Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

Zusammenfassung

Wir stellen eine Protokoll-Zellen abgeleiteten Matrices reich an extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, unter Verwendung von hochmolekularen Crowders (MMC). Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, das MMC in 3D organotypischen Haut Co-Kultur-Generation enthält, die Kulturzeit reduziert, während Laufzeit von Konstrukt beibehalten wird.

Zusammenfassung

Das Glycoprotein-Familie von Kollagenen stellt die Hauptstrukturproteine ​​in den menschlichen Körper, und sind wichtige Komponenten von Biomaterialien in modernen Tissue Engineering eingesetzt. Ein technischer Engpass ist die Ablagerung von Kollagen in vitro, da sie bekanntermaßen langsam ist, in suboptimalen Bildung von Bindegewebe und anschließende Gewebekohäsions resultierende, insbesondere in Hautmodellen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das die Zugabe von differentiell-sized Saccharose Co-Polymere Hautkulturen umfasst makromolekulare Verdrängung (MMC) zu erzeugen, die in einer dramatischen Erhöhung der Kollagenablagerung führt. Insbesondere abgeschieden dermalen Fibroblasten eine erhebliche Menge an Kollagen I / IV / VII und Fibronektin unter MMC im Vergleich zu Kontrollen.

Das Protokoll beschreibt auch ein Verfahren gedrängten Zellschichten zu Dezellularisieren, beträchtliche Mengen an extrazellulären Matrix (ECM) Belichten der auf der Kulturfläche zurückgehalten wurden, wie durch immunocy bewiesentochemistry. Gesamtmatrixmasse und Verteilungsmuster wurde unter Verwendung von Interferenz-Reflexions-Mikroskopie untersucht. Interessanter, Fibroblasten, Keratinozyten und Co-Kulturen hergestellt Zellen abgeleiteten Matrizen (CDM) der Zusammensetzung und der Morphologie verändern. CDM könnte als "bio-Scaffolds" für die sekundäre Zellaussaat, wo die aktuelle Verwendung von Beschichtungen oder Gerüste, typischerweise von xenogenen tierischen Quellen verwendet werden, vermieden werden können, damit zur weitere klinisch relevante Anwendungen bewegen.

Zusätzlich beschreibt dieses Protokoll die Anwendung von MMC während der Tauchphase eines 3D-organotypischen Haut Kokultur-Modell, das ausreichend war ECM Ablagerung in der dermo-epidermalen Verbindung (DEJ), insbesondere, Kollagen VII, der Hauptbestandteil zu verbessern von Ankerfibrillen. Die Elektronenmikroskopie bestätigte die Anwesenheit von mit MMC entwickelten Fibrillen in Kulturen Verankerung, im Vergleich zu Kontrollen. Dies ist bedeutsam, als Verankerungs Fibrillen der Dermis auf die Epidermis anbinden, damitmit einem vorgeformten reifen DEJ Hauttransplantation Empfänger in Bezug auf die Graft-Stabilität und die gesamte Wundheilung profitieren können. Des Weiteren wurde Kulturzeit von 5 Wochen bis 3 Wochen kondensiert ein reifes Konstrukt zu erhalten, wenn MMC verwenden, die Kosten zu senken.

Einleitung

Die Haut bildet eine schützende Barriere, die durch Wasserverlust und Krankheitserreger Eintritt zu verhindern. Es besteht aus drei Hauptkomponenten; die Stroma reichen Dermis ^1, eine geschichtete Epidermis ^2,3,4 oben drauf, und der dermo-epidermalen Verbindung zwischen ^5,6. Die Dermis besteht hauptsächlich aus kollagenen und elastischen Fasern zusammengesetzt und ist dünn besiedelt mit Fibroblasten ^7. Im Gegensatz dazu wird die zellreiche Epidermis aus mehreren Schichten von Keratinozyten zusammen. Die Keratinozyten der innerste Schicht sind proliferative und neue basalen Zellen bereitzustellen, die unheilbar erneuern und ersetzen Keratinozyten, die sich ständig bewegen, um die äußerste Schicht der Haut und haben verloren ihre Kerne und Zytoplasma-Material, was zu einer verhornte Schicht Differenzierung, die erfährt Schuppung.

