Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Zusammenfassung

Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.

Zusammenfassung

Primärzellen werden direkt aus Gewebe gewonnen und sind gedacht, um mehr repräsentativ für den physiologischen Zustand der Zellen, die in vivo als etablierte Zelllinien sein. Jedoch weisen primäre Zellkulturen in der Regel eine begrenzte Lebensdauer und häufig wiedereingeführt werden müssen. Fibroblasten sind eine leicht zugängliche Quelle von Primärzellen. Hier diskutieren wir eine einfache und schnelle Versuchsdurchführung zu primären Fibroblastenkulturen von Ohren und Schwanz von Mäusen zu etablieren. Das Protokoll kann die primäre Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden, zu etablieren. Wenn das Protokoll genau befolgt, sind Verunreinigungen unwahrscheinlich, trotz der Verwendung für längere Zeit in einigen Fällen nicht gespeichert unsterilen Gewebe auftreten. Fibroblasten vermehren sich rasch in Kultur und kann zu einer beträchtlichen Zahl vor einer replikativen Seneszenz erweitert werden.

Einleitung

Primärzellen werden von lebendem Gewebe und kultiviert unter in vitro Bedingungen abgeleitet sind. Es wird allgemein angenommen, dass primäre Zellen, die den physiologischen Zustand und der genetische Hintergrund des Gewebes, aus dem sie stammen, als immortalisierte oder Tumorzelllinien ¹ stärker ähneln. Aus diesem Grund Primärzellen sind ein nützliches Modell für die Untersuchung biologischer Fragestellungen ^2,3. Doch im Gegensatz zu etablierten Zelllinien, die auf unbestimmte Zeit zu wachsen, Primärzellen schließlich unterziehen Seneszenz in Kultur und häufig wiedereingeführt werden müssen.

Üblicherweise verwendete primäre Zellen umfassen Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, T-Zellen, B-Zellen, Knochenmark-Makrophagen (BMDM) und Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDC). Fibroblasten werden oft als primäre Zellkultur-Modell genutzt. Sie bieten entscheidende Vorteile gegenüber anderen Primärzellen. Die Zellkulturen werden leicht hergestellt, leicht aufrechterhalten und erfordern keine Purification der Zellen vor der Kultur. Sie haben schnellen anfänglichen Proliferation und keine Voraussetzung für die Fachmedium oder Aktivierungsprotokolle. Fibroblasten lassen sich effizient mit biologischen, chemischen und physikalischen Protokollen ^4,5 transfiziert werden. Gibt es eine Möglichkeit, um die Ohren für bis zu 10 Tage bei RT vor der Etablierung von Zellkulturen zu speichern. Fibroblastenkulturen sind förderlich für die Visualisierung von zytoplasmatischen Prozesse und für die Neuprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) ^6.

Fibroblasten sind wichtige Zellen des Bindegewebes, die Kollagen-Proteine ​​der extrazellulären Matrix ⁷ sekretieren. Sie stellen den strukturellen Rahmen in vielen Geweben ⁸ und spielen eine wesentliche Rolle bei der Wundheilung und Gewebereparatur ^9,10.

Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (<4 h) Protokoll, um Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse ¹¹ zu etablieren. Das Protokoll erfordert nur minimale MausErfahrung, um das Gewebe (im Gegensatz zu anderen Protokollen ^12,13) ​​zu ernten und kann verwendet werden, um Kulturen von Ohren in Medium bei RT für bis zu 10 Tage gelagert zu etablieren.

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Protokoll

Die Mäuse wurden in pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts bis Euthanasie (The Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien an der National University of Singapore und der National Advisory Committee für Labortierforschung (NACLAR) Richtlinien) untergebracht ist.

1. Mäuse

1. Bestellen Sie eine Maus der entsprechenden genetischen Hintergrund. Dieses Protokoll basiert auf Gewebe von einer C57BL / 6-Mäusen abgeleitet wurden.

