei 37 ° C, was dazu führen kann die konzentrierte Protein zu aggregieren. Verlängern Sie die RT Inkubation wenn Deglykosylierung, durch SDS-PAGE und Immunoblotting untersucht, ist unvollständig. Das Enzym muss nicht Aktivität bei 4 ° C.
   4. Um EndoHf entfernen: Wash Amyloseharz 3x in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder Endlagerung Puffer. Inkubieren Protein mit Harz für 1 h bei 4 ° C. Spin 5 min bei 1000 xg zu pelletieren Perlen und sammeln Sie den Überstand.
   5. Konzentrat Protein unter Verwendung geeigneter Molekulargewichtsgrenze Zentrifugation Filter und Pufferaustausch in Lagerungspuffer (150 mM NaCl und 20 mM HEPES pH 7.5).

Ergebnisse

Hierin folgt die Ergebnisse dieser Expressionssystem zu einem sekretierten 13 kDa-Immunglobulin (Ig) -Domäne von menschlichem Protein Auslöse Rezeptor auf myeloide Zellen 2 (hTREM2, Reste 19 bis 132) angegeben angewendet wird. TREM2 ist ein Typ I Transmembranprotein, das eine einzelne extrazelluläre Ig-Domäne, die zwei Disulfidbrücken und zwei N-verknüpfte Glykosylierungsstellen aufweist. Im Gegensatz zu anderen Ig-Domänenproteine ^{​​8 wurde} TREM2 nicht zugänglich Rückfaltung aus bakteriellen Eins...

Diskussion

HEK 293F-Zellen bieten robuste Produktion von Proteinen erfordert post-translationale Modifikationen. Dieses System ermöglicht eine schnelle und skalierbare Ausdruck der nativ gefalteten Proteine ​​enthalten, Disulfide, Glykosylierung und Phosphorylierung, die sonst mit mehr Routine Expression Tools abwesend sein würde. Darüber hinaus kann dieses System für die Expression und Reinigung von Multiproteinkomplexen einfach durch Co-Transfektion von mehreren Plasmiden verwendet werden. Neben TREM2 Dieses System wurde...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919