Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen

Zusammenfassung

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Zusammenfassung

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

Einleitung

Metastasierung entfallen mehr als 90% der Todesfälle durch soliden Tumoren verursacht. Bone ist die häufigste Orgel von Metastasen verschiedener Krebsarten betroffen, vor allem Brust- und Prostatakrebs. Wenn in der Klinik diagnostiziert, in der Regel Knochenmetastasen bereits fortgeschrittenen Stadien entweder mit osteolytischen oder Osteoblasten-Veränderungen in Knochen getreten ist, oft mit neurologischen Symptomen begleitet.

Vorherige Studien konzentrierten sich überwiegend auf die offenkundige osteolytischen Knochenmetastasen ^1-3, aber wir derzeit haben begrenzte Verständnis von Mikrometastasen in Knochen vor dem Beginn des osteolytischen Prozess. Dies ist zumindest teilweise aufgrund des Fehlens von geeigneten experimentellen Modellen und Ansätzen. Gentechnisch hergestellten Mausmodelle von Brustkrebs metastasiert oft an die Lungen, aber viel weniger effizient Knochen ^4. Ebenso entwickeln sich die orthotop transplantierten Tumoren selten spontane Knochenmetastasen, mit einigen Knochentropischen 4T1 Brust Karzinomein Sub-Klone und MSP überexprimiert PyMT transgenes Mausmodell als Ausnahmen ^5-7. Intra-Tibia - Bohrungen können Krebszellen bis auf die Knochen ^8-10, aber es entstehen auch Schäden und Entzündungen zu lokalen Gewebe liefern. Derzeit intrakardiale Injektion von Brustkrebs - Zelllinien wurde die Haupt Ansatz gewesen ^11-13 Knochen Kolonisation zu untersuchen. Doch nach Krebszellen in den linken Ventrikel eingeführt werden, nur ein begrenzter Anteil erreichen schließlich Knochen und Knochenmark, was es schwierig macht mikroskopische Metastasen in einer quantifizierbaren Weise zu verfolgen.

In dieser Studie stellen wir eine Technik, nämlich intra Hüftarterie (IIA) Injektion ^14, selektiv Krebszellen in der hinteren Gliedmaßen Gewebe liefern, wodurch die Krebszellen in Knochen und Knochenmark Anreichern ohne Beschädigung lokale Gewebe zu verursachen. Aufgrund der Knochen Spezifität, ermöglicht dieser Ansatz auch genügend Zeit für die indolenten Krebszellen, um schließlich vor ein kolonisierenimals erliegen primären Tumoren oder Metastasen in anderen lebenswichtigen Organen. Wenn sie mit einer Vielzahl von anderen Techniken kombiniert, wie Biolumineszenz-Bildgebung, Immunfluoreszenzanfärbung und Knochenhistomorphometrie ist IIA Injektion potenziell nützlich für einen weiten Anwendungsbereich von Forschungszwecke zu Knochenmetastasen im Zusammenhang, vor allem aus der Progression zu verfolgen einzelne Krebszellen zu mehrzelligen micrometastases. Insbesondere haben wir gezeigt, dass IIA Injektion uns ermöglicht, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und verschiedene Arten von umgebenden Zellen im Knochenmikroumgebung zu visualisieren.

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Protokoll

Alle tierischen Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Tierpflege Richtlinien des Baylor College of Medicine durchgeführt.

1. Zellpräparation

Hinweis: Verschiedene Krebszelllinien können für die Injektion IIA verwendet werden, je nach Forschungszwecken. Wir haben Brustkrebs-Zelllinien MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 und Prostatakrebs-Zelllinie C4-2 in unserer Forschung. Wir verwenden in der Regel sowohl GFP- und Glühwürmchen-Luciferase-markierten Krebszellen für unsere Studie und zeigen einige Daten hier aus der GFP-Luziferase-markierten MCF7 Zelllinie.

