Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

Zusammenfassung

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Zusammenfassung

Thymus, das wichtigste Organ für die Erzeugung von αβ-T-Zellen und das Rückgrat des adaptiven Immunsystems bei Wirbeltieren, ist seit langem als die einzige Quelle von αβT Zellen berücksichtigt. Dennoch beginnt Thymusinvolution im Leben, die zu einer drastisch reduzierten Leistung von naiven αβT Zellen in die Peripherie zu früh. Dennoch können sogar Hundertjährigen Immunität gegen neu erworbenen Erreger aufzubauen. Jüngste Untersuchungen legen nahe extrathymic αβT Zellentwicklung, aber unser Verständnis der Signalwege, die für Thymus-Funktionsverlust kompensieren kann immer noch rudimentär. γδ T-Zellen sind angeboren Lymphozyten, die den Haupt T-Zell-Untergruppe in den Geweben dar. Wir haben vor kurzem eine bisher unbeachtet herausragende Funktion zu einem γδ T-Zell-Untergruppe zugeschrieben durch die zeigen, dass die knappe Einheit ^von CD4 + Vδ1 ⁺ γδ T-Zellen können in αβT Zellen in entzündlichen Erkrankungen transdifferen. Hier haben wir provide das Protokoll für die Isolierung dieser Progenitorzellen aus dem peripheren Blut und die anschließende Kultivierung. Vδ1 Zellen positiv von PBMCs von gesunden menschlichen Spendern unter Verwendung von magnetischen Kügelchen angereichert, gefolgt von einem zweiten Schritt, bei dem man gezielt die knappen Fraktion von CD4 ⁺ Zellen mit einem weiteren magnetischen Markierungstechnik. Die Magnetkraft der zweiten Kennzeichnung der als einer der ersten magnetischen Etiketten überschreitet, und ermöglicht die effiziente, quantitative und spezifische positive Isolation der Population von Interesse so. Danach führen die Technik und die Kulturbedingungen für die Klonierung und effizient Expansion der Zellen und zur Identifizierung der erzeugten Klone mittels FACS-Analyse erforderlich. Somit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Reinigung, die Kultur und ex vivo Expansion von CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ T-Zellen. Dieses Wissen ist Voraussetzung für Studien, die zu dieser αβT Zell progenitor`s Biologie beziehen, und für diejenigen, die ide Zielntify die molekularen Auslöser, die in ihrer Transdifferenzierung beteiligt sind.

Einleitung

Bei Wirbeltieren spielt adaptiven Immunität, die in der zellulären und humoralen Immunität Teil strukturiert ist, eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern. Die Erkennung von einer Vielzahl von Antigenen durch hyperpolymorphic T- und B-Zell-Rezeptoren (TCR / BCR), der in Bezug auf T-Zellen wird angenommen, dass vor allem im Thymus ¹ produziert werden, vermittelt. Daran, hämatopoetische Stammzellen (HSC), aus dem Knochenmark, Samen der Thymus und Differenzierung entlang gut definierte Stadien schließlich, die zu allen T-Zell-Linien. Thymus Impfen Vorläuferzellen sind CD4 ^- und CD8 ^{- und damit} stellen die unreifen, doppelt negative (DN) Thymozyten Fraktion. Thymus-abgeleiteten Signale dann zu induzieren ihre Abstammung Engagement und die Differenzierung entweder in αβ bzw. γδ T-Zellen. Die Expression von funktionell neu arrangierte TCR-γ und δ TCR-Kettengene in DN2 / 3 Thymozyten zu δTCR Komplexe, die Zellproliferation eine Fahrt ggr;d Förderung der Differenzierung in γ & dgr; T-Zellen ^2,3. Im Gegensatz dazu ist die Umlagerung einer funktionellen TCR-β-Kette, die mit preTα koppeln kann, um eine preTCR pT aufzubauen, induziert die transkriptionalen Silencing des TCR-γ-Kette in DN3 Thymozyten und deren Übergang in CD4 ⁺ CD8 ⁺ doppelt positiven Thymozyten ⁴ . In diesem Stadium Rekombination des TCR-α-Kette auftritt, das Löschen der TCR-δ-Locus, die im TCR-α-Locus eingebettet, wodurch eine Aufhebung der Produktions γδTCR in diesen Zellen unwiderruflich ^5-9. Umgeordnet αβTCRs werden anschließend auf ihre Fähigkeit zur Selbst MHC schwach binden (positive Selektion), die einen bestimmten Schwellenwert nicht übersteigen darf, um Autoimmunerkrankungen (negative Selektion) vermeiden ausgewählt. Entsprechend ihren Möglichkeiten zu binden MHC-Klasse I oder II, entwickeln die ausgewählten αβT Zellen in Einzel positive ^CD4 + oder ^CD8 + T-Zellen, die Ausfahrt der Thymus als naive T-Zellen.

