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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Zusammenfassung

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Einleitung

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy1. The majority of patients are diagnosed after the cancer has disseminated throughout the peritoneal cavity. Once the cancer has spread throughout the peritoneal cavity, cytoreductive surgery and chemotherapy are often not sufficient treatment to prevent cancer recurrence and chemoresistance, resulting in a less than 30% 5-year survival rate. Ovarian cancer metastasis is predominantly limited to the peritoneal cavity, and several other cancer types, including gastric, pancreatic, and colon cancers, metastasize to the same anatomic sites in the peritoneal cavity. In general, ovarian cancer cells detach from the in situ carcinoma in the fallopian tube or the primary ovarian tumor, travel in peritoneal fluid as single cells or spheroids, and attach to mesothelium-lined surfaces of the omentum, bowel, and abdominal wall2.

The tumor microenvironment plays an important role in disease progression and chemoresistance in many cancers3-6. The peritoneal cavity is a unique microenvironment, with a mesothelial cell monolayer covering the majority of surfaces (Figure 1A)7. The mesothelial lining acts as a barrier that creates a low-friction surface, which tends to be protective against cancer cell adhesion8. Immediately underneath this mesothelial-lined surface is a layer made predominantly of fibroblasts and extracellular matrix (ECM), which promote cancer cell adhesion and invasion8. Ovarian cancer cells secrete factors that induce changes in the mesothelial cell lining that enhance ovarian cancer cell adhesion, invasion, and metastasis9,10. Ovarian cancer cells adhere to the mesothelial surface via integrin and CD44-mediated mechanisms (Figure 1B)11-16.

Historically, several 3D models have been developed to investigate ovarian cancer interactions with the microenvironment. Some of the first models studied ovarian cancer-ECM interface17-21, ovarian cancer-mesothelial cell communication13,14,21-24, or both25 (reviewed by us 26). Niedbala et al. discovered that ovarian cancer cells display a quicker and firmer adhesion to ECM than to mesothelial cells or to plastic alone25. However, these models did not histologically resemble the peritoneal microenvironment. Therefore, we established a 3D organotypic model to more thoroughly replicate the ovarian cancer microenvironment. In order to better understand the role of the microenvironment and the interaction between cancer and peritoneal cells in the peritoneal dissemination of ovarian cancer, we have developed a 3D organotypic in vitro culture model of the peritoneal cavity lining (schematic in Figure 1C). The proposed model is composed of primary human fibroblasts and ECM, covered with a layer of primary human mesothelial cells-each cell type is isolated from human omentum. Histologically, this model resembles the normal peritoneal or omental lining, and provides a surface on which we can study the tumor microenvironment, the interaction between cancer cells and normal tissue, and the processes of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation8.

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Protokoll

Alle beschriebenen Forschungsprotokolle wurden von der University of Chicago Institutional Review Board (IRB) überprüft worden. Einverständniserklärung wurde von jedem Patienten vor der Operation erhalten, und die Studie wurde von der University of Chicago IRB zugelassen. Einem biologischen Sicherheitsschrank Typ 2 und Handschuhe sollten beim Umgang mit menschlichem Gewebe zum Schutz und zur Gefahr der Kontamination Zellen zu reduzieren.

1. Isolierung und Kultur der Primär Nicht transformierte Stromazellen

  1. Menschliches Gewebe Entnahme und Vorbereitung.
    1. Erhalten Proben menschlicher Omentum 2 cm 3, während einer Bauchoperation entfernt wird, und unmittelbar eint Gewebe in RT Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) (2A). Ein Stück Omentum 3 cm x 2 cm in der Regel ergibt 1 Million primären humanen Mesothelzellen (HPMC) und 200.000 primäre menschliche Fibroblasten oder normale omentalis Fibroblasten (NOF).
    2. Spin down die PBS wurde das Gewebe in 0,5 × g für 3 eingetauchtmin so bald wie möglich nach der Entnahme (<2 h in PBS) und übertragen das Gewebe frischen 20 ml PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen. Cut up Gewebe in 5 mm 3 Stück durch Zerkleinern mit Skalpellen in einem Durchmesser von 15 cm, sterile Kulturschale (2B).
  2. Primäre humane Mesothelzellen Zellisolierung 8
    1. Um HPMC zu isolieren, übertragen Sie die zerkleinerte Gewebe in 50 ml konische Röhrchen und warten Sie 1 min für die festen Stücke, an die Spitze (2C & D) zu schweben. HPMC und rote Blutzellen (RBC) in der Flüssigkeit auf dem Boden vorhanden sein. Verwenden einer Pipette, um die Flüssigkeit vom Boden des Rohres und in ein neues konisches Rohr zu entfernen. Drehen Sie die Flüssigkeit nach unten bei 0,5 × g für 3 min und saugen Sie den Überstand aus der HPMC / RBC-Pellet.
      1. Wiederholen Sie den Vorgang drei Mal: ​​20 ml PBS zu dem zerkleinerten Gewebes ermöglichen Gewebe zu steigen, zu entfernen Flüssigkeit vom Boden mit einer Pipette und in die HPMC / RBC Rohr, Spin-down, und entfernen Sie dieÜberstand. Nachdem alle Spins abgeschlossen und der Überstand wird abgesaugt, wird das Pellet HPMC und RBC enthalten.
    2. Platte alle Zellen aus dem Pellet in einen 75 cm 2 -Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum [FBS], 1% MEM-Vitamine [93 mg / L], 1% MEM nichtessentiellen Aminosäuren [81,4 mg / L], 1% Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin]).
    3. Führen Sie eine sekundäre PBS zu waschen, um zusätzliche HPMCs isolieren.
      1. Für die Sekundär PBS waschen, schütteln Sie die verbleibende feste Gewebe mit 200 Upm, 37 ° C für 10 min in 20 ml PBS, dann warten 1 min für das Gewebe, um nach oben zu schweben. Entfernen der Flüssigkeit aus dem Boden des Rohrs in ein neues Gefäß, Zentrifuge bei 0,5 × g für 3 min, und den Überstand aspirieren.
      2. Teller alle HPMC / RBC aus der Sekundär PBS waschen in einem separaten 75 cm 2-Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium.
    4. Um jede r isolierenemaining HPMC, Schütteln des zerkleinerten Gewebes mit 200 Upm, 37 ° C Grad für 10 min in 20 ml einer 1: 1 0,25% Trypsin 25 mM EDTA: PBS-Lösung, bezogen auf das Volumen. Lassen Sie das Gewebe zu erheben, sammeln die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens in eine neue 50-ml-Tube und Spin-down bei 0,5 gx 3 min.
      1. Saugen Sie den Überstand und die Platte alle HPMC / RBC in einem separaten 75 cm 2-Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium.
    5. Kultur die plattierten Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung. Vorschub plattierten Zellen durch Zugabe von 15 ml Vollwachstumsmedium an den Tagen 3 und 5 ohne Entfernen der verbrauchten Medien. HPMC kann für 5-7 Tage vor der Spaltung kultiviert werden.
      1. Verwenden Niedergang HPMC (bis Durchgang 2) bei allen Versuchen zur Entdifferenzierung und Änderung der ursprünglichen Phänotyp zu minimieren. Verwenden Sie ein Weitfeldmikroskop vorzugsweise mit einem 20x-Objektiv mit Kunststoff-Differential-Interferenz-Kontrast-Funktionen oder 4-20x Ziel mit Phasenkontrast capabilities (Phasenkontrastfilter auf Mikroskop) für die Aufnahme aller Bilder von Zellen und eine 10-fach Objektiv () in Hellfeld zu analysieren immunhistochemischen 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Färbung.
    6. Bestätigen, dass die HPMC sind quaderförmig und Express Cytokeratin 8 und Vimentin, indem Immunhistochemie 8 (3A, C, E).
  3. NOF Isolierung 8
    1. Bereiten Sie 10 ml des Vorrates des Collagenase Typ III-Lösung (10x) durch die Kombination einer 1: 1: 1-Mischung von 100x Pen-Strep: 1.500 Einheiten Aktivität / ml Collagenase Typ III: 714 Units Aktivität / ml Hyaluronidase in PBS.
    2. Schütteln des zerkleinerten Omentum Gewebe, nachdem HPMC Isolation bleibt bei 200 rpm, 37 ° C für 6 Stunden in 10 ml des 10x Collagenase Typ III-Lösung in einem serumfreien Medium verdünnt (DMEM mit 1% MEM-Vitamine [93 mg / L], 1% MEM nichtessentiellen Aminosäuren [81,4 mg / L], 1% Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin]). Verdauten Gewebe undurchsichtigen schauen und kann einige faserige Ablagerungen (2E) haben.
    3. Zentrifugieren Sie die Lösung, die NOF-Zellen in Suspension bei 0,5 × g für 3 min bei RT, saugen Sie den Überstand und die Platte des Pellets in einem 75 cm 2-Kolben in 13 ml Vollwachstumsmedium.
    4. Entfernen Sie alte Medien und ersetzen Sie sie durch 15 ml frisches Vollwachstumsmedium nach 24 Stunden. NOF können für 1-3 Tage vor der Spaltung kultiviert werden. Hinweis Proliferation des NOF wird aufhören, wenn die Zellen Konfluenz erreichen.
    5. Bestätigen Sie, dass die primären menschlichen Fibroblasten sind flache, langgestreckte Zellen und exprimieren Vimentin aber nicht Cytokeratin-8 durch Ausführen Immunhistochemie 8 (3B, D, F). Verwenden Niedergang NOF für Experimente (im Idealfall vor dem Durchgang 3) Entdifferenzierung zu minimieren und Änderung der ursprünglichen Phänotyp. Verwenden Sie ein Weitfeld-Mikroskop mit einem 20x-Objektiv mit Kunststoff-DIC-Fähigkeiten dafür verantwortlich, alle Phasenbilder von Zellen,und eine 10-fach Objektiv in Hellfeld zu analysieren immunhistochemischen DAB-Färbung.

2. Überzug die organotypische Kultur 8

  1. Release NOF vom 75 cm Kulturkolben durch Spülen mit 10 ml PBS, gefolgt von 3 ml 0,25% Trypsin / 25 mM EDTA für nicht mehr als 5 min. Neutralisieren Trypsin mit mindestens 3-fache des Volumens der Vollwachstumsmedium.
  2. Übertragen Sie mit Trypsin-Zellen in einem 50 ml konischen Rohr und Spin-down bei 0,5 gx 3 min. Überstand entfernen und bringen Zellen wieder in 5 ml Vollwachstumsmedium. Verwenden Sie einen Zellenzähler, um die Zellen von der Kulturflasche gewonnen zu zählen.
  3. Verdünnte Zellen in dem entsprechenden Volumen der vollen Wachstumsmedien zu 2.000-4.000 NOF pro 100 & mgr; l auf eine schwarze, klarem Boden, 96-Well-Platte Platte. Mit 0,5 ug / 100 ul Rattenschwanzkollagen I zu dem Zellgemisch vor dem Plattieren. Lassen Zellen sitzen bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für mindestens 4 Stunden, oder bis die Zellenan der Plattenoberfläche haftet.
  4. Lassen HPMC von der Kulturflasche mit den gleichen Schritten in 2.1 und 2.2 beschriebenen Methoden. Verdünnte Zellen in der entsprechenden Menge an Vollwachstumsmedium auf 10.000-20.000 HPMC pro 50 & mgr; l auf der Oberseite der NOF in 96-Well-Platten bereits mit Kollagen I überzogene Platte. Lassen Sie die Zellen sitzen bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für mindestens 18 Stunden vor Beginn der Experimente.
  5. Kultur grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimierenden HeyA8 Eierstockkrebszellen in vollem Wachstum Medien. HeyA8 Ovarkrebszellen fluoreszenz durch Expression von einem lentiviralen Vektor, der copepod CGFP (pcdh-CMV-MCS-EF1) markiert. HeyA8 Ovarkrebszellen sollte 80-90% konfluent waren am Tag der Verwendung (logarithmischen Phase) sein. Lassen Zellen von der Kulturplatte und zählen mit den gleichen in Schritten von 2,1 bis 2,2 für die Primärzellen beschriebenen Methoden.
  6. Lassen Sie Eierstockkrebszellen in Vollwachstumsmedium für 15-20 Minuten bei 37 ° C in eine erholenkonischen Röhrchen mit dem Deckel lose verschlossen.

3. Adhäsionsassay 8

  1. Nach der Wiederherstellung zu pelletieren, die Eierstockkrebszellen durch Spinnen für 3 min bei 0,5 xg und entfernen Sie den Überstand und verdünnt, die Zellen in das entsprechende Volumen von serumfreien Medien, um eine Konzentration von 50.000 Zellen / 100 ul zu erreichen.
  2. Kehren Sie die 96-Well-Platten mit den HPMC / NOF organotypischen Kulturen zu verbrauchten Medien zu entfernen, und fügen Sie 100 ul der Krebszellsuspension in Serum-freiem Medium in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für 30 min bis 4 h.
  3. Kehren Sie die Platte mit 96 Vertiefungen, um Medien und nicht-anhaftende Zellen zu entfernen. Verwenden Sie ein Mehrkanalpipette mit geringer Leistung, um vorsichtig und sanft Je 100 ul PBS in jede Vertiefung, und invertieren Platte wieder. Wiederholen Sie die PBS waschen einmal.
  4. Kehren Sie zum PBS entfernen und 100 ul 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung. Damit die Platte für 20 mi sitzenn der Zellen zu reparieren. Nach 20 Minuten, die Platte umdrehen und fügen Sie 100 ul PBS.
  5. Man beachte, dass die Gesamtfluoreszenz Wells können gemeldet werden, oder die Anzahl von Zellen quantifiziert werden kann. Zur Quantifizierung erste Platte eine Standardkurve in Doppelbestimmung unter Verwendung HeyA8 Zellen bei einer Konzentration von 1 Million Zellen / ml.
    1. Stellen Sie die Standardkurve indem sie zum Stillstand 1 Million Zellen, Entfernen von Medien, und es ihnen ermöglicht, in 1 ml 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten sitzen.
    2. Spin-Zellen wieder und bringen Sie in 1 ml PBS (Nachzählung Zellen 1 Million / ml-Konzentration, um zu bestätigen). Platte 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000 und 0 Zellen pro Vertiefung in doppelten und fügen PBS zur endgültigen Gesamtvolumen von 50 ul in jede Vertiefung.
  6. Unten lesen Sie die Kulturplatte auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Anregung = 488 nm, Emission = 528 nm), Skalierung hohen Brunnen (50000 auf Standardkurve). Verwenden Sie die Standardkurve zu berechnen, wie viele Eierstockkrebszellen auf die organotyp haltenic Kultur in jeder Vertiefung (4A-C).

4. Proliferationstest 10

  1. Nachdem die Eierstockkrebszellen zu erholen (siehe Schritte 2.5 und 2.6 oben), pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 3 min bei 0,5 × g und dann zu verdünnen, die Zellen in das entsprechende Volumen von 1% FBS Medien (DMEM mit 1% FBS, 1% MEM Vitamine [93 mg / L], 1% MEM nichtessentiellen Aminosäuren [81,4 mg / L], 1% Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin]), um eine Konzentration von 4000 Zellen zu erreichen / 150 ul.
  2. Kehren Sie die 96-Loch-Platte mit den HPMC / NOF organotypischen Kulturen, um verbrauchte Medium in jede Vertiefung zu entfernen, und fügen Sie 150 ul der Krebszelle Suspension 1% FBS Medien. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für 72 Stunden.
  3. Unten lesen Sie die Kulturplatte auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät einmal täglich (Anregung = 488 nm, Emission = 528 nm), um die relative Verbreitung bewertender Zellen. Weiterhin den Test 96 Stunden, wenn der Medien bei 48 h (5A-C). Achten Sie darauf, die Kultur zu stören beim Medienwechsel (Umdrehen der Platte ist bevorzugt).

5. Invasion Assay 8

  1. Vor der Beschichtung der 3D-Kultur, fügen 7,5 & mgr; g Rattenschwanz Kollagen I in 200 ul PBS auf eine 24-Well-Kulturplatte Einsatz (8 & mgr; m Porengröße). Lassen Sie die Platte Inkubat O / N, dann vorsichtig die PBS mit einer Pipette unmittelbar vor dem Beschichten des HPMC / NOF organotypische Kultur auf die Kollagen-beschichteten Einsätze (Schritt 2, oben).
  2. Bereiten Sie die Eierstockkrebszellen, wie in Schritt 3.1. Um die Eierstockkrebszellen auf die organotypischen Kulturen an den Einsätzen Platte vorsichtig mit einer Pipette, um überschüssiges Medium aus dem oberen der Einsätze zu entfernen. Zugabe von 100 ul der Ovarialkarzinom-Zellsuspension in serumfreien Medien in jede Kammer.
  3. Fügen Sie 750 ul Vollwachstumsmedium in das Bohrloch unterhalb des Einsatzes, um Krebszellen in induzierenvasion in den organotypischen Kulturen. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für 24 Stunden.
    Hinweis: Eierstockkrebszellen, die die organotypische Kultur wird der Einsatz zu überqueren und bleiben auf der unteren Seite des Einsatzes einzudringen.
  4. Nach 24 Stunden, fassen Sie den Einsatz mit einer Zange und kurz abspülen in einen Becher mit PBS, bewegen Sie dann den Einsatz in eine leere gut. Gestrüpp der Oberseite jeder Einsatz mit beidseitig einer Wattestäbchen für insgesamt 1 min. Stellen Sie schnell den Einsatz in eine Platte mit 750 & mgr; l 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung. Lassen Sie jeder Einsatz in Paraformaldehyd für 10 Minuten, bevor die Übertragung der Einlagen in Vertiefungen mit 750 & mgr; l PBS gefüllt sitzen.
  5. Sehen Sie sich die Invasion Zellen (geklebt und an der Unterseite des Inserts fixiert) mit einem Mikroskop bei 2,5-facher Vergrößerung. Wenn der gesamte Brunnen ist im Blickfeld, passen Sie die Vergrößerung auf 10-fach und nehmen Sie 5 Bildern, einer nahe dem Zentrum und 1 in jedem Quadranten des Brunnens, die VermeidungAufnehmen von Bildern, die zu nahe an den Kanten. Folgen dem gleichen Muster für jede Vertiefung.
  6. Verwenden der Herstellerprogramm, um die Anzahl der Zellen in jeder Bild zählen, eine durchschnittliche Anzahl an Zellen in jeder Vertiefung (6A-C) eingedrungen pro Feld entsprechend ihrem Protokoll zu erhalten.

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Ergebnisse

Die organotypische Kultur wurde hergestellt durch zunächst Mischen primären humanen Fibroblasten, die mit Collagen Typ I und dann Überlagerung dieser Kultur mit der 5-fachen Anzahl von Mesothelzellen montiert. Die Kultur wurde für mindestens 18 Stunden inkubiert, bevor Eierstockkrebszellen wurden zugegeben, um die Adhäsion, Invasion oder Proliferation zu untersuchen. Jeder Test wurde mit mehrfachen wiederholten (n = 3-5) von verschiedenen Patienten und zahlreiche Vertiefungen erhaltenen 3D-Kulturen wurden in jeden ...

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Diskussion

Ein organModell der Bauchmikroumgebung wurde gegründet, um die individuellen und kollektiven Funktion (en) der beiden zellulären und angeborene Komponenten der Mikroumgebung bei Eierstockkrebs Verbreitung zu bewerten. Die spezielle Protokolle für die Beschichtung und das Anpassen der 3D organotypische Kultur zu Eierstockkrebs Zell-Adhäsion, Proliferation und Invasion zu untersuchen sind. Primäre humane omentalis Mesothelzellen und Fibroblasten wurden von Patienten isoliert und in einem frühen Durchgang verwendet, ...

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

We thank all residents and attending physicians, notably Dr. A.F. Haney (the University of Chicago, Department of Obstetrics and Gynecology) for collecting omental biopsies. Also, we thank Stacey Tobin and Gail Isenberg for carefully editing this manuscript. This work was supported by Bears Care, the charitable beneficiary of the Chicago Bears Football Club, the National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702, and the National Cancer Institute grant R01 CA111882 to E.L.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation and culture of primary cells
PBSFisher ScientificSH3001304
Single-edged razor bladesFisher Scientific12-640
15 cm culture dishesBD Biosciences353025
Glass flask??
Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM with L-GlutamineCorning10-013-CV
MEM VitaminsCorning25-020-Cl
MEM Nonessential amino acidsCorning25-025-CI
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
Shaker Thermo-FisherMaxQ 4450
CentrifugeEppendorf5702
IncubatorThermo-FisherForma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)Corning25-053-CI
HyaluronidaseWorthington BiochemicalLS002592
T-75 FlasksBD Biosciences353136
T-175 FlasksBD Biosciences353112
Pipet tipsRaininP2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tipsCorningFiltered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
2. Plating 3D culture
Cell CounterInvitrogenCountess
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10313
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
Collagen Type I (Rat Tail)BD Biosciences354236
96 well plate, clear bottom, blackBD Biosciences353219
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipetEppendorfXplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Plate readerMolecular DevicesMinimax
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well)BD Biosciences353097
Cotton swabsQ-tipscotton swabs
MicroscopeZeissAxiovert 200m
Cell Profilerpublic domain
24 well plateBD Biosciences353047
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058

Referenzen

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