2. Herstellung von Komplettmedium

1. Vorbereitung Komplettmedium durch Zugabe der folgenden Komponenten zu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium, 10% fötales Kälberserum (FCS), 50 uM 2-Mercaptoethanol, 100 uM Asparagin, 2 mM Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung.

3. Vorbereitung der Enzymlösungen

1. Bereiten Kollagenase D-Lösung in einem 15 ml konischen Bodenrohr.
   1. Man wiegt 10 mg Kollagenase D. Dissolve Kollagenase D in 4 ml Vollmedium.
2. Bereiten Pronase-Lösung in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   1. Man wiegt 10 mg Pronase.
   2. Plus 5 ul 1 M Tris-Puffer (pH 8,0). 1 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0).
   3. Füllen Sie mit 494 & mgr; l sterilem Wasser.
   4. Inkubieren Pronaselösung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min.

4. Herstellung von Collagenase D-Pronase Mix (≤2 Tails)

Hinweis: Führen Sie die nachfolgenden Schritte in einem sterilen Zellkultur Kapuze.

1. Add 250 ul Pronase Lösung auf 4 ml Kollagenase D-Lösung.
2. Übergeben Sie die Collagenase D-Pronase Mischung durch einen 0,2 um Spritzenfilter in ein steriles 15 ml konischen Bodenrohr.

5. Gewinnung von Fibroblasten von Ohr und Schwanz Tissues

1. Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts.
2. Zeigen autoklaviert chirurgische Instrumente (Schere und Pinzette) in der Zellkultur Kapuze.
3. 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen je.
4. Geschnitten Ohren (~ 1 cm Radius) und 5 cm des Schwanzes (von der Spitze des Schwanzes) einer Maus mit Schere und Inkubation für 5 min in 40 ml 70% igem Ethanol in einem sterilen 50 ml konischen Unterrohr.
5. Luft trocknen Ohren und Schwanz, indem sie in einer offenen 10 cm Zellkulturschale in der Haube für 5 min. Einmal getrocknet, Transfer Ohr und Schwanzstücke, zwei Kulturschalen mit "Ohren" und "Schwanz", die 10 ml Vollmedium wie in Schritt 5.3 beschrieben.
6. Entfernen Sie Haare aus den Ohren und Schwanz mit einer Schere.
7. Schneiden Ohren und Schwanz in Stücke kleiner als 3 mm in der Größe mit einer Schere.
8. Übertragen Sie die geschnittenen Gewebe in 1,8 ml Kryoröhrchen Fläschchen mit "Ohren" und "Schwanz" und fügen Sie eine ausreichende Kollagenase D-Pronaselösung für das Volumen, um das 1,8-ml-Markierung auf der Flasche zu erreichen.
9. Pschnüren die Kryoröhrchen Fläschchen horizontal auf einem Shaker und schütteln Sie die Proben bei 200 Upm für 90 min bei 37 ° C.
10. Nach 90 min Inkubation, entfernen Sie die Kryoröhrchen Vials aus dem Schüttler und legen Sie die Durchstechflaschen in der Kapuze.
11. 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen, die mit "Ohren" und "Schwanz" jeder, und legte eine 70 & mgr; m Zellsieb in jedem Gericht.
12. Legen Sie die verdaut Ohr und Schwanz Gewebe in der 70 & mgr; m Zellsieb in den entsprechend gekennzeichnet Gerichte in Schritt 5.11 vorbereitet und kraftvoll mahlen das Gewebe mit einer 10 ml Spritzenkolben für> 5 min. Schütteln Sie die Zellsieb gelegentlich in dem Medium, um Zellen aus der Zelle Sieb waschen.
13. Pipettieren Sie die Zellsuspension aus jeder Schale in zwei 15 ml konischen Boden Rohre mit "Ohren" und "Schwanz". Waschen Sie die Teller und Sieb mit zusätzlichen 10 ml Komplettmedium und fügen Sie das Medium in die entsprechenden 15 ml konischen Boden Rohre.
14. Spin down die ZelleSuspension 7 min bei ~ 580 × g und 4 ° C unter Verwendung einer Kühlzelle Zentrifuge.
15. Überstand entfernen, 10 ml Komplettmedium auf das Zellpellet in 15 ml konischen Boden Rohr und die Zellen resuspendieren.
16. Wiederholen Sie Schritt 5.14 und 5.15.

