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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Ermittlung der direkten Ziele der Genom-Targeting-Moleküle vor eine große Herausforderung. Zu verstehen, wie DNA-bindende Moleküle greifen das Erbgut, eine Methode, die auf die Vernetzung von kleinen Molekülen beruht, um Chromatin zu isolieren (COSMIC) entwickelten wir.

Zusammenfassung

Das Genom ist das Ziel von einigen der wirksamsten Chemotherapeutika, aber die meisten dieser Medikamente fehlt DNA-Sequenzspezifität, die dosislimitierende Toxizität und viele unerwünschte Nebenwirkungen führt. Targeting des Genoms mit sequenzspezifischen kleine Moleküle können Moleküle mit einem erhöhten therapeutischen Index und weniger Nebeneffekte zu ermöglichen. N -methylpyrrole / N-Methylimidazol Polyamide sind Moleküle, die rational gestaltet werden kann, um spezifische DNA-Sequenzen mit vorzüglicher Präzision abzuzielen. Und im Gegensatz zu den meisten natürlichen Transkriptionsfaktoren, Polyamide können methylierte und chromatinized DNA ohne einen Verlust der Affinität binden. Die Sequenzspezifität der Polyamide wurde ausgiebig in vitro mit zugehörigen Standort-Identifizierung (CSI), die mit traditionellem biochemische und biophysikalische Methoden untersucht, aber die Untersuchung der Bindung an Polyamid genomische Ziele in Zellen weiter Ferne. Eine Methode Wir berichten hier, um die Vernetzung von kleinen Molekülen isolate Chromatin (COSMIC), dass identifiziert Polyamid-Bindungsstellen in das Genom. KOSMISCHER ähnelt Chromatinimmunpräzipitation (Chip), unterscheidet sich jedoch in zwei wichtigen Punkten: (1) ein Photovernetzungsmittel verwendet wird, um selektiv, zeitlich gesteuerte Abscheidung von Polyamid Bindungsereignisse, und (2) das Biotin-Affinität Griff verwendet wird, um Polyamid reinigen Freigabe -DNA-Konjugate unter semi-denaturierenden Bedingungen an DNA, die nicht-kovalent gebunden ist verringern. COSMIC ist eine allgemeine Strategie, die verwendet werden können, um die genomweite Bindungsereignisse von Polyamiden und anderen Genom-Targeting-Chemotherapeutika zu offenbaren.

Einleitung

Die Informationen, um jede Zelle im menschlichen Körper in DNA kodiert. Die selektive Verwendung dieser Informationen regelt das Schicksal einer Zelle. Transkriptionsfaktoren (TF) sind Proteine, die an spezifische DNA-Sequenzen binden, um eine bestimmte Untergruppe der Gene im Genom zu exprimieren, und die Fehlfunktion des TFs ist mit dem Auftreten von einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, einschließlich Entwicklungsdefekten, Krebs und Diabetes . 1,2 Wir sind daran interessiert, Moleküle, die wahlweise mit dem Genom binden und modulieren Genregulationsnetzwerken können.

Polyamide N -methylpyrrole komponiert und N-Methylimidazol rational entworfene Moleküle, die DNA mit Spezifitäten und Affinitäten, die rivalisierenden natürlichen Transkriptionsfaktoren. 3-6 Diese Moleküle auf bestimmte Sequenzen in der kleinen Furche der DNA binden zielen können. 4,5,7 -11 Polyamide haben sowohl repress beschäftigt und die Expression spezifischer g aktivierenenen. 4,12-19 Sie haben auch interessante antivirale 20-24 und Anti-Krebs-12,13,25-30 Eigenschaften. Ein attraktives Merkmal der Polyamide ist ihre Fähigkeit, DNA-Sequenzen, die methyliert 31,32 sind und um Histon-Proteine ​​gewickelt 9,10,33 zuzugreifen.

Um die umfassende Bindungsspezifitäten von DNA-bindenden Moleküle zu messen, erstellt unser Labor die verwandten Standortkennung (CSI) Methode. 34-39 Die vorhergesagte Auftreten von Bindungsstellen auf Basis von in-vitro-Spezifitäten (genomescapes) können auf dem Genom angezeigt werden, weil der In-vitro-Bindungsintensität direkt proportional zur Assoziationskonstanten sind (K a). 34,35,37 Diese genomescapes Einblick in Polyamid Belegung über das Genom aber Messpolyamidbindung in lebenden Zellen eine Herausforderung gewesen. DNA wird fest in den Zellkern, die die Zugänglichkeit der Bindungsstellen beeinflussen könnten verpackt. Das accessibility dieser chromatinized DNA-Sequenzen zu Polyamiden, bleibt ein Rätsel.