Die dermale-epidermale Verbindung, eine bestimmte Art von Basalmembran, ist eine komplexe Struktur aus miteinander verbundenen Matrixmolekülen zusammengesetzt, die tethers die Epidermis in die Dermis. Collagen-I-Fasern der Dermis Interlace mit Kollagen VII Fibrillen Verankerung, die an das Kollagen IV reichen Lamina densa verankert sind. Verankerungs Filamente (Laminin 5, Kollagen XVII und Integrine) wiederum verbinden die Lamina densa mit Hemidesmosome basaler Keratinozyten. Basalen Keratinozyten (Stratum basale) haben die Fähigkeit, sich zu vermehren und zu erneuern, sowie differentiate und stratify die suprabasalen Schichten zu bilden; stratum spinosum, stratum granulosum, und schließlich das Stratum corneum, die mit der Umgebung der Kontaktfläche der Haut dar. Auf dem Weg von der Basalschicht an die Hornschicht der Schalter Keratinozyten Expressionsmuster von Zytokeratine und schließlich Apoptose und umhüllen sich in verhornten Umschläge Rümpfe der spezifischen Proteine, die durch Transglutaminase-Aktivität kovalent vernetzt sind.

Recreating Haut und deren Schichten in vitro, einschließlich der komplexen Strukturen des dermalen-epidermalen Verbindung und dermalen extrazellulären Matrix und die Verhornungsprozess zu emulieren, hat lange faszinierte Wissenschaftler und bioengineers als anspruchsvolle Aufgabe. Es wurden bedeutende Fortschritte in Hautgewebe - Engineering, beispielsweise die erfolgreiche Extraktion von Hautzellen von Patienten Biopsien und die Erzeugung von Haut organotypischen Kulturen unter Verwendung von Patienten stammenden Hautzellen ^8. Jedoch bleiben ungelöste Probleme in Bezug auf schlechte Sekretion von extrazellulären Matrixproteinen von den Hautzellen selbst und was zu suboptimalen Hautmodelle. Weiterhin wird die Zeit variiert zwischen vier bis acht Wochen 3D organotypischen Haut Kokultur mit den aktuellen Protokolle zu erzeugen, einen Zeitrahmen, die potentiell mit dem Einbau von hochmolekularen Crowders verkürzt werden konnte. Reduktionskultivierungszeit spart Reagenzkosten, verringert die Häufigkeit von Zellalterung und reduziert die Wartezeit des Patienten sollte in der Klinik das Produkt verwendet werden.

t "> makromolekulare Verdrängung (MMC) mit spezifischen Makromolekülen in das Kulturmedium einzuführen ausgeschlossen Volumeneffekte zu erzeugen. Diese beeinflussen die enzymatische Reaktionsraten einschließlich der proteolytischen Spaltung von Prokollagen , die ^9-13 säumig unter wässrigen Standardkulturbedingungen ist. Unter MMC, enzymatische Reaktionen ^14,15 was im Falle von Prokollagen Spaltung, eine erhöhte Menge an Kollagen I Moleküle in gedrängten Kulturen im Vergleich zu Kontrollen laufenen ^10. da die Umwandlung von Prokollagen zu Kollagen beschleunigt , ohne die Menge der Reagenzien Erhöhung ermöglicht die Bildung von Kollagen Baugruppen, mit MMC kultivierten Fibroblasten 48 Stunden ergab signifikant mehr Kollagen I im Vergleich zu laufenen Fibroblastenkulturen für bis zu vier Wochen überwacht ^11,16,17. Neben Auswirkungen auf enzymatische Aktivitäten, die die Bildung, Stabilisierung und Remodellierung von ECM, MMC auch beeinflussen wurde Kollagen gezeigt, direkt verbessern und zu modulierenFaserbildung ^18,19.

Wir stellen Ihnen hier eine Methode, um die extrazelluläre Matrix (ECM) Produktion von Hautzellen zu verbessern, insbesondere dermale Fibroblasten und Keratinozyten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die angereicherte ECM unter MMC in Monolayer-Kulturen erzeugt werden, können als reine Zellen abgeleiteten Matrix (CDM) dezellularisiert und verwendet werden.

Wir verwenden eine nicht-konventionellen Ansatz zu visualisieren und in vollem Umfang schätzen die von Hautzellen kultiviert abgelagert ECM mit MMC. Interferenzreflexionsmikroskopie zur Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen oder Zell-zu-Glas-Kontaktstellen der Regel verwendet. Diese Technik wurde in unserem System verwendet, um die Gesamtmenge der Matrix, auf der Glasoberfläche abgeschieden anzuzeigen. Interferenz-Reflexionsmikroskopie wurde gekoppelt mit Fluoreszenzimmunfärbungs die meisten Informationsmenge in Bezug auf die extrazelluläre Matrixzusammensetzung und das Muster, in Gegenwart und Abwesenheit von MMC zu erhalten.

