Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

Zusammenfassung

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Zusammenfassung

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Einleitung

In Transkriptions Studien an der Gewebeebene getan werden die Transkriptom von hoch spezialisierten, aber seltene Zelltypen durch die reichlicher umgebenden Zellen oft maskiert. Ein Beispiel für eine solche hochspezialisierte Zelltypen sind die Zellen der weiblichen Fortpflanzungs lineage (Keimbahn) in Pflanzen. Die weibliche Keimbahn ist in der Entwicklung Ovula angegeben, die Vorläufer von Samen im Inneren der gynoecium der Blume ^1,2. Der Megasporenmutterzelle (MMC) ist die erste Zelle des weiblichen Keimbahn. Es erfährt Meiose ein tetrad reduzierter Megasporen zu bilden. Typischerweise überlebt nur eine dieser Megasporen und teilt sich mitotisch ohne Zytokinese, dh in einem Syncytium. Diese Mitosen werden von Zellularisierung folgte der reifen gametophyte zu bilden, die in der Regel besteht aus vier Zelltypen: drei antipodals, zwei synergid Zellen, das Ei und die zentrale Zelle. Das Ei und Zentralzellen sind die weiblichen Gameten, die von zwei Samenzellen während dou befruchtetble Fertilisation die zu den Embryo und Endosperm des entwickelnden Samen ^1,2 zu ergeben. Im sexuellen Modellsystem Arabidopsis thaliana, nur ~ 50 Samen pro Blüte entwickeln , während etwa 50 bis 80 Samen pro Blume in der nahe verwandten Gattung Boechera entwickeln. Somit besteht die weiblichen Keimbahn von nur wenigen hochspezialisierte Zelltypen, ist es ein ausgezeichnetes Modell macht Entwicklungsprozesse, wie Zell Beschreibung und Differenzierung zu studieren.

Darüber hinaus Einblicke in die Gen-regulatorischen Prozesse Pflanzenreproduktion regeln kann der angewandten Wert sein. In Pflanzen können sowohl sexuelle und asexuelle Vermehrung durch Samen (Apomixis) auftreten. Während der sexuellen Reproduktion genetische Vielfalt in einer Population erzeugt, Apomixis führt zur Bildung von klonale Nachkommenschaft, die genetisch identisch mit der Mutterpflanze ist. Daher hat apomixis ein großes Potenzial für Anwendungen in der Landwirtschaft und der Saatgutproduktion, als auch komplexe mütterliche Genotypen^3,4,5 beibehalten unverändert über mehrere Generationen werden. Da apomixis natürlich nicht in allen wichtigen Kulturarten auftreten, ist das Engineering von Apomixis in Kulturen von großem Interesse ^3,4,5. Doch dieses langfristige Ziel ist schwer zu erreichen , da die zugrunde liegenden genetischen und molekularen Grundlagen von apomixis nicht ausreichend detailliert ⁶ verstanden wird.

Um einen Einblick in die Transkriptions Basis gewinnen regeln apomictic Reproduktion, zelltypspezifischen Transkriptionsprofilierung mit lasergestützten Mikrodissektion (LAM) und Next Generation Sequencing (NGS) stellt einen sehr leistungsfähigen Ansatz ^7,8. LAM hat zunächst für Tier und der biomedizinischen Forschung etabliert. In den letzten Jahren hat LAM auch auf Pflanzenbiologie ^6,9,10 angewendet. Im Gegensatz zu anderen Verfahren ermöglicht Profilierung einzelner Zell- und Gewebetypen, LAM erfordert nicht die Erzeugung von Markierungslinien ^6,9,10. Daher kann es sein, applog auf eine beliebige Zelle oder Gewebetyp ohne vorherige molekulare Wissen. Ein weiterer Vorteil der LAM ist, dass es kann so lange in jedem Zelltyp angewendet werden, wie die Zelle kann in Trockenabschnitten basierend auf Position und / oder Strukturmerkmale erkannt werden. LAM hat den zusätzlichen Vorteil, dass fixierten Geweben verwendet werden, die bei der Verarbeitung Veränderungen des Transkriptionsprofils verhindert.

Das Gewebe von Interesse, beispielsweise Blütengewebe wird in einem nicht vernetzenden Fixiermittel fixiert , bevor sie in Paraffin eingebettet wird . Einbettung in Paraffinwachs kann manuell durchgeführt werden, nach etablierten Protokollen ^9,11. Jedoch führt die Verwendung eines automatischen Gewebeprozessor zur Dehydratisierung und Infiltration mit dem Wachs in der Regel höhere Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Erhaltung der RNA-Qualität und Gewebemorphologie. Die alternative Strategie von Geweben in Harz einzubetten wurde auch für Zelltyp-spezifischen Analysen von LAM ⁸ erfolgreich verwendet. Jedoch ist die Verwendung eines automated Gewebeprozessor in Wachs zur Einbettung ist sehr zeitsparend, da viele Proben einmal verarbeitet werden können, auf ein Minimum von hands-on Zeit erfordern. Während typischerweise während der Fixierung und Einbettung keinen signifikanten Verlust an RNA-Qualität erfolgt, bleibt die Herstellung von Dünnschnitten mit dem Mikrotom und insbesondere auf den Frameslides die Halterung für LAM verwendet ein kritischer Schritt für die Konservierung von RNA-Qualität. Dies wurde zuvor festgestellt , und die Verwendung eines Bandübertragungssystem hat bei diesem Schritt in einer besseren Qualität RNA resultieren ¹² beschrieben. Dies jedoch fügt einen zusätzlichen zeitaufwendigen Schritt bei der Herstellung der Folien und erfordert auch spezielle Ausrüstung. Das optimierte Protokoll unter reproduzierbar beschrieben produziert RNA , die für die Transkriptionsprofilierung mit Genchips und Next Generation Sequencing (NGS) nähert sich ^7,11,13,14 von ausreichender Qualität ist. Darüber hinaus verwendet, um mit dem Laser Mikrodissektion Mikroskop, eine hohe Reinheit der isolierten Zelltypen ist routinely produziert ^7,11,13,14.

Die Gattung Boechera ist ein ausgezeichnetes Modellsystem für die wichtigsten Schritte von apomictic Wiedergabe zu studieren. In Boechera, eine Vielzahl unterschiedlicher sexueller und apomictic Beitritte wurden identifiziert und können für Vergleichsanalysen verwendet werden ^15,16,17. In einem Vergleich von zelltypspezifischen Transkriptomen von Zellen aus der weiblichen Keimbahn von sexuellen Arabidopsis und apomictic Boechera identifizierten wir Gene und Wege , die differentiell exprimiert werden, um dadurch neue Aspekte der regulatorischen Prozesse identifizieren Apomixis ⁷ regelt. Darüber hinaus überprüft diese Studie die Eignung von LAM für zelltypspezifischen Transkriptionsanalysen von kleinen und seltenen Zelltypen. Wir haben bereits dieses Protokoll für die Analyse verschiedener Zelltypen in einer Vielzahl von Pflanzenarten verwendet, aber arten und gewebespezifische Modifikationen am Protokoll kann in bestimmten Fällen erforderlich sein.

Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt Gewebepräparation, laserunterstützten Mikrodissektion und RNA-Extraktion für die Transkriptionsprofilierung. Verwenden Sie immer Handschuhe bei allen Schritten des Protokolls. Studieren und beachten Sie die Sicherheitshinweise für jede Chemikalie verwendet. Insbesondere beachten Sie, dass Xylol schädlich ist, und kann Handschuhe durchdringen und das Methanol ist giftig. Für alle Instrumente verwendet werden, beziehen Sie sich bitte auf Bedienungsanleitungen entsprechend.

1. Entfernung von RNAse Aktivität von Glaswaren und andere Ausrüstung

1. Vor dem Gebrauch verpacken, Glaswaren mit Aluminiumfolie vor bei 180 ° C für ca. 8 Stunden Backen RNAse freie Qualität zu gewährleisten.
2. Behandeln Sie alle Metalloberflächen (zB Pinzette) sowie die Werkbank und die Heizplatte mit einer geeigneten RNAse Dekontaminationslösung. Danach waschen Sie die Oberflächen mit RNAse-freiem Wasser, um die Dekontaminationslösung zu entfernen. Anschließend reinigen Sie die Oberflächen weiter mit 70% EtOH.
3. Verwenden Sie alle Plastic Verbrauchsmaterialien (zB Rohre) brandneue ohne Vorbehandlung. Falls vorhanden, verwenden Kunststoffzusätze, die frei werden, sind zertifiziert RNAse.

2. Gewebefixierung

1. Bereiten Sie 10 ml Bauern Fixiermittel (3: 1; v / v Ethanol: Essigsäure) in einem frischen 15-ml-Röhrchen auf Eis. (Immer frische Bauern Fixiermittel vor dem Gebrauch vorbereiten). Als Alternative kann der nicht vernetzenden Fixiermittel Ethanol: Essigsäure (5: 1; v / v) ¹⁸ kann verwendet werden.
2. Verwenden Sie eine feine Pinzette Knospen in der Entwicklungsphase von Interesse zu sammeln. Unmittelbar versenken Knospen in der eiskalten Fixiermittel. Verwenden Sie 10 ml Fixiermittel zur Fixierung von ~ 20 Knospen oder Blüten von Arabidopsis oder Boechera . Hinweis: Bei der Anlage mit Arten mit größeren Blüten empfiehlt es sich , die Blumen mit einer Rasierklinge zu sezieren kleinere Stücke Fixierung vor zu erzeugen.
   1. Um reifen gametophytes zu erhalten, entmannen die 2 - 3 größten Blütenknospen des inflorescence 2 Tage vor der Ernte.
3. Füllen Sie den Boden von einem Exsikkator mit Eis. Öffnen Sie die Röhrchen , die die Proben enthalten, zB Blumen, und legen Sie sie auf Eis, entweder , indem sie direkt in das Eis in einer Art und Weise setzen , dass sie nicht umfallen kann oder durch einen geeigneten Halter verwenden. Vakuum-infiltrieren für 15 min vor der Vakuum zu lösen.
   1. Wiederholen Sie die Vakuuminfiltration einmal für 15 min.
4. Lassen Sie die Vakuum und speichern über Nacht (~ 12 Stunden) auf Eis. Decken Sie den Eisbehälter mit einem Deckel oder Alufolie und lagern Sie den Eimer in einem 4 ° C Raum oder Kühlschrank, um das Eis von dem Auftauen zu verhindern. Hinweis: Eine Verlängerung der Fixierungszeit wird nicht empfohlen.

3. Gewebeeinbettung, Dünnschnitt und Montage auf Folien für LAM

1. Gewebeeinbettung.
   1. Tauschen Sie die Fixiermittel zu 70% Ethanol hergestellt mit reinem Ethanol und RNAse freies Wasser. Lassen Sie die Proben auf Eis bis zur Weiterverarbeitung. Starten Sie embedding der Proben am selben Tag. Falls keine Gewebeverarbeitungsmaschine zur Verfügung steht, auf manuelle Einbettung gehen Sie wie an anderer Stelle beschrieben ^9,11 und weiter mit Schritt 3.1.11.
   2. übertragen Sie vorsichtig die Proben Gewebe Einbettkassetten mit einer Pinzette. Ziehen Sie die Kassetten schließen. Kritischste Schritt: Vermeiden Sie auch teilweise Trocknung der Probe während dieses Schrittes. Vermeiden von Proben mit der Pinzette quetschen.
      Hinweis: Um die Kassetten beschriften ein Bleistift verwendet werden soll, idealerweise durch auf der geneigten Fläche der Kassette zu schreiben.
   3. Bewahren Sie die Einbettungskassette geladen mit den Knospen oder Blüten in 70% Ethanol, bis das gesamte Material auf Kassetten übertragen wird und die Einbettung Maschine geladen werden kann. Zu diesem Zweck verwenden, um eine Wanne Glasfärbung mit 70% Ethanol gefüllt.
   4. Nehmen Sie den Korb des Gewebeprozessors aus der Retorte der Maschine und übertragen Sie die Einbettkassetten in den Korb mit den geneigten Flächen der Oberseite nach und in die gleiche Richtung. CRITICAL STEP: Führen Sie diese schnell das Austrocknen des Gewebes zu verhindern. Wenn die Verarbeitung viele Einbettkassetten auf einmal, stellen Sie den Korb in einen geeigneten RNAse freien Behälter mit 70% Ethanol gefüllt, bevor die Proben geladen werden.
   5. Setzen Sie den Deckel auf den Korb und stellte den Korb wieder in die Retorte. Schließen Sie die Retorte.
      Hinweis: Der Gewebeprozessor dehydriert automatisch die Proben, ändert sich das Lösungsmittel Xylol, und macht die Infiltration mit geschmolzenem Paraffinwachs. Typischerweise wird dies über Nacht geschehen.
   6. Startet das Programm des Gewebeprozessors. Empfohlenen Standardeinstellungen sind 1 h 70% EtOH, dreimal 1 Stunde 90% EtOH, dreimal 1 Stunde 100% EtOH, zweimal 1 h 100% Xylol, einmal 1 h 15 min 100% Xylol bei Raumtemperatur, gefolgt von Infiltration mit Paraffinwachs zweimal für 1 Stunde und einmal 3 h bei 56 ° C ^11.
      Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Sperrstation mit dem Wachs bereit ist geschmolzen, schalten Sie das Gerät mehrere Stunden vor dem Start oderDie Timerfunktion verwenden die ungefähre Startzeit zu wählen.
      Hinweis: Im Falle kann das Gewebe nicht direkt danach verarbeitet werden, längere Inkubationszeiten in Paraffinwachs bei 56 ° C sind möglich, anstelle der 3 Stunden bei 56 ° C. Beachten Sie die Bedienungsanleitung des Gerätes. Typischerweise wird die Kassetten mit Gewebe wird automatisch in geschmolzenem Wachs bleiben, bis die "leere Retorte" Befehl genehmigt. Wenn das Wachs nicht geschmolzen wird, wenn das Gewebe Prozessor gestartet wird, wird die Retorte mit 70% Ethanol gefüllt und das Programm bleibt in der Warteschleife, bis sie bereit zu starten.
   7. Leeren Sie die Retorte und sofort übertragen, die Proben zu einem Paraffinwachs-Bad bei 56 ° C in einer blockierenden Station. Entfernen Sie den Deckel vom Korb und decken das Paraffinbad der Aufblockungsstation mit seinem Deckel.
   8. Stapel so viele frische Auswuchten Trays auf der Oberfläche des Blockierstation erwärmt auf 56 ° C, da Kassetten in dem Korb befinden.
      Hinweis: Eine Ethanol-resistente Permanentmarker nützlich sein können,d die Unterseite der Ausgleichs Tabletts zu etikettieren. Aceton-resistente Filzstiften sind nicht zu empfehlen.
   9. Mit Hilfe der Aufblockungsstation, füllen bei 56 ° C vorgewärmter Frisch Kunststoff Ausgleichsschale mit geschmolzenem Paraffinwachs. Heben Sie den Deckel des Paraffinbad, abholen eine Kassette nur zu einem Zeitpunkt, und übertragen Sie die Proben aus den Kassetten zu dem flüssigen Paraffin bei 56 ° C in der Ausgleichsplatte mit einer Pinzette.
      Kritischste Schritt: Vermeiden Sie jede Verhärtung des Wachses die Probe umgibt, während die Kassette Handhabung durch schnell arbeiten.
      1. Positionieren Sie alle Proben nach den Bedürfnissen einer Zubereitung Nadel vor der Wachs aushärtet. Typischerweise werden mehrere Blumen in einem Ausgleichswanne einzeln im Abstand von etwa 1 cm in jeder Richtung angeordnet sind.
      2. Wiederholen Sie Schritt 3.1.9, bis alle Proben übertragen werden.
   10. Platzieren Sie den Korb zurück zu dem Gewebeprozessor und reinigen Sie die Retorte einem entsprechenden Programm (siehe Bedienungsanleitung).
   11. Schalten Sie Gewebe-Prozessor und Aufblockungsstation. Fahren Sie mit Schritt 3.1.13.
   12. Falls keine Maschine Gewebeinfiltration und keine Einbettung Station zur Verfügung steht, verwenden Sie einen Heizofen Paraffinwachs bei 56 ° C zu schmelzen. Auf der Bank, füllen Sie das geschmolzene Wachs in Kunststoff-Balancing Tabletts, übertragen Sie die Proben an das Wachs und die Vorbereitung Nadeln verwenden, um die Proben zu positionieren.
   13. Ermöglichen das Paraffinwachs für ~ 1 bei Raumtemperatur zu härten - 3 Stunden, bevor die Proben bei 4 ° C lagern. Proben können anschließend frisch oder bis zu mehreren Monaten gelagert verarbeitet werden.
2. Herstellung von Dünnschnitten und Rutschen für LAM.
   1. Auf einem Leuchttisch von unten den Wachsblock Beleuchtung, entfernen Sie das Paraffinwachs mit den Proben aus den umliegenden Kunststoffschalen. Präparieren aus einem quadratischen Wachsblock das Gewebe enthält, z. B., eine Knospe oder Blüte, eine RNAse freien Rasierklinge. Zu diesem Zweck orientieren immer die Proben in Richtung der Oberseite der Wachsblock (siehe auch Abbildung 1).
      1. Bereiten Wachsblöcke aller Proben, die zu einem Zeitpunkt für LAM verwendet werden soll.
   2. Montieren Sie die Blöcke zu verarbeiten Kassetten gefüllt mit gehärteten Paraffinwachs Einbetten: schmelzen ein kleines Stück oder Tröpfchen von Paraffinwachs auf der Spitze eines geeigneten Spatel eine Ethanol-Lampe und verwenden Sie das heiße Wachs um den Block auf dem Träger zu fixieren (mit den eingebetteten Gewebe oben drauf).
      1. Lassen Sie das Wachs mindestens 20 min bei 4 ° C zu härten.
   3. Überschüssiges Wachs der Probe mit einer Rasierklinge auf dem Lichttisch umgibt. Achten Sie auf eine quadratische Fläche mit parallelen Kanten zu halten (siehe Abbildung 1).
   4. Stellen Sie die Heizplatte auf 42 ° C.
   5. Sicher montieren Sie die Proben an das Mikrotom und bereiten 6 bis 10 & mgr; m dicke Abschnitte. Wenden Sie sich an die Anweisungen des Herstellers für das Mikrotom mit. Hinweis: Während dünneren Abschnitten oft bessere strukturelle Auflösung geben, größere Menge an RNA von higher Qualität können mit dickeren Abschnitten erhalten werden. Für die Zellen von Boechera gametophytes reifen verwenden wir 7 um als Standard. Umzug eher langsam mit den Proben über die Mikrotommessers führt oft zu besseren Histologie.
   6. Immer übertragen die Paraffin Bänder mit einer Länge von etwa 10 bis 15 cm in eine Plastikbox mit einem schwarzen Karton am Boden vor ihnen in LAM Folien positionieren.
   7. Wenn möglich, eine Vorauswahl der Teile der Paraffinstreifen die zell- oder Gewebearten von Interesse enthält, zum Beispiel Ovula, unter einem Sezieren-Umfang und den Rest verwerfen.
3. Die Herstellung der Folien für LAM.
   1. Legen Sie die erforderliche Menge an Metall-gerahmte Dias (in der Regel von 5 bis 10) mit der flachen Oberfläche auf der Oberseite auf der Heizplatte.
   2. Pipettieren ~ 1 bis 2 ml RNAse freies Wasser auf dem Kunststoffteil der Folie. Unter Verwendung einer Rasierklinge geschnitten, um die Paraffin Bänder in kurzen Stücken von etwa 4 bis 5 cm lang genug, um die Kunststofffenster zu überspannen. USE Pinzette und eine Zubereitung Nadel idealerweise die Paraffinstreifen miteinander auf den Kunststoff-Fenster der Folien parallel zu schalten. Heben Sie vorsichtig die Folie an einem Ende das Wasser zu entfernen und wieder die Dias platzieren.
      1. Alternativ legen Sie die Heizplatte unter einer chemischen Abzugshaube. Eine kleine Menge Methanol zu dem Kunststoffteil des Schiebers gerade ausreicht, um die Oberfläche zu benetzen (dies kann eine leichte Wellung der Folien verursachen). Legen Sie die Paraffinstreifen auf den Folien.
         Hinweis: Aus Gründen der Toxizität vermeiden Verwendung von Methanol, wenn möglich. Allerdings ist die Verwendung von Methanol bei diesem Schritt die RNA-Qualität im Fall verbessern die Qualität durch die Montage auf dem Wasser erreicht ist nicht ausreichend. Es lohnt sich, diese Alternativen zu Beginn eines neuen Projekts zu testen, da die RNA-Qualität mit Zelltyp und untersuchten Art erreicht variiert.
   3. Trocknen Sie die Folien über Nacht auf der Heizplatte bei 42 ° C für ca. 12 Stunden. Decken Sie die Heizplatte mitein Kunststoffdeckel, der nicht die Folien nicht berührt. Stellen Sie sicher, dass der Kunststoffdeckel nicht den Austausch von Luft nicht verhindert. Um dies den Deckel zielen auf pipettieren Kästen oder Ähnliches platziert werden angehoben werden.
      1. Alternativ verringern die Trocknungszeit auf ein Minimum von zwei Stunden oder bis das Gewebe erscheint völlig trocken. Die Reduzierung der Zeit von Slicing die Sammlung kann RNA-Qualität zu verbessern.
   4. Unter einer chemischen Haube, de-Wachs die Dias 2 mal für 10 Minuten in Xylol unter Verwendung von geeigneten Trägerhalter. Achten Sie darauf, vollständig zu den Plastikteil jeder Folie versenken nur, aber die Entfernung des Schiebers zu ermöglichen, durch das breitere Ende des Metallrahmens berührt, die trocken gehalten wird.
   5. Lassen Sie die Folien für ~ 10 min unter der chemischen Haube vor LAM zu trocknen.
      Hinweis: Folien sofort können nicht verarbeitet zurück auf der Heizplatte bei 42 ° C mit dem Gewebe für bis zu ein paar Stunden nach oben gelegt werden. Dies wird jegliche Feuchtigkeit aus zu beeinträchtigen RNA-Qualität bis zur weiteren Verarbeitung zu verhindern.

4. Lasergestützte Mikrodissektion (LAM)

Hinweis: Das Verfahren für die LAM mit dem Instrument verwendet variieren. Bestimmte Details dieses Protokoll zu einem bestimmten Instrument angepasst und die Technologie der Proben auf einer Kappe unter Ausnutzung elektrostatischer Kräfte zu sammeln. Darüber hinaus kann variieren Details sogar zwischen verschiedenen Versionen der Software. Bitte beachten Sie den Anweisungen des Herstellers und Benutzerhandbücher für eine detaillierte Beschreibung und die spezifischen Anweisungen zum Gerät und Software.

1. Schalten Sie die Geräte für LAM (Computer, Mikroskop, Laser-Steuerkasten).
2. Starten Sie das Programm die Steuerung des Mikroskop und Laser.
3. Schalten Sie den Laser durch Drücken der entsprechenden Taste auf dem Steuerkasten.
4. Legen Sie eine Kappe (0,5 ml, ohne Diffusor) in den Deckelhalter und positionieren Sie es in das Gerät ein.
5. Unterstützung bei der LAM Schlitten mit einem Glasobjektträger für die Mikroskopie. Stellen Sie sicher, dass die flache Oberfläche des Trägers mit derGewebe angebracht steht vor der Glasträger.
6. Legen Sie die Folie in das Gerät mit dem Glasträger darunter.
7. Wählen Sie das 4X Ziel. In dem Programm, wählen Sie die Kappe in die Position "oben" zu bewegen, und gehen Sie einen Scan des Schlittens zu machen.
8. Suchen Sie in der Folie und zu identifizieren, die Strukturen von Interesse. Pinpoint und speichern ihre Positionen auf der Folie der Lage sein, um wieder auf die genaue Position für den Schneidschritt bewegen.
9. Wählen Sie das entsprechende Ziel (zB 40X oder 60X).
10. Bei Bedarf justieren Laser Geschwindigkeit, Fokus und Laserleistung, und auch die Bühne Bewegung kalibrieren Sie in der Bedienungsanleitung des Gerätes durch Bezugnahme. Sobald ein Konto für das spezifische Gewebe von Interesse eingerichtet ist, können die Einstellungen wieder verwendet werden.
11. Überprüfen Sie die Laserposition durch einen einzigen Schuss durch den "Laser Shot" Taste des Programms drücken, idealerweise in einem Teil der Membran ohne Gewebe.
    1. Bei Bedarf kalibrieren der Laserposition durch folgende the Anweisungen des Herstellers für das Gerät.
12. Überprüfen Sie die Kalibrierung des Objektivs durch eine offensichtliche Struktur zu allen vier Ecken des Software-Fensters auf dem Bildschirm zu bewegen, die rechte Maustaste gedrückt halten. Überprüfen Sie, ob die Position der Hand in Bezug auf die offensichtliche Struktur die gleiche in allen vier Ecken ist. kalibrieren Ansonsten die Ziele nach der Software-Handbuch.
13. Mit der Kappe in der 'down' Position, verwenden Sie die "Hand-Stift 'Werkzeug , um die Grenzen des Zelltyp oder Gewebe von Interesse zu markieren, zum Beispiel die Eizelle. Präparieren Sie die Zelle von Interesse mit dem Laser durch "Schnitt" drücken. Hinweis: Oft sectioning Bedarf wiederholt werden, wenn der Rahmen um die Zelle nicht vollständig auf einmal seziert wurde. In diesem Fall empfiehlt es sich, die Software automatisch als Standard zwei Wiederholungen des Abschnitts zu tun.
14. Heben Sie die Kappe und bewegen auf die nächste gespeicherte Position mit der Struktur von Interesse. Wiederholen Sie Schritt 4.13des Verfahrens die nächste Zelle Abschnitte, bis alle Zellen von Interesse von einer Folie zu sezieren gesammelt werden. Sicherstellen, dass die Kappe in einer Weise positioniert, dass der neue Abschnitt auf der Kappe auf eine leere Position klebt.
    Hinweis: Es wird empfohlen , zu isolieren , größere Stücke von Geweben (zB Teile der ganzen Blumen oder Teile davon) von jeder Folie nach der Isolierung einzelner Zellschnitte auf einem frischen Kappe. Diese können für RNA Qualitätskontrolle verwendet werden.
15. Entfernen Sie den Schlitten und fahren Sie mit der nächsten Folie durch die Schritte 4.4 Wiederholung - 4,9 und 4,13 bis 4,14.
16. Wiederholen Sie Schritt 4.15 und die damit verbundenen Schritte, bis die Zelltypen von Interesse von allen Folien wurden isoliert. Hinweis: Es wird empfohlen, nicht mehr zu ernten als ~ 4 - 5 h auf der gleichen Kappe.
17. Sichtprüfung nach LAM die Kappenoberfläche unspezifische Kontaminationen der Probe auszuschließen. Während die nicht seziert Gewebe mit der Folie geschützt sind, können Staub durch elektrostatische Haftung an der Oberfläche haften.
    1. To Kontrollieren Sie regelmäßig die Kappe, entfernen Sie aus dem Gerät die Folie. Setzen Sie den Deckelhalter in der 'down' Position und überprüfen Sie die Oberfläche mit dem 4X-Objektiven.
    2. Bei kleinen Stücken von Staub sichtbar sind, entfernen Sie sie mit einem kleinen (2 ul) Pipettenspitze. Alternativ montieren auf dem Gerät die Folie zurück, legen Sie die Kappe auf einen freien Teil des Schlittens (kein Gewebe) und vollständig die Kontamination mit dem Laser zu zerstören.
18. Close Kappen und die trockenen Abschnitte bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung einfrieren. Bei Bedarf können die Proben für bis zu mehrere Wochen gelagert werden. Jedoch wird bei diesem Schritt schnell verläuft empfohlen.

5. RNA-Isolierung und Qualitätskontrolle

Hinweis: Die RNA kann durch jedes Verfahren geeignet für kleine Mengen von RNA, isoliert werden. In diesem Protokoll die Verwendung eines RNA-Extraktions-Kit für kleine Mengen von RNA angegeben beschrieben. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.

1. Verwenden Sie die Röhrchen mit der Probe andie Kappe entweder direkt oder nach Entfernen von -80 ° C.
   1. Öffnen Sie die Rohre und pipettieren sorgfältig 11 & mgr; l Extraktionspuffer an der Wand eines jeden Rohres mit Filterspitzen. Ändern Sie Spitzen zwischen den Proben.
   2. Schließen Sie den Deckel und schütteln Sie den Extraktionspuffer nach unten auf die Kappe des Rohres.
   3. Die Röhrchen mit der Kappe nach unten in einem Heizofen vorgewärmt auf 42 ° C. Inkubieren für 30 Minuten nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Säulenvorbereitung und Sammeln des Extrakts an der Unterseite der Rohre.
   1. Wenn das Material von mehr als einer Kappe kombiniert in einer Probe werden muss, gehen Sie mit den Schritten 5.1.1 - 5.1.2 einzeln für jedes Rohr / Kappe.
   2. Danach bündeln die Extrakte für eine Probe in ein Röhrchen und messen die Menge von gepoolten Extrakt mit einer Pipette vor der Zugabe einer äquivalenten Menge von EtOH (siehe Herstellerangaben).
   3. Stellen Sie sicher, dass die Menge an EtOH hinzugefügt vor dem Beladen der Säule zu dem Volumen des vereinigten Extrakt gleich ist.
   4. Nach RNA Fällung mit EtOH, gehen schnell zum Laden der Säulen Anweisungen folgenden Hersteller. Weiter das Protokoll mit dem 100 · g Zentrifugationsschritt.
   5. Nachdem der Inhalt jedes Sammelrohr wurden durch die Säule geleitet wurde, führen Sie für 30 Sekunden eine 16.000 xg Zentrifugation Schritt der Durchfluss folgenden Anweisungen des Herstellers zu entfernen.
   6. Fahren Sie mit dem RNA-Extraktion und Reinigung Anweisungen des folgenden Herstellers.
   7. Nach dem Laden des Elutionspuffers auf die Säule ermöglicht die Säule für 1 min inkubiert. Weiter, um die Rohre in die Zentrifuge nach den Anweisungen in den Anweisungen des Herstellers zu laden. Hinweis: Eine zusätzliche Zentrifugationsschritt für 1 min bei 100 xg vor der Elution wie in dem Protokoll angegeben kann die Effizienz der Elution erhöhen.
3. Extrahieren von RNA aus dem controls (größere Gewebeschnitte) für die RNA-Qualitätskontrolle folgende Schritte 5.1 bis 5.2.7 dieses Protokolls.
4. Für die RNA-Qualitätskontrolle Last 1 ul unverdünntem Gesamt-RNA von jeder Kontrollprobe auf dem Bioanalyzer ein RNA Pico Chip folgenden Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
   Hinweis: Die extrahierte RNA kann für lineare Verstärkung und Transkriptom - Analyse verwendet werden unter Verwendung von Microarrays oder RNA-Seq ^7,11,13,14. Idealerweise sollte der Qualitätskontrolle eine RNA Integrity Number (RIN) zeigen , von mindestens 7. Eine Anzahl von Lieferanten stellen geeignete Kits für die Amplifikation werden geeignete Beispiele in ⁹ angegeben.