1. Pflegen Zellen in DMEM , enthaltend 10% FBS und 0,1 mg / ml Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C in 5% CO _2.
2. Vor IIA Injektion, trypsinize Zellen bei 80-90% Konfluenz mit 0,25% Trypsin / EDTA-Lösung. Mit kaltem PBS Zellen zweimal zu waschen und resuspendieren Zellen in 10 ml PBS zur Zellzählung. PBS, zentrifugieren Zellen bei 800 xg für 5 min zu entfernen.
3. Re-suspend-Zellenbei einer Konzentration von 5 x 10 ⁶ Zellen / ml in eiskaltem PBS.
4. Verwenden Sie 100 ul GFP- und Glühwürmchen-Luciferase-markierten Krebszellen für IIA Injektion einer Maus.
   Anmerkung:. Daher ist die Anzahl der von jedem Tier erhielt Zellen 5 x 10 ⁵ kann diese Anzahl muss basierend auf der Aggressivität von Zelllinien verändert werden.
5. Halten Zellsuspensionen auf Eis.
   Hinweis: Vibrationen können erforderlich sein, die Zellaggregation alle paar Minuten, um zu verhindern, bis sie für die Injektion bereit ist. Bei einigen Zelllinien (zB MDA-MB-231), strengere Verfahren (zB durch 45 & mgr; m Zellsieb vorbei) kann zur Verhinderung der Aggregation benötigt werden. Bitte beachten Sie, dass die Verstopfung von Gefäßen Gewebsnekrose verursachen und daher die Versuche Verwechselung.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Für Tierschmerztherapie, geben 5 mg / kg / Tag Carprofen (oder ein anderes Analgetikum) mit Nahrungsergänzungsmittel für die Mäuse nicht weniger als 24 Stunden vor der Operation. Verwalteneine Dosis von 0,1 mg / ml Buprenorphin subkutan 60 min vor der Operation. Hinweis: Ein optionales Verfahren ist estradiol Palette in den Rücken der Tiere zu implantieren zusätzliche estradiol bereitzustellen. Dadurch wird die wachsen von ER + Krebszellen (zB MCF-7 - Zellen) ⁹ beschleunigen.
2. Anästhesieren einen 4 - 6 Wochen alten Maus (ca. 20 g) mit Ketamin (80 - 100 mg / kg) und Xylazin (10 -12,5 mg / ml) durch intraperitoneale Injektion.
3. Bestätigen Sie die entsprechende Ebene der Sedierung einer 20 g Maus durch Zehe Prise und die Beobachtung einer 50% igen Reduktion der Atemfrequenz und rosa Schleimhäute (zB Mausohrhaut und Pfote Haut). Bewahren Sie diese Vitalfunktionen überwachen alle 15 Minuten während der Operation. Anmerkung: keine Bewegung des Tieres anzeigt, dass das Tier für eine Operation ausreichend anästhesiert und bereit ist.
4. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit zu verhindern.
5. Rasieren Sie mit der Maus auf den unteren Bauch, vor allem die rechte Leistengegend, wo die Operation und Einspritzungstattfinden.
   Anmerkung: Dies ist nicht notwendig, wenn athymische Nacktmäuse verwendet.
6. Setzen Sie die Maus auf den Rücken, breitete die Beine in ihrer natürlichen Position und halten Sie die Zehen auf mobile Dissektion Karton mit Klebeband.
7. Wischen Sie den rechten Leistengegend mit 70% Isopropyl Ethanol getränkten sterilen Wattestäbchen, gefolgt mit betadine chirurgischen Peeling mehrmals.

3. Die Gemeinsame Hüftvene und Artery Lage und Trennung

1. Machen Sie einen Hautschnitt von 1,0 bis 1,2 cm lang zwischen dem ^4. und ^5. Brustwarzen in der rechten unteren Abdomen mit sterilen, # 10 C - Klingen Stahl Skalpell in einem No. 3 Griff gehalten. Dann mit einem sterilen Operationstuch den tierischen Körper mit Ausnahme der Einschnittstelle zu decken.
2. Bewegen Sie das Tier zu Standardtisch Präpariermikroskop. Verwenden Sie eine Vergrößerung von 4X zur Injektion.
3. Unter 4-fache Vergrößerung des Präpariermikroskop, legen stumpfe Trennung Zange zwischen Fettgewebe und dem peritoneum, und drücken Sie die nach außen Gewebe auf beiden Seiten der Beckengefäße und Nerven freigelegt (siehe Abbildung 1).
   Anmerkung: Die Arterie zwischen Aorta von der Mittellinie und dem unteren Teil der Arterienzweige wird Arteria iliaca communis genannt. Dies ist, wo die Injektion stattfindet.
4. Verwenden Sie ein Paar gerade feinen Pinzette durch das Bindegewebe zu brechen (wie eine Membran) zwischen Gefäßen und Nerven, näher an den Gefäßen.
5. Schalten Sie die gerade feinen Pinzette an der linken Hand. Schnappen Sie sich ein Paar abgewinkelter feinen Pinzette mit der rechten Hand. Legen Sie die rechte Hand Zange in derselben Position, wo das Bindegewebe gebrochen wurden. Und dann halten Sie die rechte Hand Zange durch, unter den Gefäßen.
6. Zur gleichen Zeit, legen Sie die linke Hand Pinzette in das Bindegewebe auf der linken Seite der Gefäße, die rechte Hand Zange gehen durch zu führen.
7. Sobald die rechte Hand Zange unter den Gefäßen wird, versuchen die Gefäße vom umgebenden ti zu trennenUSGABE ein wenig mehr, und sie dann immer an der Spitze der rechten Hand Pinzette.
8. Verwenden Sie die linke Hand Zange die Spitze einer 4-0 Seidennaht auf die rechte Hand Zange zu liefern, und ziehen Sie dann den Faden sanft und langsam durch unter den Gefäßen. Hinweis: Nun sind beide gemeinsame Vene und Arterie Gefäße werden durch die Naht (siehe Abbildung 2) angehoben.

4. Injection und Post-Injektion Pflege

1. Bereiten Sie die Zellen für die Injektion in einer 31 G Insulinspritze. Verwenden von 100 & mgr; l der Zellsuspension in PBS pro Injektion. Achten Sie darauf, zu pipettieren nach oben und unten mehrere Male um die Zellen zu trennen und die Aggregation zu vermeiden, so dass die injizierten Zellen nicht den Blutfluss verstopfen und blockieren.
2. Mit den abgewinkelten Zange in der linken Hand, legte die Zange unter den Gefäßen entlang der Führung des Fadens, und öffnen Sie dann die beiden Arme der Zange, die Gefäße sanft an der Zange gehalten hat.
   Hinweis: Der Abstand zwischen den beiden Armen der Zange wird die injection Ort.
3. Halten Sie die 31 G-Nadel mit 100 & mgr; l Zellsuspensionen in der rechten Hand, mit der Abschrägung der Nadel nach oben, bereit für die Injektion.
4. Führen Sie die Nadel in die Arterie Lumen (Blut wird die Nadelspitze eingeben). Drücken Sie dann langsam in die Zellen Zellsuspension zu injizieren. Die Zellsuspension wird drücken Sie den roten Blut in dem Gefäß entfernt. Versuchen Sie nicht, die Gefäße zu brechen oder die Zellsuspension austreten.
5. Wenn die Einspritzung beendet ist, ziehen Sie vorsichtig die Nadel zurück und halten die Schiffe bis auf der linken Zange hält die Blutung zu stoppen. Ziehen Sie dann den Faden weg.
6. Ziehen Sie die linke Hand Pinzette entfernt und schnell mit einem Wattestäbchen verwenden, um die Arterie Schnittbereich zu drücken, die Blutung zu stoppen.
   Hinweis: In der Regel von 5 bis 10 min Dauerdruck ausreicht, um die Blutung zu stoppen.
7. Wenn stoppt Blutungen, verwenden Hautkleber die Hautränder des OP-Bereich zu schließen. Machen Sie eine Ohrmarke, und überprüfen Sie die Biolumineszenz signalisiert die Verteilung der injizierten Zellen zu untersuchen.
   Hinweis: Eine erfolgreiche Injektion wird in einem Bild führen , ähnlich Abbildung 3.
   1. Überprüfen Biolumineszenz Signalisierung durch Injektion von 100 ul 15 mg / ml Luciferin in PBS bei 75 mg / kg Maus-Konzentration über den intraorbitalen Sinus.
      1. Für den inner orbitalen Injektion setzen Finger auf beiden Seiten der Maus Auge, mit Druck Auge Ball leicht herausspringen aus dem Auge Rahmen machen, legen Sie 28 G Insulinspritze Nadeln zwischen Augapfels und Nase, und dann Spritze langsam drücken, um Luciferin injizieren .
         Hinweis: Bei der richtigen Position, sollte die Nadel der Lage sein, eine Tiefe von 2 zu erreichen - 3 mm vor hartem Gewebe (Knochen) zu schlagen.
      2. Platzieren Sie die Maus in die Abbildungssystem für in vivo ganze Tierbildgebung für 10 bis 60 Sekunden innerhalb von 5 min (siehe Abbildung 3).
         Hinweis: Ein optionales Verfahren ist estradiol Pellet in den Rücken der Tiere zu implantieren zusätzliche estradiol bereitzustellen. Dadurch wird das Wachstum von ER + Krebszellen (beispielsweise MCF-7 beschleunigenZellen) ^15.
8. Lassen Sie die Maus an einem warmen Heizkissen, bis er aufwacht. Überwachen Sie die Blutungen, Schwellungen, Anzeichen von Aufplatzen und Schmerzen während der postoperativen Periode. Setzen Sie die Mäuse wieder in den Käfig mit analgetischen Abdeckung (carprofin Nahrungsergänzungsmittel empfohlen) für die Schmerztherapie, bis keine Anzeichen von Schmerzen gegeben. Achten Sie Aufmerksamkeit und Pflege der Tiere während 7 Tage nach der Operation.

5. Überwachung metastatischen Wachstums

1. histomorphometrisch:
   1. Ernte Tumor Knochengewebe tragen, fixieren die Knochen in 4% Paraformaldehyd für 24 Stunden, so dass sie dann entkalken in pH 7,0 14% EDTA - Lösung für 3 - 5 Tage, und unterwerfen sie beschrieben , wie zuvor ¹⁴ bis Paraffineinbettung.
   2. Abschnitt die in Paraffin eingebettet werden Knochengewebe mit einer Dicke von 3 & mgr; m und führen histologischen Standardverfahren von Hämatoxylin / Eosin - Färbung , wie zuvor ¹⁴ beschrieben.
2. ImmunohistochemisVersuchen:
   1. Gegenstand Paraffin eingebetteten Tumorlager Knochen gleitet Anfärben für verschiedene Zwecke Immunhistochemie wie zuvor beschrieben ^14. Kurz gesagt, immunostain MCF7 Krebszellen durch anti-GFP-Antikörper und immunostain osteogenen Zellen (Präosteoblasten und Osteoblasten) durch anti-Osterix Antikörpern und anti-alkalischer Phosphatase (ALP) Antikörper, respectively.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die anatomische Lage und Beziehung von A. iliaca communis (rot) und Vene (blau).

Abbildung 2 zeigt die relative Position der Beckengefäße und Nerven unter Dissektion Mikroskopie. Wie in 2A dargestellt, werden die Gefäße und Nerven unterhalb der Bauchwand der rechten und kann nach der Hautschnitt offenbart werden wird und das Peritoneum weg gedrückt wird....

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Diskussion

Obwohl nur die Beckenarterie das Ziel der Injektion für Krebszellen ist, empfehlen wir die Trennung der beiden Hüftvene und Arterie aus den umliegenden Geweben und als Bündel, sie gemeinsam zu heben. Dies liegt daran, die Vene und Arterie ausgiebig miteinander in Kontakt, und die venöse Gefäßwand ist dünn und ist leicht zu brechen. Daher ist für eine erfolgreiche Injektion, es spart Zeit und Mühe, die beiden Schiffe zusammen zu halten, obwohl Krebszellen nur in die Arterie injiziert werden. Ein 4-0 Seidennaht w...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45 μM cell strainer	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF with carprofen	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Buprenorphine	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Estradiol pellet	Innovative Research of America	SE-121
Ketamine and xylazine	Controlled item from veterinary care in BCM
Vet ointment	Controlled item from veterinary care in BCM		Avoid eye dryness
Shaver	Oster	78005-050	For furred mice
Isopropyl ethanol	ACROS	67-63-0
Betadine surgical scrub	Controlled item from veterinary care in BCM
#10 scalpel blades	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Multiple
No. 3 handle	Ted Pella, Inc	541-31	Need to be autoclaved
Sterile surgical drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
Straight forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	Need to be autoclaved
Straight fine forceps	Fine Science Tools	11253-20	Need to be autoclaved
Edged fine forceps	Fine Science Tools	11253-25	Need to be autoclaved
4-0 Vicryl silk suture	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G insuline syringes	BD	328418	Multiple
Q-tips cotton swabs (Sterile)	VWR International Laboratory	89031-272
Skin glue	Henry Schein Animal Health	31477	For surgery site skin closure
Ear Tag Applicator	Fine Science Tools	24220-00
Ear tags	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK	Avoid light and put on ice
28 G insulin syringes	BD	329410	For intra-orbital injection
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	For tissue fixation
EDTA	OmniPur	4050	For bone tissue decalficication
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection microscope	Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II imaging system	Advanced Molecular Vision
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-GFP antibodies (JL-8)	Clontech	632381
Anti-ALP antibodies	Abcam	ab108337
Anti-Osterix antibodies	Abcam	ab22552