In jüngster Zeit viele Methoden, um Interaktionen zwischen kleinen Molekülen und Nukleinsäuren entstanden studieren. 40-48 Die chemische Affinitätseinfangen massiv-parallelen DNA-Sequenzierung (Chem-seq) ist eine solche Technik. Chem-seq verwendet Formaldehyd, kleine Moleküle zu einer genomischen Ziel von Interesse und eines biotinylierten Derivats von einem kleinen Molekül von Interesse zu vernetzen, um den Liganden-Target-Wechselwirkung aufzunehmen. 48,49

Formaldehyd-Vernetzung führt zu einer indirekten Wechselwirkungen, Fehlalarme zu erzeugen können. 50 Wir entwickelten eine neue Methode, die Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin (COSMIC), 51 mit einem Photovernetzungsmittel zu isolieren, um diese so genannte "Phantom" Spitzen zu beseitigen. 50 zu beginnen, wir entworfen und synthetisiert trifunktionellen Derivate von Polyamiden. Diese Moleküle enthalten eine DNA-Bindungs ​​polyamide ein Photovernetzer (Psoralen) und eine Affinität Griff (Biotin, Abbildung 1). Mit trifunktionalen Polyamide, können wir kovalent erfassen Polyamid-DNA Wechselwirkungen mit 365 nm UV-Bestrahlung, einer Wellenlänge, die nicht DNA schädigt oder zu veranlassen nicht Psoralen-basierte Vernetzung. 51 Als nächstes wir Fragment des Genoms und zur Reinigung des aufgenommenen DNA unter stringenten, halb -denaturing Bedingungen an DNA, die nicht-kovalent gebunden ist verringern. So sehen wir COSMIC als Methode zur chem-seq verwandt, aber mit einer mehr direkte Auslesen der DNA-Targeting. Wichtig ist, dass die schwache (K a 10 3 bis 10 4 M -1) Affinität von Psoralen für die DNA nicht nachweisbar Auswirkungen Polyamid-Spezifität. 51,52 Die angereicherten DNA-Fragmente kann entweder quantitative Polymerase-Kettenreaktion 51 analysiert werden (COSMIC-qPCR) oder mit der nächsten Generation Sequenzierung 53 (COSMIC-seq). Diese Daten ermöglichen eine unvoreingenommene, Genom-geführte Design von Liganden interwirken mit ihren gewünschten genomischen Loci und minimieren Nebeneffekte.

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Abbildung 1. Bioactive Polyamide und COSMIC Schema. (A) Hairpin Polyamiden 1-2 Target die DNA-Sequenz 5'-WACGTW-3 '. Linearen Polyamiden 3-4 Ziel 5'-AAGAAGAAG-3 '. Ringe der N-Methylimidazol zur Klarheit fett. Offene und gefüllte Kreise stellen N -methylpyrrole und N-Methylimidazol auf. Platz für 3-Chlorthiophen und Rauten stellen β-Alanin. Psoralen und Biotin sind von P und B bezeichnet sind. (B) COSMIC Schema. Zellen mit trifunktionellen Derivate von Polyamiden behandelt. Nach der Vernetzung mit einer 365 nm UV-Bestrahlung, Zellen lysed und genomische DNA geschert. Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen zugegeben werden, um Polyamid-DNA-Addukte zu erfassen. Die DNA wird freigesetzt und kann durch quantitative PCR (qPCR) oder mit der nächsten Generation Sequencing (NGS) analysiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protokoll