6. Die Kultivierung des Zellgemisches

1. Überstand entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet ungestört bleibt.
2. Re-suspend-Zellen in 10 ml Vollmedium und fügen Sie die entsprechende Mischung auf zwei 10 cm Zellkulturschalen mit "Ohren" und "Schwanz".
3. Zugabe von 10 & mgr; l Amphotericin B-Lösung (Stammlösung: 250 & mgr; g / ml) zu der Kultur.
4. Zellen bei 37 ° C inkubieren in einem befeuchteten 5% CO _{2 -Inkubator.}
5. Am dritten Tag, ersetzen Sie das Medium, das mit 10 ml frisches vollständiges Medium, das 10 & mgr; l von Amphotericin B, um Ablagerungen zu entfernen (Abbildung 1 und 2).

7. Sub-Kultur von Fibroblasten

1. When Kultur erreicht etwa 70% Konfluenz (Tag 3-4 Kultur) Entfernen des Mediums und Waschen der Zellen mit 5 ml sterile 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Entfernen PBS und 2 ml sterile 1x Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen.
3. Die Zellen 5 min bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO _{2 -Inkubator.}
4. Nach 5 min, klopfen Sie leicht das Kulturschale und 6 ml Vollmedium zu den Zellen.
5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Boden Rohr und drehen Sie das Rohr für 5 min bei ~ 450 xg und 4 ° C unter Verwendung eines Kühlzelle Zentrifuge.
6. Überstand abnehmen und vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in 5 ml Vollmedium.
7. Samen 2 x ¹⁰ 5 Zellen in einer 10 cm Zellkulturschale und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten _5% CO 2 Inkubator für 3-4 Tage vor der Wiederholung der Schritte 7.1 bis 7.6.

8. Herstellung von Ohren für den Versand

Hinweis: Führen Sie ter nachfolgende Schritte in einer sterilen Zellkultur Kapuze.

1. Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts.
2. Zeigen autoklaviert Schere und Pinzette in die Zellkultur Kapuze.
3. 50 ml vollständigem Medium in einem 50 ml konischen Unterrohr.
4. Schneiden Sie die Ohren (~ 1 cm Radius) einer Maus mit einer Schere.
5. Übertragen Sie die Ohren in die 50 ml konischen Bodenrohr mit einer Pinzette (wie in Schritt 3 hergestellt).
6. Verschließen Sie die 50 ml konischen Bodenrohr mit Parafilm vor dem Versand bei RT in einer entsprechenden Box.

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Ergebnisse

Extraktion von Fibroblasten, die aus Gewebe in einer signifikanten Menge an Gewebetrümmer (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Gewebetrümmer, Fibroblasten haften an Gewebekulturkunststoffoberflächen zwischen Tag 1 und 3 der Kultur. Das Medium der Fibroblastenkulturen kann sicher an Tag 3 der Kultur, die die Pegel der vorliegenden Trümmer in der Kultur (2) signifikant verringern sollte verändert werden. Fibroblasten zeigen eine längliche Morphologie und eine deutlich sichtbare Zytoplasma...

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Diskussion

Hier stellen wir eine einfache, kostengünstige und schnelle experimentelle Verfahren zur primären Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse zu etablieren. Die Extraktion sollte in haftende und sich schnell teilenden Fibroblasten innerhalb von 3 Tagen nach der Trennung des Gewebes führen. Eine wichtige Einschränkung von Primärzellen ist Seneszenz, eine dauerhafte Wachstumsstillstand ^15. Verwendung des Protokolls kann Fibroblastenkulturen für 5-6 mal passagiert werden, bevor Fibroblasten...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG