TAPE: ein biologisch abbaubares hämostatische Kleber Inspiriert von einer Ubiquitous Verbindung in Pflanzen für chirurgische Anwendung

Zusammenfassung

Wir beschreiben die einfachste Protokoll biologisch abbaubare medizinische Kleber herzustellen, die eine effektive hämostatische Fähigkeit hat. TAPE ist ein mit Wasser nicht mischbaren supramolekularen Aggregats, hergestellt durch Mischen von Gerbsäure, ein allgegenwärtiges Verbindung in Pflanzen gefunden und Poly (ethylen) glycol, ein 2,5-mal größer wasserbeständige Haftung im Vergleich mit handelsüblichen Fibrinkleber ergibt.

Zusammenfassung

Dieses Video beschreibt die einfachste Protokoll für biologisch abbaubare chirurgische Kleber vorbereitet, die eine effektive hämostatische Fähigkeit und eine größere wasserbeständige Haftfestigkeit als kommerzielle Gewebekleber hat. Medizinische Klebstoffe haben große Aufmerksamkeit als mögliche alternative Werkzeuge zu Nähten und Klammern angezogen aufgrund ihrer Bequemlichkeit in der Nutzung mit minimaler Invasivität. Obwohl es mehrere Protokolle für die Entwicklung von Gewebeklebern einschließlich kommerziell erhältlich wie Fibrinkleber und Cyanoacrylat-basierten Materialien, meist erfordern sie eine Reihe von chemischen Synthesen von organischen Molekülen, oder komplizierte Proteinreinigungsverfahren, bei Bio-driven Materialien (dh Fibrin - Kleber). Auch die Entwicklung von chirurgischen Leimen die eine hohe Haftungseigenschaften, während die biologische Abbaubarkeit beibehalten ist immer noch eine Herausforderung aufgrund von Schwierigkeiten bei guter Leistung in der feuchten Umgebung des Körpers zu erreichen. Wir stellen eine neue Methode ein vorzubereitenmedizinische Kleber, als TAPE bekannt, durch die gewichtsabhängige Trennung eines mit Wasser mischbaren nach einer physikalischen Mischung von einer Pflanze abgeleiteten, nassfesten Klebstoff Molekül gebildet supramolekulares Aggregat, Annic T A cid (TA), und ein wohlbekannter Biopolymers, Poly (ethylen) glycol (PEG). Mit unserem Ansatz, zeigt TAPE hohe Haftfestigkeit, die in Gegenwart von Wasser das 2,5-fache mehr als kommerzielle Fibrinkleber ist. Weiterhin TAPE ist in physiologischen Bedingungen biologisch abbaubar und kann als ein potenter hämostatische glue gegen Gewebeblutung verwendet werden. Wir erwarten, dass die weit verbreitete Verwendung von Klebeband in einer Vielzahl von medizinischen Einrichtungen und Arzneimittelverabreichungsanwendungen, wie Polymere für muco-Adhäsion, Wirkstoffdepots und anderen.

Einleitung

In einem letzten zehn Jahren wurden Anstrengungen unternommen aktuellen chirurgischen Nähten und Klammern zu ersetzen Wunden mit biologisch abbaubaren / bioresorbierbaren Klebstoffe aufgrund ihrer Bequemlichkeit in der Nutzung und geringe Gewebe Invasivität bei chirurgischen Behandlungen zu schließen. Im Handel erhältlichen Gewebekleber werden in vier Typen eingeteilt: (1) Derivate Cyanacrylat ^1, (2) Fibrin durch enzymatische Umwandlung von Fibrinogen gebildet Leime Polymeren zu Fibrin durch Thrombin ^2,3, (3) Protein-basierten Materialien, wie chemisch oder physikalisch vernetztem Albumin und / oder Gelatine ^4,5, und (4) synthetische Polymerbasis diejenigen ^6. Obwohl sie in vielen klinischen Anwendungen verwendet wurden, sind alle Klebstoffe haben ihre eigenen intrinsischen Nachteile und Nachteile auf, die Hindernisse für ihre weit verbreitete Verwendung sein kann. Cyanacrylat-Basis Klebstoffe zeigen hohe Haftfestigkeit zu den Geweben, aber ihre toxische Nebenprodukte, wie beispielsweise Cyanacetat und Formaldehyd während des Abbaus gebildet werden, oft Zeichen verursachenificant Grad von Entzündungsreaktionen ^7. Fibrinkleber und Albumin oder Gelatine-basierte Materialien haben Sicherheitsprobleme in Bezug auf die Übertragung von Infektions Komponenten wie Viren aus tierischen Quellen: humanem Blutplasma für Fibrinkleber und Tieren , einschließlich Vieh, Geflügel, Schweine und Fisch für Gelatine basierenden Klebern ^8. Obwohl einige synthetische polymerbasierte Klebstoffe durch die Federal Drug Administration (FDA) genehmigt worden ist , hergestellt meisten Klebstoffe aus synthetischen Polymeren weiterhin Schwierigkeiten bei der Minimierung der Herstellungsprozessschritte zu haben und Biokompatibilität zu erreichen ^9. Am wichtigsten ist , leiden alle Klebstoffe aus schlechten mechanischen und Haftfestigkeit an feuchten Tüchern ^10. Vor kurzem von marinen Muscheln inspiriert Klebstoffe biomimetische Gewebe ^11-13, Geckos ^14, gecko mit Muschel ¹⁵ und endoparasitärer ¹⁶ Würmer haben als viel versprechende Alternativen zu aktuellen medizinischen Klebstoffe aufgrund ihrer einstellbaren mechanischen worden Schwellen- undKlebeeigenschaften mit Biokompatibilität. Doch bis heute gibt es immer noch Probleme angegangen werden , bevor sie kommerzielle Produkte ¹⁷ geworden.

Hier berichten wir über eine völlig neue Art der medizinischen Kleber TAPE genannt, die durch die intermolekulare Wasserstoffbindung zwischen einer Pflanze abgeleitetes Adhäsionsmolekül, Gerbsäure (TA) und einem bio-inerten Polymer Poly (ethylenglykol) (PEG) hergestellt wird, wie der Name schon sagt. TA ist eine repräsentative Gallotannine ubiquitär während des Sekundärmetabolismus von Pflanzen gefunden. Es wurde viel Aufmerksamkeit aufgrund seiner anti-oxidant, antimutagene und antikarzinogene Eigenschaften angezogen und wurde in supramolekularen Wechselwirkungen mit vielen Polymeren, wie Poly (N Isopropylacrylamid) (PNIPAM) und Poly (N teilnehmen gezeigt - Vinylpyrrolidon) (PVPON) zu bilden , Schicht- für -Schicht (LbL) -Folien ^18-20 und arzneimittelfreisetzende Mikrokapseln ^21-23. In dieser Studie, entdecken wir, dass TA als effizienter agieren könnenwasserbeständige Klebstoff funktionelle Einheit einen medizinischen Klebstoff, TAPE zu bilden. Durch einfaches Mischen mit TA, ein Nicht-Fouling-Polymer PEG wird zu einer supramolekularen Klebstoff mit 2,5-fach erhöhte Haftfestigkeit im Vergleich mit handelsüblichen Fibrinkleber und diese Haftung wurde während bis zu 20 Zyklen Anbringen und Abnehmen, auch in Gegenwart von Wasser gehalten . Die hämostatische Fähigkeit wurde auf einem Leberblutungen Modell in vivo getestet und zeigte eine gute hämostatische Fähigkeit innerhalb von wenigen Sekunden die Blutung zu stoppen. TAPE hat seine wichtige Bedeutung in einem verwandten Bereich als erste aus Pflanzen gewonnene Klebstoff, der neue Einblicke in die Lösung der Nachteile der derzeitigen Probleme mit bio-inspirierte Ansätze offenbaren. Wir erwarten, dass auch die weit verbreitete Verwendung von TAPE in einer Vielzahl von medizinischen und pharmazeutischen Anwendungen wie schleimig-Klebstoffe, arzneimittelfreisetzende Pflaster, Wundpflege Dressings und anderen aufgrund seiner einfachen Herstellungsverfahren, Skalierbarkeit abstimmbaren Bioabbaurate sowie sehr nass feste KlebsIonen-Eigenschaften.

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Protokoll

Alle Tierpflege und Experimente werden in Übereinstimmung mit dem ethischen Protokoll vom KAIST (Korea Advanced Institute of Science and Technology) IRB (Institutional Review Board) vorgesehen durchgeführt.

1. TAPE Formation

1. Für eine TA-Lösung vorbereitet, legen Sie ein 4 ml-Größe Glasfläschchen auf einem Magnetrührer, und 1 ml destilliertem Wasser mit einem Rührstab. 1 g Gerbsäure in das Fläschchen, und lösen sie im Wasser durch leichtes Rühren bei 200 Umdrehungen pro Minute für mehr als 1 Stunde. Wenn das TA vollständig gelöst, wird die Mischung transparent mit einer braunen Farbe.
2. Bereiten einer PEG-Lösung durch Zugabe von 1 g PEG-Pulver (4-Arme, 10 kDa und linear, 4,6 kDa) auf 1 ml destilliertem Wasser, gefolgt von Vermischen für einige Sekunden durch Vortexen eine weiße Aufschlämmung herzustellen. Halten dieser Aufschlämmung in den Inkubator bei 60 ° C für 10 min. bis der weiße wird man ganz klar.
   HINWEIS: Der Schmelzpunkt von PEG mit 10 kDa Molekulargewicht beträgt etwa 55- 60 ° C und die 4 kDa ist 53-58 ° C. Geschmolzener PEG wird mit Wasser mischbaren, so daß eine hohe Konzentration von PEG in Wasser bis zu 1 g / ml kann als klare Lösung erreicht werden. Sobald eine klare PEG-Lösung bei einer hohen Temperatur gebildet wird, ist die Lösung, immer noch stabil bei Raumtemperatur nach dem Abkühlen.
3. Hinzufügen 329 ul der PEG (4-Arme, 10 kDa) Lösung in Schritt von 1,2 bis 671 & mgr; l der TA-Lösung in Schritt 1.1 hergestellten (Im Fall eines linearen PEG mit 4,6 kDa, fügen 311 ul einer PEG-Lösung 689 ul einer Lösung, TA) in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Vorsichtig mischen die beiden viskos und honigartige Lösungen mit einem schmalen Spachtel sie homogen zu vermischen.
   ACHTUNG: Beide Lösungen sind ziemlich viskos, so muss der Wissenschaftler langsam , aber ausreichend hochziehen und die Lösungen mit einer Mikropipette übertragen.
4. Drehen um die Mischung in Schritt hergestellten 1,3 bei 12.300 × g für 3 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor ausgestattet.
5. sorgfältig remso viel von der Überstand wie möglich ove mit einer Mikropipette, und das Produkt zu sammeln, die sesshaft wurde: Dies ist der voll ausgebildet TAPE. Nach TAPE Bildung, sollte sie in den Kühlschrank (4 - 8 ° C) für bis zu mehreren Wochen . HINWEIS: TAPE können in chirurgischen Anwendungen vor der Verwendung durch Gammastrahlung oder Elektronenstrahlbehandlung sterilisiert werden.

2. Die Messung der Haftfestigkeit von TAPE

1. Bereiten Sie zwei Stücke von Schweinehautgewebe mit einem Durchmesser von 6 mm durch eine Biopsie Punch schneiden, nachdem alle Fett auf das Hautgewebe zu entfernen.
   HINWEIS: Die Schweinehautgewebe wurde von gesunden Schweinen Flanke Haut erhalten und wurde von einem lokalen Fleischmarkt befindet sich in Daejeon in Südkorea gekauft.
2. Anwenden kommerziellen Cyanacrylat Klebstoff auf die Außenseite jedes Gewebes, und befestigen das Gewebe an den Metallstab.
   HINWEIS: Der Metallstab als Zusatzhandgriff verwendet wird , so Geweben asind nicht direkt von der Maschine erfaßt. Dementsprechend kann es mit anderen Materialien nach der Konfiguration der Zugprüfmaschine ersetzt werden.
3. Einen Tropfen TAPE (ein Tropfen TAPE beträgt ca. 3 bis 6 mg) zu einer Seite des Gewebes. Dann verteilt das Band gleichmäßig ein anderes Gewebe zwischen den beiden Geweben an ihren Innenseiten mit Hilfe so sie gebunden sind , wie in 2A gezeigt.
4. Dann manuell befestigen und die beiden Seiten der Gewebe mehrmals lösen homogen zu vermischen und die Schnittstelle zwischen jedem Gewebe und TAPE maximieren.
5. Mit der UTM, sorgfältig Griff auf jeder Seite der Stange. Die Haftfestigkeit wird durch den mit Klebeband angebracht zu lösen zwei Gewebe benötigt Kraft bestimmt werden. Zuerst wird eine Kraft von 20 N für 1 min anzuwenden. Als nächstes wird mit der Maschine mit einer Geschwindigkeit von 1 mm / min jede Stange in einer entgegengesetzten Richtung zu ziehen. bis die Gewebe vollständig abgelöst.
   HINWEIS: Die Daten werden als Kraft-Weg (FD) Kurve , die durch die Bewegung erkannt gegeben werdenjeder Stange.
6. Berechnen der Haftfestigkeit des Bandes durch die maximale Kraft Dividieren (kN) auf der Kurve FD in Schritt 2.5 von der Probenoberfläche erreicht , gezeigt, das heißt, 3,14 x (0,003 m) ^2.
7. Zur Überwachung der Haftfestigkeit in Gegenwart von Wasser, fügen Sie 20 ul Wasser auf dem abgelösten Bereich zwischen zwei Geweben, und sie sofort befestigen. Mit der Maschine, führen wieder die Ablösung Test.

3. In - vitro - Abbautest

1. Schneiden Sie eine Kappe (d = 8 mm) von Mikrozentrifugenröhrchen und wiegen die Kappe als W _c zu definieren.
2. Füllen Sie die Kappe mit 150 mg TAPE, und wiegen alle wieder zusammen , es zu setzen als Gesamtausgangsgewicht W _0.
   ACHTUNG: Legen Sie nicht zu TAPE in der Kappe. Die Höhe der Band sollte niedriger sein als die Oberseite der Kappe, da es sich um eine physikalische Barriere zu einem Strom von PBS-Puffer durch den Rührvorgang während der Inkubation in Schritt 3.4 generiert werden kann.
3. Setzen Sie die Kappe ⁽² 75 cm) TAPE in eine Zellkulturflasche enthält, und 50 ml PBS - Puffer hinzufügen (1x, pH 7,4) in die Zellkulturflasche , so dass die Band in der Kappe ist vollständig eingetaucht in dem PBS - Puffer, wie in 3A gezeigt (n = 5).
4. Inkubieren der Zellkulturflasche, hergestellt in Schritt 3.3 in einem Orbital Schüttelinkubator bei 37 ° C, ähnlich wie bei physiologischen Bedingungen, unter leichtem Rühren (50 rpm).
   ACHTUNG: Halten Sie die Rührbedingungen bei 50 Umdrehungen pro Minute. Höhere Drehzahl könnte einen Zusammenbruch von TAPE verursachen.
5. Zu jedem Zeitpunkt, nehmen Sie die Kappe mit Band aus der Zellkulturflasche, und sie dann trocknen durch Stickstoffgas bläst. Wiegen Sie die Kappe auf dem Band verbleibende enthält. Stellen Sie das Gewicht zu jedem Zeitpunkt zu W _t. Ersetzen Sie den frisch wieder PBS, und schütteln Sie sie wieder nach W _t zu jedem Zeitpunkt zu messen.
6. Berechnen Sie die relativen Restgewicht (%) die folgende Gleichung.
   Relative Restgewicht (%) = (W _t - W _c) / (W ₀ - W _c) x 100%

4. hämostatische Fähigkeit von TAPE

HINWEIS: Alle Tierversuche sollten vom koreanischen Ministerium für Gesundheit und Soziales , die mit den Richtlinien und ethischen Protokoll gemäß durchgeführt werden.

1. Um die in vivo hämostatische Fähigkeit zu bewerten, die hemorrhaging Mauslebermodell überprüfen , wie in Lit. ²⁴ beschrieben.
2. Anesthetize fünfzehn Mäuse (normal ICR-Maus, 6 Wochen 30 - 35 g, männlich) mit einer intraperitoneale Injektion von Tiletamin-Zolazepam (33.333 mg / kg) und Xylazin (7,773 mg / kg) (n = 5 pro Gruppe). Ordnungsgemäße Betäubung zu bestätigen, kneifen die Pfote des Tieres sanft und beobachten Bewegungen wie die Pfote zurückzuziehen usw. Keine Bewegung gibt an, dass das Tier ausreichend narkotisierten ist eine Operation zu tun.
3. Bei Trockenheit von Tieraugen gelten Tierarzt Salbe die Augen ausreichend, während sie unter einem verhindernesthesia. Setzen Sie die Leber über eine Mittellinie Bauchschnitt, und stechen die Leber mit einer 18 G-Nadel Blutungen zu induzieren.
4. Entfernen Sie das fließende Blut mit steriler Gaze und legte 100 ul TAPE oder Fibrinkleber (positive Kontrolle) unmittelbar an der Blutungsstelle.
   HINWEIS: Keine weiteren Vernähen benötigt wird , um nach TAPE Anwendung aufgrund seiner hoch Blut feste Klebeeigenschaften auf Wundgewebe. Für die Negativkontrolle tritt keine Behandlung an der Stelle der Blutung.
5. In jedem Fall, setzen Sie ein Filterpapier mit bekannten Masse unterhalb der Leber das Blut von der Schadstelle zu sammeln. Ersetzen Sie das Papier durch eine frische alle 30 Sekunden für 4 - mal (dh., 2 min).
6. Messen Sie die Masse der absorbierten Blut auf jedem Filterpapier alle 30 Sekunden gesammelt. Nach dem Tierversuch opfern , um die Mäuse durch CO ₂ Ersticken Euthanasie.

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Ergebnisse

TAPE ist ein supramolekulares Aggregat , das nach dem Zentrifugieren der Mischung von zwei wässrigen Lösungen legt sich enthält TA (1 g / ml in destilliertem Wasser) und PEG (1 g / ml in destilliertem Wasser) mit 2: 1 - Volumenverhältnis (1A). Das Mischungsverhältnis ist der Schlüsselfaktor in hohe Haftfestigkeit zu erreichen; Wenn das Band durch einen 2 gebildet wird: 1 Mischungsverhältnis, 20 Einheiten der Hydroxylgruppe (-OH) in 25 Einheiten von TA mit jeder Et...

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Diskussion

Wir entwickelten eine völlig neue Klasse von hämostatischen Kleber genannt TAPE durch die wasserfesten molekulare Wechselwirkung einer Pflanze abgeleitetes Polyphenol-Verbindung angeregt, TA. TA ist eine repräsentative Gallotannine, die deutlich Aufmerksamkeit wegen seiner antioxidativen, antibakteriellen, anti-mutagen und anti-karzinogenen Eigenschaften angezogen hat.

Das Verfahren zur Herstellung TAPE ist extrem einfach, skalierbar und umweltfreundlich, da sie durch Zentrifugieren ohne ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tannic acid	Sigma-aldrich	403040
Poly(ethylene oxide), 4-arm, hydroxy terminated	Aldrich	565709	Averge Mn ~ 10,000
Poly(ethylene glycol)	Aldrich	373001	Average Mn 4,600
Biopsy punch	Miltex	33-36	Diameter = 6 mm
Aron Alpha	Toagosei Co., Ltd.		Instant glue
Universal testing machine (UTM)	Instron	5583
Microcentrifuge tubes	SPL life science	60015	1.5 ml
Petri dish	SPL life science	10090	90 x 15 mm
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	1x PBS ingredient
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S5136	1x PBS ingredient
Sodium chloride	Duchefa biochemie	S0520.5000	1x PBS ingredient
Incubating shaker	Lab companion	SIF6000R
ICR mice	Orient bio	Normal ICR mouse	6 weeks, 30 - 35 g, male
Tiletamine-zolazepam (Zoletil 50)	Virbac
Zylazine (Rompun)	Bayer
PrecisionGlideTM needle (18 G)	BD	302032	18 G
Filter paper	Whatman	1001 125	Diameter = 125 mm
Parafilm	Bemis Flexible Pakaging	PM996