1. Die Vernetzung in lebenden Zellen

  1. Beginnen Sie mit ~ 2,5x10 7 H1 Zellen oder anderen kultivierten Zellen.
    HINWEIS: Diese Anzahl von H1-Zellen entspricht fünf 10-cm-Schalen (ca. 40% Konfluenz).
  2. Wachsen Zellen in E8 Medien auf einer Fläche, die pluripotenten Stammzellen unterstützt beschichteten Schalen (siehe Materialliste) und inkubieren sie bei 37 ° C in der feuchten Atmosphäre von 5% CO 2. Ernten Sie die Zellen enzymatisch (siehe Materialliste). Hinweis: Nicht in H1-Zellen zu 90% Konfluenz überschreiten; Konfluenz induziert die spontane Differenzierung der H1-Zellen. Um Zellen zu zählen, wachsen eine zusätzliche 10-cm-Schale von Zellen, heben Sie die Zellen enzymatisch wie in den Abschnitten 1,8 bis 1,10 beschrieben, und zählen sie mit einer Zählkammer.
    1. Vorbereitung E8 Kulturmedien, wie in Chen et al. 54
  3. Vor der Zugabe von Polyamid, Entfernen des verbrauchten Kulturmedien mit einer Pasteur-Pipette in ein Vakuumfalle befestigt sind. In frischem Medium mit soerological Pipette und Pipettenspender (8 ml pro 10-cm-Schale).
    Hinweis: Fügen Sie die Medien auf die Seite der Schale, um zu vermeiden Aufbrechen der Zellen. Ab diesem Zeitpunkt schützen die Zellen vor Licht zu vorzeitigem Photovernetzung zu vermeiden.
  4. Hinzufügen Polyamid mit einer Pipette (8 ul 400 uM Polyamid in DMSO, 400 nM Endkonzentration), die direkt zu den Kulturmedien jeder Schale. Schwenken Sie die Schüssel, um das Polyamid gleichmäßig in den Medien zu dispergieren.
    HINWEIS: Konzentration kann variiert werden, aber sicherzustellen, daß keine zelluläre Toxizität für die ausgewählte Behandlung beobachtet.
  5. Inkubieren Sie die Zellen 24 h 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2, und sicherzustellen, dass sie vor Licht geschützt.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit kann Polyamid zu messen, die Bindung über die Zeit variiert werden.
  6. Waschen Sie jede 10-cm-Schale mit 4 ml PBS (1,05 mM monobasisches Kaliumphosphat, 155,17 mM Natriumchlorid, 2,97 mM dibasisches Natriumphosphat) unter Verwendung einer serologischen Pipette und Pipetten dispenser. Absaugen PBS und 3 ml E8 Kulturmedien.
  7. Mit dimmen die Lichter, entfernen Sie den Deckel von 5 Kulturschalen und legen Sie die Zellen auf einer ebenen Fläche außerhalb der Haube. Legen Sie ein Glasfilter über die 5-Kulturschalen mit λ <300 nm ausfiltern Licht. Legen Sie die UV-Quelle auf der Oberseite des Filters. Vernetzungs Proben 30 min lang mit 365 nm UV-Bestrahlung (2,4 mW / cm 2).
    HINWEIS: Vernetzungszeit sollte empirisch bestimmt werden.
  8. Bringen Kulturschalen wieder auf der Motorhaube. Saugen Sie das Medium mit einer Pasteurpipette auf eine Vakuumfalle angebracht. Jedes 10-cm-Schale mit 4 ml PBS waschen. Saugen Sie das PBS. In 3 ml Enzym für Zelldissoziation (siehe Materialliste) pro 10-cm-Schale, um die Zellen zu trennen. Inkubiere 5 min bei 37 ° C.
    HINWEIS: Nicht Vorwärmung des Enzyms.
  9. Stillen Sie das Enzym mit 3 ml E8 Medien pro Schale. Transfer dissoziierten Zellen in eine 15-ml konischen Röhrchen.
    HINWEIS: Legen Sie Zellen auf Eis ab diesem Zeitpunkt.
  10. Centrifuge dissoziierten Zellen 5 min, 500 × g bei 4 ° C. Überstand wird abgesaugt, um Enzym und Medien zu entfernen.
    ANMERKUNG: Pause Punkt. Zellen können schockgefroren in flüssigem Stickstoff, bei -80 ° C für die nachfolgende Verarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt gespeichert.

2. Isolierung von Chromatin

  1. Wird mit 1,2 ml KOSMISCHER Puffer (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) und Pipette nach oben und unten mehrere Male, um das Zellpellet für jede Probe in resuspendieren 1,2 ml COSMIC Puffer.
    1. Add 133 ul von jeweils 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 100 mM Benzamidin und 150 & mgr; M Pepstatin Proteaseinhibitoren frisch zu einer Endkonzentration von 1 mM für PMSF und Benzamidin und 1,5 uM für Pepstatin. Split Lösung von Zelllysat in zwei bernsteinfarbenen 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Ultraschallbehandlung mit Ultraschallgerät 35 min (10 s auf 10 s ab, die 60% Energie), das Genom, um zwischen 100 ein Fragmentnd 500 bp.
    1. Halten des Pegels des Chromatins Lösung im Reaktionsgefäß parallel zu der Wasserpegel in dem Reservoir. Bestätigen Sie diese Ebene durch eine Sichtprüfung.
      . HINWEIS: Bestätigen, dass die DNA wurde mit einem 1,5% Agarosegel geschert 55
    2. Optimieren Sie die Beschallungszeit empirisch. Verwenden einer minimalen Menge an Eis in den Behälter, um die Proben zu kühlen und sicherzustellen, dass das Eis nicht zwischen den Proben und dem Becher Horn stören.
  3. Zentrifugieren Sie die Probe 12.000 xg 10 min. Speichern Sie die wässrige Lösung, die lösliche Chromatin durch die Übertragung an eine neue Bernstein-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipette enthält. Entsorgen Sie das Pellet.
  4. Übertragen Sie 110 ul (10%) der Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und beschriften Sie sie Eingang DNA. Bei -80 ° C. Speichern Sie den Rest der Chromatin-Probe auf Eis für den Einsatz in Schritt 3.3.

3. Erfassung von Ligand-DNA-Crosslinks

  1. Mit einer Pipette 60 ul streptavi verzichtendin-beschichteten magnetischen Kügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml COSMIC Puffer und mischen auf einem Kolbenpendel 5 min bei RT. Zeigen magnetischen Kügelchen auf magnetische Trennung Rack 2 min, um Perlen zu erfassen. Entfernen COSMIC-Puffer mit einer Pipette.
    Hinweis: Schließen Sie nicht zulassen, dass die Perlen austrocknen. Gehen sofort zum nächsten Schritt.
  2. In Chromatin Probe (~ 1 ml), um Perlen (60 & mgr; l) und Resuspendieren der Kügelchen. Inkubieren Chromatin mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen mindestens 4 h auf einer rotierenden Drehschüttler bei 4 ° C. Falls gewünscht, die Proben unter O / N.

4. Isolierung affinitätsgereinigtem DNA

  1. Waschen Sie Perlen mit 7 min Intervall bei RT mit folgenden Waschpuffer, um unspezifische Wechselwirkungen zu entfernen. Verwenden Sie eine magnetische Trennung Rack, um Perlen nach jedem Waschen zu erfassen. Resuspendieren der Kügelchen nach jeder Änderung in Waschpuffer.
  2. Bereiten Sie den Waschpuffer in destilliertem entionisiertem Wasser und Filter (0,2 um) vor dem Gebrauch. Speicher Waschpuffer 1 und 2 bei 4 ° C für sehrere Monate. Bereiten Sie jeden Tag Waschpuffer 3 frisch. Hinzufügen und Entfernen von Waschpuffer aus der Probe mit einer Pipette. Für 2 bis 4, aus 1 und 3 (5 mM), jeweils in den Wäschen. Die Proben können zusätzlich zweimal mit COSMIC Puffer (einmal 12 Stunden, einmal 4 Stunden) vor der unten aufgeführten Wäschen gewaschen werden.
    1. Einmal mit Waschpuffer 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 3% SDS) zu waschen. Einmal mit Waschpuffer 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% Natriumdesoxycholat) waschen. Zweimaliges Waschen mit Waschpuffer 3 (4 M Harnstoff, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Zweimaliges Waschen mit Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA).
  3. Resuspendieren der Kügelchen in 200 ul TE-Puffer mit einer Pipette. Diese Probe von aufgenommenen DNA wird als affinitätsgereinigtem (AP) DNA bezeichnet.
  4. Ergänzen Sie die Eingabe und AP-DNA mit 10x Cross Reversal-Puffer (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mMEDTA) bis zu einer Endkonzentration von 90 ° C 1x. 56,57 Inkubieren 30 min.
    HINWEIS: 254 nm UV-Strahlung kann auch verwendet werden, um die Vernetzungs Psoralen, 58 aber Cyclobutyl Pyrimidindimeren aus Bestrahlung bei dieser Wellenlänge gebildet werden umkehren und stören Aufarbeitung von DNA werden.
  5. Für AP DNA, legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen die Probe auf magnetische Trennung enthält, Rack 2 min bei RT und Mittlerflüssigkeit (DNA) mit einer Pipette. Übertragung der DNA-AP (die von den Kügelchen freigesetzt wurde) zu einem neuen amber Reaktionsgefäß.
    HINWEIS: Die gewünschte AP-DNA wird in der Flüssigkeit, nicht mehr an die Perlen gebunden.
  6. Neutralisieren Eingangs- und AP DNA mit konzentrierter HCl auf pH 7 durch Zugabe von ungefähr 1 & mgr; l 6 N HCl pro 100 & mgr; l Probe mit einer Pipette. Bestätigen Sie die Proben durch Zugabe von ~ 0,5 ul auf pH-Papier mit einer Pipette WARNUNG neutralisiert. Konzentrierte HCl ist eine starke ätzende Säure. Griff nach Ihrer Institution217; s Richtlinien für die geeignete persönliche Schutzausrüstung.
  7. Hinzufügen RNase A (100 mg / ml) auf 0,2 ug / ul Endkonzentration an beide Eingangs und AP DNA. Inkubiere 1 h bei 37 ° C. Hinzufügen Proteinase K (20 mg / ml) auf 0,2 ug / ul Endkonzentration an beide Eingangs und AP DNA, hinzuzufügen. Inkubiere 1 h bei 55 ° C.
  8. Reinigen die DNA mit einem DNA-Säule Cleanup Kit (siehe Materialliste). 55 Elute DNA in 58 & mgr; l DNA-Grade-H 2 O Shop Ein- und AP-Proben bei -20 oder -80 ° C
  9. Analysieren AP DNA durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) mit Locus-spezifische Primer und / oder von der nächsten Generation Sequenzierung. Für qPCR Verwenden 2 ul AP DNA pro Locus mit den folgenden Parametern: 1 Zyklus 95 ° C 10 min und 40 Zyklen von 95 ° C 20 sec, 54 ° C oder 56 ° C 20 sec, 72 ° C 40 sec.
    HINWEIS: Die Glühtemperatur sollte entsprechend der Schmelztemperatur der verwendeten Primerpaare modifiziert werden. Wählen Sie ein Glühen temperature, dass minimiert die Quantifizierung Zyklus ohne unspezifische Amplifikation.
    HINWEIS: Für die Analyse von Next-Generation-Sequenzierung, Ziel für mindestens 10 Millionen abgebildet liest. Die Anzahl der abgebildeten liest, kann durch Erhöhung der Menge von AP-DNA und durch Kombination weniger Proben in einen Lauf zur Sequenzierung erhöht werden. Mehr liest Verbesserung der Empfindlichkeit. Standardpakete für ChIP-seq-Analyse (zB Homer, 59 MACS, 60 und SPP 61) arbeiten mit COSMIC-seq Daten. Wie bei anderen Methoden, die auf der nächsten Generation Sequenzierung beruhen, einschließlich der Genomsequenzierung und ChIP-seq, repetitive Regionen zu schaffen Unklarheiten in Ausrichtung und Montage und bleibt eine technische Herausforderung also.

Ergebnisse

Um ungleichmäßige Genom Fragmentierung und andere Variablen zu berücksichtigen, sollte die gereinigte DNA immer gegen eine Referenz von Eingang DNA normalisiert werden. Spezifisch für einen Locus von Interesse Primer können verwendet werden. Ist es hilfreich, auch analysieren, einen Ort, bei dem das Molekül nicht erwartet werden, zu binden, als eine negative Kontrolle. Wir sehen eine> 100-fache Steigerung der Polyamid-Belegung bei Bestrahlung mit 365-nm-Licht (Abbildung 2).

Diskussion

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

Offenlegungen

A.Z.A. is the sole proprietor of Vista Motif, LLC and WINStep Forward.

Danksagungen

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)any source
Benzamidineany source
Pepstatinany source
Proteinase Kany source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65001
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-023Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentLife TechnologiesA1110501
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep KitIlluminaIP-202-1012This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane MatrixBD Biosciences356231Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paperany source
amber microcentrifuge tubesany source
microcentrifuge tubesany source
pyrex filterany sourcePyrex baking dishes are suitable
qPCR master mixany source
RNaseany source
HCl (6 N)any source
10-cm tissue culture dishesany source
Serological pipettesany source
Pasteur pipettesany source
Pipette tipsany source
15-ml conical tubesany source
centrifugeany source
microcentrifugeany source
nutatorany source
Magnetic separation rackany source
UV sourceCalSunB001BH0A1AOther UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix SonicatorQsonicaS4000 with 431C1 cup hornOther sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubatorany source
Biological safety cabinet with vacuum outletany source

Referenzen

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