Organotypic Haut Kokulturen ist eine klassische Methode , um die Haut in vitro in einem dreidimensionalen Kontext zu modellieren. Während zweidimensionale Kokulturen signifikante Information liefern kann, ist sie begrenzt , wenn diese Daten zu übersetzen und es zurück zu einer in vivo - Umgebung der Anwendung, die von Natur aus eine dreidimensionale Struktur. Haut-Keratinozyten, insbesondere sind polarisiert und enthalten apikalen und basalen Segmente, die für die Homöostase und Zelladhärenz wesentlich sind. Zusätzlich ist die Expression von typischen suprabasalen Proteine ​​in Keratinozyten über der basalen Schicht, wie Keratin 1, Keratin 10 und Filaggrin nur im Zuge der Schichtung und terminale Differenzierung von Keratinozyten. Da die terminale Differenzierung kaum in typischen Monolayer-Kulturen ist, wird suprabasal Proteinexpression normalerweise nicht in diesem Kultursystem erreicht. Daher beginnen organotypischen Kulturen in Kulturmedium eingetaucht, aber werden dann einer Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle angehoben zu fahren keratinocyte Differenzierung. Dies resultiert in der Expression von Markern Schichtung sogar Verhornung und eine allgemein bessere Reflexion der epidermalen Physiologie. Während andere Gruppen zuvor organotypischen Haut Co-Kulturen erfolgreich generiert haben, hat sich die Einrichtung eines funktionalen dermoepidermale Verbindungszone ein Thema. Hier präsentieren wir eine neue Methode zur Kultivierung von organotypischen Haut Co-Kulturen mit einer verbesserten Basalmembran, in einer verkürzten Zeitrahmen und ohne die Reife dieser Konstrukte zu beeinträchtigen. Dies würde Haut Mimetika für in - vitro - Modellierung bereitzustellen, die Untersuchung der Hautbiologie und ein Sortiment von Screening - Assays.

Protokoll

1. Makromolekulare Crowding in 2D Hautzellkulturen

1. Seed 50.000 Zellen (primäre Fibroblasten oder primäre Keratinozyten oder Co-Kultur von primären Fibroblasten und Keratinozyten) pro Well einer 24-Well-Platte. Samenzellen in 1 ml der entsprechenden Zelltyp Wachstumsmedien.
2. Erlauben Zellen über Nacht anhaften, in einem 37 ° C Inkubator bei 5% CO _2.
3. Entsorgen Sie alte Medien und ersetzen mit 1 ml frischem Medium molekularen Crowders und 100 uM Ascorbinsäure enthält. Verwenden eine crowder Cocktail bestehend aus 37,5 mg / ml Ficoll 70 und 25 mg / ml Ficoll 400 Verwenden Fibroblastenmedium (FM), das aus DMEM mit 10% FBS ergänzt und 1% Penicillin-Streptomycin-Antibiotika. Wachsen Keratinozyten in einem serumfreien Medien, KSFM oder CnT-57. Pflegen Kokulturen in einer Mischung aus 50% und 50% FM serumfreien Medien.
4. Inkubieren Kulturen für 6 Tage in einem 37 ° C Inkubator bei 5% CO _2, mit einem Medienwechsel alle 2 Tage.