, Rückbildung des Thymus beginnt jedoch schon früh im Leben, die zu exponentiell verringert Leistung von naiven T-Zellen, die fast erloschene Postadoleszenz ¹⁰ ist. Dennoch bleibt die Größe der T-Zell-Pools während des gesamten Lebens, die nur teilweise durch post-Thymus homöostatische Proliferation von T-Zellen und der Proliferation der langlebig immunologischen Gedächtnisses ¹¹ erklärt werden kann, konstant. Folglich muss extrathymic T-Zell-Entwicklung auftritt. Die neuere Forschung hat erhebliche Anziehungskraft, die αβT Vorläuferzellen, die bei extrathymic-sites-verursachte Funktions αβ T-Zellen ^12-17 gekennzeichnet gewonnen. Dennoch ist detailliertes Wissen über extrathymic αβT Vorläuferzellen, die aus einem Thymus-unabhängige differenzieren sich in αβT Zellen als fragmentarisch wie der Hintergrund, dass wir auf dem Weg, den sie so zu nehmen.

Vor kurzem haben wir das kleine T-Zellen-Einheit der Vδ1 ⁺ identifiziert ^CD4 + Zellen γδT als extrathymic αβT Zell prognitor ^18, die, wenn sie aus dem peripheren Blut von gesunden menschlichen Spendern isoliert in einem milden entzündlichen Umgebung in αβT Zellen transdifferen. Interessanter und entgegen der homöostatischen Proliferation von post-Thymus-T-Zellen, Transdifferenzierung Vδ1 CD4 ⁺ Zellen generiert neue T-Zell-Rezeptoren, wodurch die Erweiterung des Repertoires Diversität, so dass potentiell neuer Antigene erkannt werden, und kann den Schutz des Wirtes gegen neu erworbenen Erregern. Dies trägt zur Plastizität von T-Zellen und fügt eine bisher unbeachtet neuen Weg für extrathymic T-Zell-Entwicklung.

Die quantitative Isolierung von lymphatischer Quellen, die Erzeugung von Einzelzellklonen und deren effiziente Expansion sind wesentlich für das Ziel, jene Marker und Moleküle, die diese auslösen αβT Zell precursor`s extrathymic Entwicklung zu identifizieren.

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Protokoll

Ethik Statement: Alle Verfahren wurden nach der Deklaration von Helsinki durchgeführt und wurden von der Klinischen Ethikkommission der Universität Tübingen genehmigt (Projekte 38 / 2009B02 und 470 / 2013B02).

1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)

1. Nehmen Sie 50-100 ml von einem gesunden Freiwilligen über Venenpunktion unter Verwendung einer 50 ml Spritze mit 1.000 IE Heparinsulfat und verdünnt das Blut 1: 2 mit PBS (pH = 7,2).
2. Sorgfältig Schicht 35 ml Blut: PBS-Lösung auf 15 ml Bluttrennlösung wie Biocoll (d = 1,077 g / ml) in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren für 15 min bei 800 × g bei RT.
   HINWEIS: Brems dürfen nicht verwendet werden.
3. Sammeln der Zellen des lymphatischen Schicht mit einer Pipette und die Zellen werden zweimal in mindestens 50 ml PBS (Zentrifuge für 12 min; bei 400 xg). Entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation mit einer Pipette.
4. Lyse verbleibenden Erythrozyten durch die Aussetzung und Incubtriebs lymphozytären Fraktion mit 1-5 ml eines hypotonischen Pufferlösung für 2-4 min.
   Hinweis: Dauer der Exposition und Volumen Lysepuffer hängen vom verwendeten Lysepuffer und auf die Menge der roten Blutzellen in der Lymphozytenfraktion gelassen.
5. Verdünnen der Zellen mit PBS (1,10) und zentrifugiert bei 250 g für 12 min und anschließend wieder zu suspendieren und wasche das Zellpellet einmal in 10 ml PBS bei 300 g für 12 min.
6. Resuspendieren der Lymphozyten in PBS und zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer mit Trypanblau-Lösung.
   HINWEIS: In der Regel werden> 1 x ¹⁰ 8 Lymphozyten von 100 ml erhalten frisch gezapftes peripheren Blut.

2. Isolierung von T-Zellen Vδ1

1. Take <1 x 10 ⁶ isolierten Lymphozyten für zunächst FACS Bestimmung der Frequenz Vδ1 CD4-T-Zellen.
   HINWEIS: Populationsgröße dieser T-Zell-Unternehmen kann stark zwischen den Individuen und nach ihrem Immunstatus abweichen. TypicVerbündeter, etwa 1% der T-Zellen sind Vδ1 ⁺ und etwa 1-5% der Vδ1 ⁺ Zellen sind CD4 ^+.
   1. Verdünnen der Zellen mit 1 ml FACS-Puffer, der PBS, enthaltend 2% FCS und 5 mM EDTA besteht. Zentrifuge bei 660 xg für 2 Minuten und Dekantieren des Überstandes. Das Rücklaufvolumen von etwa 100 ul FACS-Puffer ausreichend ist für die anschließende Färbung. Vortexen und Inkubation der Zellen mit 5 & mgr; Fc-Blocking-Reagenz für 5 min bei RT für erhöhte Spezifität des FACS-Färbung.
   2. Hinzufügen menschliche monoklonale Antikörper direkt an die Zellen, ohne den Fc-Blocking-Reagenz. Stellen Sie sicher, um die Zellen mit Antikörpern gegen Vδ1 (1:50), CD 3 (1:50), CD4 (1: 200) zu färben, CD8 (1: 200) und TCRαβ (01.25). Bereiten Sie die Isotyp-Kontrolle mit den entsprechenden Immunglobulin-Isotypen. Inkubieren Zellen mit Antikörpern für 20 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln.
   3. Waschen Sie die Zellen in 1 ml FACS-Puffer (Zentrifuge für 2 Minuten; bei 660 xg), dekantiert die supernatant und FACS Akquisition gehen in der verbleibenden Puffervolumen.
2. Pelletisieren der Zellen durch Zentrifugation für 12 min (die nicht in der FACS-Analyse verwendet werden); bei 300 g; 8 ° C. Entfernen Sie den Überstand und Zell pelletin 60 & mgr; l MACS-Puffer pro 1 x ¹⁰ 7 Zellen. In 20 & mgr; Fc-Blocking-Reagenz pro 1 x ¹⁰ 7 Zellen und Inkubation für 5 min bei 4 ° C.
3. Zugabe von 10 & mgr; l FITC-konjugierten anti-human Vδ1 Antikörper pro 1 x ¹⁰ 7 Zellen direkt in die Zellen. Inkubation für 12 min bei 4 ° C im Dunkeln.
4. Die Zellen werden mit 14 ml MACS-Puffer (Zentrifuge für 12 min; bei 300 g; 8 ° C). Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der Zellen in 80 & mgr; l MACS-Puffer pro 1x10 ⁷ Zellen.
5. Nehmen 1-2 x ¹⁰ 5 Zellen und verdünnte sie in 100 & mgr; l FACS-Puffer für die Überprüfung der Markierung durch FACS-Analyse. Keine weiteren Zusätze sind für diesen Schritt benötigt wird. Stellen Sie sicher, dass es eine ausreiziente Differenz in der Helligkeit für Vδ1 ^- und Vδ1 ⁺ Zellen. Ist dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie die Schritte 2.3) und 2.4).
6. In 20 ul Anti-FITC-Mikrokügelchen pro 1 x ¹⁰ 7 Zellen zu den übrigen Zellen, gut mischen und inkubieren für 15 Minuten im Dunkeln bei 4 ° C. Danach die Zellen werden unter Verwendung von mindestens 10 ml MACS Puffer (Zentrifuge für 12 min, bei 300 g; 8 ° C).
7. Während der Zentrifugation äquilibrieren die in einem Magneten mit 500 & mgr; l MACS-Puffer platziert vorgekühltem Magnetspalte.
8. Resuspendieren der Zellen in 500 & mgr; l MACS-Puffer (für die Zellzahlen höher als 1 x ¹⁰ 8, Scale-up dieses Volumen entsprechend), und die Zellen anzuwenden vorsichtig auf die Säule. Sammeln Sie die Durchfluss mit dem Vδ1 ^- Zellen.
9. Dreimal Waschen der Säule mit 500 ul MACS-Puffer zu sammeln und das Durchfluss erneut in derselben Röhre. Beachten Sie, dass der Vorratsbehälter leer ist, bevor Puffer auf die Säule sein.
10. Entfernen Sie die Spalte aus der Magnetvorrichtung und legen Sie sie in einen 15 ml konischen Röhrchen. Spülen schnell die Säule mit 1 ml MACS-Puffer durch festes Drücken des Kolbens in der Spalte. Eluat in einem Rohr.
    HINWEIS: Um eine Reinheit von> 98% zu erhalten, ist es üblicherweise notwendig, wiederholen Sie die Schritte 2,7-2,9) mit einem zweiten Spalte.
11. Überprüfen Sie die Reinheit der Zellen mittels FACS-Analyse ¹⁸ mit dem gleichen Antikörper-Panel wie zuvor (siehe 2.1.2) und zählen Sie die Zellen.

3. Isolierung Vδ1CD4 ^{+ T-Zellen}

1. Resuspendieren 25 ul CD4-Perlen mit einem Vortex für> 30 Sek. Waschen der Kügelchen (die minimale Menge, wie vom Hersteller dargestellt) in 1 ml MACS-Puffer in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß, indem das Röhrchen in einem Magnet für 1 min. Überstand verwerfen vorsichtig mit einer kleinen Pipette (200 ul) und Resuspendieren der Beads in dem ursprünglichen Volumen der MACS-Puffer.
2. Pelletieren Vδ1 ⁺ Zellen (Zentrifuge für 12 min; bei 300 g) und saugen Sie den Überstand und resuspendieren alle Vδ1 ⁺ Zellen in 500 & mgr; l MACS-Puffer und fügen Sie sie in das Rohr, das die Perlen. Kräftig mischen und Inkubation für 20 min bei 4 ° C unter konstantem Neigungs (beispielsweise in einem Drehgelenk).
3. Das Röhrchen, das die Zellen in einem Magnet für 2 min. Stellen Sie sicher, dass es keine Reste im Deckel.
   HINWEIS: Die CD4 ^{+ -Zellen} werden die magnetischen Perlen gebunden sind und heften sich an die Seite des Rohrs gegenüber dem Magneten.
4. Den Deckel vorsichtig öffnen, während der Schlauch in der Magneteinrichtung und sammeln Sie den Überstand, der die CD4 enthält ^{- +} Vδ1 Zellen unter Verwendung eines kleinen Pipetten. Platzieren CD4 ^- Vδ1 ⁺ Zellen in ein separates Röhrchen und setzen dieses Rohr in den Magneten wieder möglicherweise vermeiden verbleibenden CD4-Zellen oder Kügelchen, aus der Population.
   1. Waschen Sie die CD4 ^- Zellen in 5 ml MACS-Puffer (Zentrifuge für 12 min; bei 300 g) and resuspendieren sie in einer Konzentration von 1 x ¹⁰ 5 Zellen pro 100 & mgr; l Medium. CD4 ^- Zellen können leicht unter den unten (4.2) gegebenen Bedingungen kultiviert werden.
5. Das Röhrchen mit den ^CD4-Zell Ziele außerhalb des magnetischen Feldes, resuspendieren Zellen in 500 & mgr; l MACS-Puffer und setzen Sie diese wieder in die Magnetvorrichtung. Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,5 zweimal, um eine höhere Reinheit zu erhalten. Überstand entfernen durch Pipettieren
6. Resuspendieren der ^CD4 + -Zellen in 100 ul Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin) und füge 10 ul einer Wulst Ablöselösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 45 min mit konstanter Kippen (beispielsweise in einem Drehgelenk).
7. Platzieren der Zellen in einem Magnet für 1 min. Sorgfältig sammeln Überstand, der Wulst freie Vδ1 ^{+ CD4 +} Zellen unter Verwendung einer kleinen Pipette.
8. Außerhalb des Magneten, resuspendieren die Perlen mit 100 ul Kulturmedium, und wiederholen Siedie Schritte 3.6 und 3.7 zweimal höhere Zellzahlen von CD4 ⁺ Zellen zu erhalten.
9. Pelletieren Sie die Zellen (bei 300 g zentrifugiert, für 12 min) und den Überstand verwerfen vollständig durch Pipettieren. Die Zellen in frischen, vorgewärmten Medien und zählen. Prüfung der Reinheit der Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ Zellen durch FACS-Analyse in den Schritten 2.1.1-2.1.3 dargestellt.

4. Single-Zell-Klonen durch limitierte Verdünnung

1. Isolieren peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus einem allogenen Spender, wie in 1,1-1,6 dargestellt.
2. Bestrahlen 2,5 x 10 ⁷ allogenen PBMCs mit 80 Gy in 25 ml Kulturmedium mit γ-Strahlung.
3. Hinzufügen IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) und PHA (2 ug / ml) zu den bestrahlten Feeder-Zellen und verteilen sie in 96-Well U-förmigen Platten, 5 x 10 ⁴ feeder Zellen in 50 ul pro Vertiefung.
4. Verdünnt den Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ Zellen zu einer Konzentration von 0,3 Zellen pro 50 ul. Pipette 50 ul der Zelllösung zu jeder Vertiefung beherbergen die bestrahlten Zellen und Cytokinen.
   Hinweis: So werden die Cytokine bis zu einer Endkonzentration von 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 und 1 ug / ml PHA verdünnt. Die 96-Well-Platten in einem Inkubator bei 37 ° C, _5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre.
   1. Wahlweise kultivieren bleibt als Massenkultur unter den gleichen Kulturbedingungen wie die Klone gereinigt Vδ1 ^{+ CD4} + -Zellen.
5. Liefern die Zellen alle 3-4 Tage mit Zytokinen und frische Medien. Hierzu Austausch Hälfte des Mediums in den Vertiefungen mit 50 & mgr; l frisches Medium durch Pipettieren. In 2-fache Konzentration der Zytokine auf jede Ergänzung. In 5x10 ⁴ bestrahlten Feeder-Zellen pro Vertiefung jeder anderen Runde der Fütterung.
6. Mit einem Mikroskop beobachten ersten Klone sichtbar nach 3-4 Wochen zu werden, wie sie verstoffwechseln und so ändern die Farbe des Kulturmediums und Kolonien bilden.
   HINWEIS: Pelzther Anbau, resuspendieren Klone gut und sie auf 96-Well-Platten zu trennen. Analysieren Sie die Zellen über FACS wie in 2.1.1-2.1.3 angezeigt. Klone unter diesen Bedingungen gehalten, kann schließlich ihren TCR von Vδ1 verändern αβTCR. Der Zeitpunkt für diese Transdifferenzierung ist von Klon zu Klon.

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Ergebnisse

Figur 1 zeigt die verschiedenen Schritte und das Ergebnis der Trennung der Vδ1 T-Zellen aus dem peripheren Blut. 1A zeigt eine typische Verteilung der Vδ1 ⁺ Zellen CD3 ⁺ Lymphozyten, sowie die Co-Rezeptor die Expression des Vδ1 ^{+ -Population.} In diesem Spender, ist die Frequenz der Vδ1 ⁺ Zellen (rot) 2,3% des Gesamtlymphozytenzahl und der CD4-Expression (grün) der Vδ1 ⁺ Lymphozyten beträgt 2,6%. Insgesamt ist die Zielgruppe f...

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Diskussion

Um den Phänotyp, der Biologie und Funktion einer knappen (T-) Zell Einheit zu studieren, nämlich Vδ1 ^{+ CD4} + T-Zellen, verwendeten wir zwei Marker: Vδ1 und CD4 für seine positive magnetische Zellisolierung. Vδ1 ist ein Orphan-Rezeptor, während CD4 auf T-Helfer-Zellen exprimiert wird, auf einem niedrigeren Niveau auf Monozyten und dendritischen Zellen, und auf einem sehr niedrigen Niveau von hämatopoetischen Vorläuferzellen.

Techniken zur Anreicherung und Selektion von Zel...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D