Ergebnisse

Probenvorbereitung und LAM sind in aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt

Eine Anzahl von aufeinanderfolgenden Schritte sind erforderlich RNA für die Transkriptionsanalyse von ausgewählten Zelltypen von LAM (Abbildung 1) herzustellen. Dies beginnt mit der Ernte der Blüten und sofortige Fixierung, um sicherzustellen, dass die RNA-Population nach der Ernte unverändert bleibt. Das Geweb...

Diskussion

Das Protokoll eignet sich für verschiedene Zell- und Gewebetypen

LAM mit Transkriptom kombiniert Analysen von Microarrays oder RNA-Seq ist ein wertvolles Werkzeug Einblicke in die spezifischen Muster der Gen - Aktivität zu gewinnen , Entwicklungs- oder physiologische Prozesse regulieren ^7-11,13,14. Jedoch ist die Eignung dieses Verfahren für jeden gegebenen Zelltyp kritisch abhängig von strukturellen Problemen. Die Zelle muss gut sichtbar und ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	1,009,861,000	absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Ambion Nuclease free water	life technologies	AM9932
ASP200 S	Leica	14048043624	tissue processor
black cardboard			can be purchased in special paper shops
DNA- and RNAse-free Frame Slides	Micro Dissect GmbH		1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
ethanol lamp
exsiccator	Sigma-Aldrich	Z354074-1EA	Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment
filter tips 10 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 1,000 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 20 µl	Axon Lab AG	AL60020	can be replaced by similar tips
filter tips 200 µl	Axon Lab AG	AL60200	can be replaced by similar tips
forceps precision	VWE	232-1221
glass slide holder	Huber & Co.AG	10.0540.01	Färbekästen nach Hellendahl
glass staining trough	Huber & Co.AG	10.0570.01	Färbekasten
Heated Paraffin Embedding Module Leica	Leica	Leica EG 1150 H	blocking station, similar devises are suitable
Heating and Drying Table	Medax	15501	other models and/or suppliers are suitable
ice bucket	VWR ice bucket with lid	10146-184	similar buckets equally suitable
light table	UVP An Analytical Jena Company	TW-26	white light transluminator
microscope slide	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
microtome blade	Thermo Scientific	FEAHS35	S35 microtome blade disposable
MMI Cell Cut Plus Instrument	MMI (Molecular Machines and Industries)
Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml	life technologies	AM12475
Paraplast X-TRA	Roth	X882.2	for histology
PicoPure RNA Isolation Kit	life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
plastic balancing trays	Semadeni AG	2513
plastic box	Semadeni AG	2971	Plastikdose PS
plastic lid for heating plate			homemade
preparation needle	VWR	631-7159
RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513
RNAse free microfuge tubes	life technologies	AM12400
RNAse ZAP Decontamination Solution	life technologies	AM9780
Semi-automated Rotary Microtome	Leica	RM2245	similar devices are equally suitable
Tissue Loc Histo Screen Cassettes	Thermo Scientific	C-1000_AQ	similar cassettes of other suppliers are suitable
Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl	MMI (Molecular Machines and Industries)	50204
Xylol (Isomere) ROTIPURAN	VWR	4436.2	min. 99%, p.a., ACS, ISO SP
process embedding cassettes	Leica	14039440000	Leica Jet Cassette I without lid
Universal Oven	Memmert	UF55	other models and/or suppliers are suitable