2. Fluorescent Immunostaining auf Hautzellkulturen

1. Waschen Sie Zellkulturen zweimal mit 1x PBS.
2. Fix Zellkulturen mit entweder Methanol oder Paraformaldehyd (abhängig von der Antikörper-Spezifikationen).
   1. Für Methanol-Fixierung
      1. Aliquot 500 ul kaltem Methanol in jede Vertiefung gegeben und für 10 min bei -20 ° C inkubieren. Absaugen Fixiermittel und Methanol Abfall entsorgen. Luft trocknen in einer laminaren Abzugshaube.
   2. Für Paraformaldehyd Fixierung
      1. Aliquot 500 ul 2% Paraformaldehyd-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. Absaugen Fixiermittel und Paraformaldehyd Abfall entsorgen.
      2. Waschen mit 1x PBS, für drei Waschungen, 5 min pro Wasch.
      3. Aliquot 1 ml 1x PBS in jede Vertiefung.
3. Fluoreszierende Immunostaining Antikörpern
   1. Aliquot 500 ul 3% Rinderserumalbumin (verdünnt in 1x PBS) in jede Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min. Saugen Sie das Blockierungslösung und entsorgen.
   2. Primärer Antikörper
      1. Für die Bildgebung direkt von der Platte: Aliquot 200 ul primärer Antikörper (1: 100 Verdünnung in 10% Ziegenserum) Lösung in jede Vertiefung und für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
      2. Für Deck: Aliquot 50 ul primärer Antikörper (1: 100 Verdünnung in 10% Ziegenserum) Lösung auf ein flaches Stück Parafilm. Eindecken auf die Parafilm, mit der Zellseite (Teil der Deck mit Zellen), um die Lösung gegenüber. Decken Sie die gesamte Zelle-Seite, ohne Blasen. Inkubieren für 90 min bei Raumtemperatur.
   3. Absaugen primären Antikörperlösung und entsorgen.
   4. Waschen mit 1x PBS, für drei Waschungen, 5 min pro Wasch.
   5. Sekundäre Antikörper
      1. Für die Bildgebung direkt von der Platte: Aliquot 200 ul sekundären Antikörper (1: 400 Verdünnung in 10% Ziegenserum) Lösung in jede Vertiefung und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und deckt die Platte mit Aluminium fo il.
      2. Für Deck: Aliquot 50 ul sekundären Antikörper (1: 400 Verdünnung in 10% Ziegenserum) Lösung auf ein flaches Stück Parafilm. Eindecken auf die Parafilm, mit der Zellseite (Teil der Deck mit Zellen), um die Lösung gegenüber. Decken Sie die gesamte Zelle-Seite, ohne Blasen. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur, für den Parafilm mit Aluminiumfolie.
   6. Absaugen sekundären Antikörperlösung und entsorgen.
   7. Waschen mit 1x PBS, für drei Waschungen, 5 min pro Wasch. Aliquot 1 ml 1x PBS in jede Vertiefung.
   8. Montage
      1. direkt von der Platte zur Abbildung: nicht bereitgestellt. Fahren Sie mit Mikroskop.
      2. Für die Bildgebung von Deck: Mount Deck, Medien, auf einen Glasträger bei der Montage. Trocken über Nacht in einem Behälter mit Aluminiumfolie abgedeckt. Fahren Sie mit Mikroskop.
4. Erwerben von Bildern mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Ziel-40X / 1.30 unter Verwendung des Öls.

e "> 3. Western Blotting von Hautzellkulturen

1. Waschen Zellschichten zweimal mit 1x PBS.
2. Aliquot 100 ul Lysepuffer (siehe Materialliste) in die Vertiefungen (6-Well-Platte-Format). Kratzen Sie die Zellschicht mit einem Zellschaber und Transferlösung in ein Reaktionsgefäß.
3. Zentrifuge Lösung bei 15.330 xg für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen und verwerfen das Pellet.
4. Mischen Sie 13 ul jeder Probe mit 5 ul Probenpuffer und 2 ul Reduktionsmittel (siehe Materialliste). Wärme Proben bei 95 ° C für 10 min.
5. Centrifuge Proben bei 15.330 × g für 1 min Kondenswasser zu sammeln. Belastungsproben in einen vorgegossenen PAGE-Gel und für etwa 1 Stunde bei 100 V laufen.
6. Zu getrennten Proteine ​​auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, Sandwich, das Gel und die Membran zwischen den Papierstücken und Schwämmen (gleicher Größe). Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen zwischen den Gel, Membran, Papiere und Schwamms. Schließen Sie die Sandwich-Kassette und führen die Übertragung bei 70 V für in 2 Stunden.
7. Um zu überprüfen, ob die Übertragung abgeschlossen war, brüten die Membran mit 10 ml Ponceau S. Waschen Sie die Membran mit 0,1% PBS-Tween-20, dreimal 10 Minuten pro Wäsche.
8. Block mit 10 ml 5% Milch für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran mit 0,1% PBS-Tween-20, dreimal 10 Minuten pro Wäsche.
9. Inkubieren mit 10 ml primärer Antikörper für 90 min (Maus-Anti-Kollagen VII, LH 7,2, 1: 1000 Verdünnung in 5% Milch). Waschen Sie die Membran mit 0,1% PBS-Tween-20, dreimal 10 Minuten pro Wäsche.
10. Inkubieren mit 10 ml sekundärem Antikörper für 30 min (Ziege-Anti-Maus-HRP, 1: 2000 Verdünnung in 5% Milch). Waschen Sie die Membran mit 0,1% PBS-Tween-20, dreimal 10 Minuten pro Wäsche.
11. Übertragen Sie die Membran auf eine Kassette und 1 ml ECL-Detektionsreagenzien. Legen Sie eine klare, dünne Plastikfolie über die Membran.
12. Zur Erkennung von Chemilumineszenz, legen Sie einen lichtempfindlichen Film auf der Plastikfolie und schließen Sie die Kassette. nach 2-5 Min, entfernen Sie den Film aus der Kassette und legen Sie sie in einen Entwickler.

4. Herstellung und Verwendung einer Zelle abgeleitete Matrix

1. Seed 50.000 Zellen (primäre Fibroblasten oder primäre Keratinozyten oder Co-Kultur von primären Fibroblasten und Keratinozyten) pro Well einer 24-Well-Platte.
2. Erlauben Zellen über Nacht anhaften, in einem 37 ° C Inkubator bei 5% CO _2.
3. Entsorgen Sie alte Medien und ersetzen Sie sie durch frische Medien hochmolekularen Crowders und 100 uM Ascorbinsäure enthält. Die crowder Cocktail besteht aus 37,5 mg / ml Ficoll 70 und 25 mg / ml Ficoll 400 Fibroblast Medien (FM) besteht aus DMEM mit 10% FBS ergänzt und 1% Pen-Strep. Keratinozyten in einem serumfreien Medien, KSFM oder CnT-57 gezüchtet. Pflegen Kokulturen in einer Mischung aus 50% und 50% FM KSFM oder CnT-57.
4. Inkubieren Kulturen für 6 Tage in einem 37 ° C Inkubator bei 5% CO _2, Medium alle 2 Tage verändert.
5. Dezellularisieren Zellschichten eine Zelle abgeleitete matri zu erhaltenx (f-mat = Fibroblasten abgeleiteten Matrix, k-mat = Keratinozyten stamm Matrix co-mat = Matrix , die aus einer Co-Kultur von Fibroblasten und Keratinozyten abgeleitet).
   1. Waschen Zellschichten zweimal in 1x PBS.
   2. In 250 ul 0,5% Natriumdeoxycholat. Inkubieren auf Eis für 10 min. Absaugen Zelllysat.
   3. Wiederholen Sie Schritt 4.5.2 dreimal.
   4. Wash - Zellen abgeleiteten Matrix zweimal in destilliertem H ₂ O. Halten Zellen abgeleiteten Matrix in 1x PBS. Matrices können für bis zu 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden.
6. Bereiten Sekundärzellsuspension (zB Seeding Keratinozyten auf Top von f-mat).
   1. Absaugen 1x PBS.
   2. Samen 50.000 Keratinozyten auf der Oberseite der Zellen abgeleiteten Matrix (f-mat). Erlauben Zellen über Nacht anhaften, in einem 37 ° C Inkubator bei 5% CO _2.
      Anmerkung: Die Tests können direkt auf den adhärenten Zellen durchgeführt.

5. Charakterisierung des Cell-abgeleiteten Matrix

1. Fluoreszierende Immunfärbung: Siehe Protokoll 2.
2. Interferenz - Reflexions - Mikroskopie
   1. Seed-Zellen auf Glasplättchen, folgendes Protokoll 4,1-4,5.
   2. die Zellen abgeleiteten Matrix Nach Erhalt beheben Proben nach Protokoll 2.2.
      Hinweis: Antikörper-Färbung ist optional. Falls erforderlich, siehe Protokoll 2.3.
   3. Führen Sie die Bildaufnahme durch ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 40x / 1,30 Öl-Objektiv. Stellen Sie die Pinhole bei 74 mm.
   4. Verwenden LP 505 für die Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) Kanal und BP 575-615 IR für die fluoreszenz roten Kanal für Filter. Verwenden NT 80/20 für den IRM-Kanal und HFT 405/488/561, NFT 565, Platte für die fluoreszenz roten Kanal für die Strahlteiler. Verwenden Sie die folgenden Laser: DPSS 561-10 (Wellenlänge 561 nm) bei 1,1% Leistung für die fluoreszenz roten Kanal und HeNe633 (Wellenlänge 633 nm) bei 5,0% Leistung für den IRM-Kanal.

6. 3D Organotypischen Haut Co-Kultur

1. Werfen Sie einen Collagen Gel mit Fibroblasten Encapsulated, in einer Zellkultur-Einsatz (6-Well-Platte-Format).
   1. Aliquotieren 10 ml Rattenschwanz Kollagen Typ I zu einem kalten Becher.
   2. 1 ml kaltem DMEM. Mit 0,5 ml 1 M NaOH, die die saure Kollagen zu neutralisieren. In 0,5 ml Fibroblasten-Suspension (mit 1.200.000 Fibroblasten).
   3. Die Lösung wird in einer kalten Pipette auf die Zellkultur-Inserts innerhalb einer 6-Well-Platte. 12 ml Gesamtlösung wird gleichmäßig aufgeteilt in 6-Zellen-Kultureinsätze.
   4. Inkubieren des Gels in einem 37 ° C Inkubator bei 5% CO ₂ für 1 Stunde.
   5. Nachdem das Gel erstarrt ist, überschwemmen das Gel in FM. Nach 24 Stunden, entsorgen Sie die alten Medien und ersetzen Sie sie durch frische Medien, hochmolekularen Crowders enthält. Fügen ein Volumen von 2 ml zu dem Inneren des Zellkultureinsatzes und 2 ml an der Außenseite des Zellkultureinsatzes.
2. Nach 24 StundenSeed Keratinozyten auf der Oberseite des Kollagen-Gel.
   1. Trypsinize Keratinozyten 0,125% Trypsin / Chelatbildner für 5 min bei 37 ° C verwendet wird. Tippen Sie Seiten von Kolben sanft Zellen zu entfernen und zu neutralisieren Trypsin mit Serum enthaltenden Medien. Zählen von Zellen und bereiten Keratinozyten-Suspension (300.000 Keratinozyten pro Gel und suspendiert in 200 ul Medien).
   2. Absaugen alten Medien von Zellkultur-Einsatz. Hinzufügen Keratinozyten auf der Oberseite des Gels.
   3. Inkubieren des Gels in einem 37 ° C Inkubator bei 5% CO ₂ für 1 Stunde.
   4. Nach Keratinozyten der Geloberfläche angebracht sind, unterzutauchen das Gel mit 2 ml KSFM oder CnT-57 an der Innenseite der Zellkultureinsatz und 2 ml FM an der Außenseite des Zellkultureinsatzes.
3. Nach 24 Stunden, entsorgen Sie die alten Medien und ersetzen Sie sie durch frische Medien, hochmolekularen Crowders enthält.
4. Nach 7 Tagen Submerskultur, heben die Kultur zu einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche.
   1. Übertragen Sie die Zellkultur-Insert auf eine Deep-Well-Platte. 10 ml Schichtungsmedium zur Außenseite des Zellkultureinsatzes. Halten Sie das Innere des Zellkultureinsatzes trocken.
5. Inkubieren Kulturen in einem 37 ° C Inkubator bei 5% CO ₂ und Medien ändern alle 3 Tage, für die nächsten 14 Tage.
   Hinweis: Nach 2 Wochen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die Hautäquivalents reif ist und geerntet werden kann (entweder schockgefroren oder Formalin fixiert).

7. Ernte und Charakterisierung von Organotypischen Haut Equivalents

1. Absaugen Schichtung Medien.
2. Mit einer Pinzette, übertragen die Kultureinsätze auf einem Papiertuch und abtupfen restlichen Medien aus dem Boden des Einsatzes.
3. Mit einem Skalpell geschnitten entlang des Innenumfangs des Kultureinsatzes.
4. Befestigen Sie die organ Haut Co-Kultur (zusammen mit der PET-Membran).
   1. Schnellfrost
      1. Übertragen Sie das Gel Konstrukt zu einem cryomold. Decken Sie das Innere des cryomold mit OktoberVerbindung. Legen Sie die cryomold in flüssigen Stickstoff für 10 Sekunden.
      2. Mit einer Pinzette entfernen Sie die gefrorenen cryomold aus dem flüssigen Stickstoff, in Alufolie wickeln und speichern Sie die gefrorenen Proben in einem -80 ° C Gefrierschrank.
      3. Abschnitt gefrorenen Proben mit einem Kryostaten, mit einer Schnittdicke von 7 um.
   2. Formalinfixierung
      1. Setzen Sie ein 'Biopsie Schwammkissen' in die 'Biopsie-Kassette ". Bringen Sie das Gel auf den Schwammkissen konstruieren. Legen Sie eine andere Schwammkissen sanft auf der Oberseite des Gel-Konstrukts. Schließen Sie die Kassette.
      2. Völlig überschwemmen die Kassette in 10% neutral gepuffertem Formalin für 48 Stunden bei Raumtemperatur. Nehmen Sie die Kassette und Formalin Abfall entsorgen.
      3. Einbetten der festen Probe in ein Wachsblock, indem zunächst mit einem Ethanol-Serie Dehydratisierung und dann nach und nach der Probe mit Wachs infiltriert. Abschnitt der Wachsblock mit einem Mikrotom.
5. Die Charakterisierung der Skin Equivalent
   1. Immunostaining
      1. Für gefrorene Abschnitte:
         1. Inkubieren Abschnitte in 10% Ziegenserum (verdünnt in 1x PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wash Abschnitte in 1x PBS die Ziegenserum zu entfernen.
         2. Inkubieren Abschnitte mit primärem Antikörper (1: 100-Verdünnung in 10% Ziegenserum) während 90 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie Abschnitte in 1x PBS, dreimal, 5 min pro Wasch.
         3. Inkubieren Abschnitte mit sekundärem Antikörper (1: 400-Verdünnung in 10% Ziegenserum) für 30 min bei Raumtemperatur in einem Behälter mit Aluminiumfolie bedeckt. Waschen Sie Abschnitte in 1x PBS, dreimal, 5 min pro Wasch.
         4. Einfassung gleitet, mit Medien Montage auf ein Deckglas. Abdeckung Proben mit Aluminiumfolie und über Nacht trocknen lassen.
         5. Bild ein konfokales Mikroskop mit einem 40x / 1,30 Öl-Objektiv verwendet wird.
      2. Für formalinfixiertem Paraffin eingebettete Schnitte:
         1. Dewax Abschnitte (und rehydratisieren) in Prozent von Ethanol zu Wasser abwärts (Xylol - 100% Ethanol- 90% Ethanol - 80% Ethanol - 70% Ethanol - Wasser). Voll versenken Proben in Lösungen. Jeder Entwachsungsschritts sollte 3 min.
         2. Inkubieren Abschnitte in 1% Wasserstoffperoxid für 30 min. Waschen Sie Abschnitte in 1x PBS für 5 min.
         3. Inkubieren Abschnitte in Citrat-Lösung (10 ml Citrat-Lösung wird in 90 ml Wasser gelöst) bei 120 ° C für 20 min. Erlauben gleitet über Nacht abkühlen, bei Raumtemperatur. Waschen Sie Abschnitte in 1x PBS, dreimal, 5 min pro Wasch.
         4. Inkubieren Abschnitte in 10% Ziegenserum (verdünnt in 1x PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wash Abschnitte in 1x PBS die Ziegenserum zu entfernen.
         5. Inkubieren Abschnitte mit primärem Antikörper (1: 100-Verdünnung in 10% Ziegenserum) während 90 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie Abschnitte in 1x PBS, dreimal, 10 min pro Wasch.
         6. Inkubieren Abschnitte mit HRP-markiertes Polymer (unverdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie Abschnitte mit 1x PBS, dreimal, 10 min pro Wasch.
         7. Um ein Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren 1 mlDAB Substrat (3,3'-Diaminobenzidin) mit 1 Tropfen Chromogen. Inkubieren Sie die Abschnitte mit dieser Lösung für 15 Sekunden - 5 min (braun color = positives Signal).
         8. Um die Reaktion zu stoppen, waschen Sie die Abschnitte in fließendem Wasser.
         9. Gegenfärbung mit Hämatoxylin Kerne, für 5 min. Spülen Sie Abschnitte in fließendem Wasser.
         10. Inkubieren Abschnitte in saurem Alkohol-Lösung für 1 min. Spülen Sie Abschnitte in fließendem Wasser.
         11. Inkubieren Abschnitte in Scotts Leitungswasser-Lösung, 2 min. Spülen Sie Abschnitte in fließendem Wasser.
         12. Optional: Inkubieren Abschnitte in Eosin für 1 min und waschen in fließendem Wasser.
         13. Entwässern Abschnitte in aufsteigender Anteile von Ethanol zu Xylol (70% Ethanol - 80% Ethanol - 90% Ethanol - 100% Ethanol - Xylol). Stellen Sie sicher, dass die Proben sind vollständig für 3 min pro Stufe getaucht.
         14. Einfassung gleitet, Eindeckmittel mit bis zu einem Deckglas. Air über Nacht trocknen.
         15. Bild ein konfokales Mikroskop mit einem 40x / 1,30 Öl-Objektiv verwendet wird.
   2. Transmissions-Elektronenmikroskopie (zur Visualisierung von Ankerfibrillen)
      1. Fix Proben in 2,5% Glutaraldehyd für 72 Stunden.
      2. Wash Proben in 1x PBS, dreimal, 10 min pro Wasch.
      3. In kleine Stücke schneiden (1 mm ^3). Postfix-Proben in 1% Osmiumtetroxid, pH 7,4, für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wash Proben in destilliertem Wasser.
         Achtung: Osmiumtetroxid ist giftig und giftig und sollte sorgfältig in einem Abzug gehandhabt werden.
      4. Entwässern Proben durch Serie eine aufsteigende Ethanol (25% Ethanol - 50% Ethanol - 75% Ethanol - 95% Ethanol - 100% Ethanol - Aceton) für 20 min pro Schritt.
      5. Infiltrieren durch Einweichen Proben in 100% Aceton: Araldite-Harz (1: 1) für 30 min bei Raumtemperatur und dann bei 1: 3 für 1 h, gefolgt von 1: 6 über Nacht. Einweichen Probe in frisch Araldite-Harz für 2 Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von einer zweiten Änderung von frischem Araldite-Harz für 1 Stunde bei 40 ° C. Lassen Sie das dritte frisch einraldite Harz Wechsel für 1 h bei 45 ° C und die vierte frische araldite Harz Wechsel bei 50 ° C für 1 Stunde verlassen.
      6. Inkubieren Proben bei 60 ° C für 24 h die Polymerisation zu ermöglichen.
      7. Abschnitt Proben eine Glasmesser zu erhalten, Semidünnschnitte mit einer Dicke von 1 um. Stain Abschnitt mit Methylenblau zu beobachten, Histologie. Abschnitt der Probe ultradünnen Abschnitte von 70 nm zu erhalten und jeden Abschnitt auf ein Kupfernetz zu sammeln.
      8. Fleckenabschnitte mit 5% Uranylacetat-Lösung für 15 min, gefolgt von 3% Bleicitrat Lösung für 10 min.
      9. Erwerb von Bildern mit einem Transmissionselektronenmikroskop (100 kV), mit einer Vergrößerung von 30.000-.

Ergebnisse

Makromolekulare crowding konnte ECM Ablagerung zu verbessern, insbesondere Fibroblasten mehr Kollagen I abgeschieden, IV und Fibronectin im Vergleich zu Kulturen Kontrolle (Abbildung 1, Cell Schicht; 1A, Kollagen I; 1B, Kollagen IV, 1C, Fibronektin). Nach Dezellularisierung, war es offensichtlich , dass Fibroblasten die Haupt Einleger von Kollagen I waren, IV und Fibronectin im Vergleich zu Keratinozyten (Abbildu...

Diskussion

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks²⁰. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Wako	013-12061	Cell culture media additive
Cell culture inserts  (6-well format)	Greiner Bio-One	657610	Organotypic cultures
Citrate solution	Dako	S2369	DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)
Collagen (rat tail)	Corning	354236	Organotypic cultures
CnT-57	CELLnTEC	CnT-57	Cell culture media
DAB Substrate + chromogen kit	Dako	K3468	Histology
Deep-well plate (6-well format)	Corning	355467	Organotypic cultures
ECL detection reagent	GE Healthcare Life Sciences	RPN2106	Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent
Electron microscope (TEM)	JEOL	JEM-1010 (100kV)	Transmission electron microscopy
Fibroblast media (FM)			High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin
Ficoll PM70	GE Healthcare Life Sciences	17-0310-05	Macromolecular crowder
Ficoll PM400	GE Healthcare Life Sciences	17-0300-05	Macromolecular crowder
Keratinocyte serum-free media (KSFM)	Life Technologies	17005-042	Cell culture media
Lysis buffer	ThermoFisher Scientific	89900	Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer.
Microscope	Zeiss	LSM510	Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).
Mounting media (Hydromount)	National Diagnostics	HS-106	Fluorescent staining
Mounting media (Cytoseal)	ThermoFisher Scientific	8310-16	Histology (HRP)
OCT compound (Tissue Tek)	Sakura	4583	Embedding for cryotomy
Penicillin-streptomycin antibiotics	Sigma Aldrich	A5955	Cell culture media additive
Primary antibodies
Anti-Collagen I antibody	Abcam	#ab6308
Anti-Collagen Type IV	Novocastra	#NCL-COLL-IV
Anti-collagen VII			LH7.2 (in house)
Anti-Fibronectin antibody	Abcam	#ab2413
Reducing agent	ThermoFisher Scientific	NP0009	Western blot
Sample buffer	ThermoFisher Scientific	NP0008	Western blot
Secondary antibodies (Immunostaining)
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma Aldrich	#D9542
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit	ThermoFisher Scientific	#A-11037
AlexaFluor 594 goat-anti-mouse	ThermoFisher Scientific	#A-11005
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit	ThermoFisher Scientific	#A-21441
AlexaFluor 488 goat-anti-mouse	ThermoFisher Scientific	#A-11001
Secondary antibodies (HRP)	Dako	Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse	undiluted
Sodium deoxycholate	Prodotti Chimicie Alimentari		Decellularization
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Ham’s F12			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
10% fetal bovine serum			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
0.4 mg/ml hydrocortisone			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml insulin			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
1.8·10-4 M adenine			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml transferrin			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
2·10- 11 M triiodothyronine			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Trypsin	Biopolis Shared Facilities	0.125% Trypsin/Versene   pH 7.0 + 0.3	Used to trypsinize cells