Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.

Zusammenfassung

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

Einleitung

Verbreitung von Tumorzellen von der primären Mammatumor wurde nicht nur Tumorzellen gezeigt einzubeziehen, aber Host stromalen Zellen, einschließlich Makrophagen und Endothelzellen. Darüber hinaus ist Tumorgefäße mit einer erhöhten Permeabilität ¹ abnormal. Somit bestimmen, wie Tumorzellen, Makrophagen und endothelialen Zellen in Wechselwirkung treten Gefäßpermeabilität und Tumorzell intravasation in dem primären Tumor-Mikroumgebung zu vermitteln, ist wichtig für das Verständnis der Metastasierung. die Kinetik der vaskulären Permeabilität, Tumorzelle intravasation und dem darunterliegenden Signalisierungsmechanismus von mehrzelligen Interaktionen im Tumormikroumgebung zu verstehen, können wichtige Informationen bei der Entwicklung und Verabreichung von Antikrebstherapien bereitzustellen.

Die primäre Mittel der Tumor vaskuläre Permeabilität in vivo zu studieren die Messung von extravaskulärem Farbstoffe wie Evans - Blau ^2, hochmolekulare Dextrane (155 kDa) wurde³ und Fluorophor oder Radiotracer-konjugierte Proteine ​​(einschließlich Albumin) ⁴ in festen Zeitpunkten nach der Injektion des Farbstoffes. Fortschritte in der Mikroskopie, Tiermodelle und Fluoreszenzfarbstoffe haben die Visualisierung von zellulären Prozessen und vaskuläre Permeabilität in lebenden Tieren durch Intravitalmikroskopie ⁵ aktiviert.

Live - Tierbildgebung mit dem Erwerb von statischen Bildern oder kurzen Zeitraffer-Sequenzen über mehrere Zeitpunkte nicht für das Verständnis von dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu ^6,7 erlauben. Tatsächlich statische Bildaufnahme über den Verlauf von 24 Stunden gezeigt , dass Tumorgefäße undicht jedoch die Dynamik der vaskulären Permeabilität wurde ⁶ nicht beobachtet. So fängt längere kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung bis zu 12 Stunden, um die Kinetik der dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von erweiterten Zeitraffer multiphotauf Intravitalmikroskopie dynamische vielzelligen Ereignisse in der Tumor-Mikroumgebung zu studieren. Mehrere Zelltypen in der Tumor-Mikroumgebung mit injizierbaren Farbstoffen markiert oder mit transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine ​​verwenden. einen Schwanzvenenkatheter Gefäß Farbstoffe oder Proteine ​​verwendet, kann nach dem Start der Bildgebung injiziert werden kinetischen Daten von mehrzelligen Ereignisse im Tumormikromilieu zu erwerben. Für Live-Cell-Imaging wird die Brusttumor durch die chirurgische Vorbereitung einer Hautlappen ausgesetzt. Bilder werden für bis zu 12 Stunden erworben ⁸ eine Multiphotonen - Mikroskop ausgestattet mit mehreren Photovervielfacherröhren (PMT) Detektoren. Durch die Verwendung von geeigneten Filtern ermöglicht eine Subtraktion Algorithmus 4 PMT Detektoren 5 Fluoreszenzsignale im Tumormikromilieu zu erwerben gleichzeitig ^9. Hochauflösende Multiintravitalmikroskopie erfasst einzelne Zelle auflösende Bildgebung von Tumor-Stroma-Interaktionen im Tumormikromilieu, zu einem besseren führenden uERSTÄNDIGUNG der vaskulären Permeabilität und Tumorzell intravasation ^10-13. Insbesondere offenbart verlängerte intravitalAbbildungs ​​stark lokalisierten, transient Gefäßpermeabilität Ereignisse , die selektiv an den Stellen der Interaktion zwischen einer Tumorzelle, einem Makrophagen und einer Endothelzelle (definiert als der Tumor - Mikroumgebung der Metastasierung, TMEM ^{14) 13} auftreten. Weiterhin tritt Tumorzelle intravasation nur an TMEM und räumlich und zeitlich mit Gefäßpermeabilität ¹³ korreliert. Einzelne Zell Auflösung der Dynamik dieser Ereignisse wurde möglich durch die Verwendung erweiterter Zeitraffer-Multiphotonen-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen im Tumormikromilieu.

Protokoll

Alle beschriebenen Verfahren müssen mit den Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Zustimmung des Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committee entsprechend durchgeführt werden.

1. Erstellen von fluoreszenzmarkierten Tumoren und Tumor-assoziierten Makrophagen

1. Generieren Sie fluoreszenzmarkierten Tumorzellen durch die spontane, autochthonen, gentechnisch veränderte Maus Brustkrebsmodell Kreuzung , wo die Maus - Mammatumorvirus long terminal repeat den Polyoma Mitte - T - Antigen (MMTV-PyMT) mit transgenen Mäusen mit fluoreszierenden Reporter - Laufwerke [dh Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), verbesserte cyan fluoreszierende Protein (ECFP) oder Dendra2] ^8,9.
2. Fluoreszenz Etikett Makrophagen in PyMT Tiere mit fluoreszenzTumorZellen gekennzeichnet durch mit myeloid- und Makrophagen spezifischen fluoreszierenden Reporter gentechnisch veränderter Mausmodelle Kreuzung [dh MacGreen ¹⁵ oder MacBlue Mäuse CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16].
3. Alternativ erzeugen fluoreszenz Tumoren durch orthotope Transplantation von fluoreszenzmarkierten PyMT Tumorzellen (syngene), humane Brustkrebszelllinien oder primären humanen Patienten stammt Tumoren (Xenotransplantate) ^11,17 bezeichnet.
   1. Implantat fluoreszenz PyMT Tumorzellen in syngene Mäuse , die mit fluoreszierendem Protein-markiertem myeloischen Zellen markiert Tiere mit fluoreszierend markierten Tumorzellen und myeloiden Zellen ¹³ zu erzeugen.
4. Injizieren von 100 & mgr; l von 10 mg / kg fluoreszierendes 70 kDa Dextran durch intravenöse (iv) Schwanzvene in severe combined immunodeficiency (SCID) -Mäusen mit Xenotransplantattumoren von menschlichen Zelllinien oder Patienten stammenden primären Tumoren fluoreszenz Etikett Makrophagen 2 h vor Beginn von intravital Bildgebung.

2. Mikroskopaufbau und Imaging Vorbereitung

Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt den Aufbaufür intravital Bildgebung auf einem Multi Mikroskop ^8.

1. Schalten Sie alle Mikroskop und Laser-Komponenten, einschließlich Zwei-Photonen-Laser und Detektoren.
2. Schalten Sie den Heizkasten auf 30 ° C auf die Bühne Vorwärmung. Dieser Schritt ist entscheidend für die physiologische Temperatur des Tieres gehalten wird.
3. Für den Einsatz auf einem inversen Mikroskop Ort der maßgefertigte Tischeinsatz auf dem Mikroskoptisch. Der Brauch Einsatz ist ein Blatt von 1/8 "dicken Aluminium gefräst in der Tischeinlage Raum zu passen und mit einem Durchmesser von 1" Durchgangsloch in der Mitte für die Bildgebung.
   1. Wischen Sie den Mikroskoptisch und Tischeinsatz mit 70% Ethanol und Luft trocknen lassen.
   2. Platzieren Sie einen großen Tropfen Wasser auf dem 20X, 1,05 NA Mikroskopobjektiv optischen Kontakt mit dem Deckglas zu halten.
   3. Platz Deckglas (# 1.5 Dicke) über den Imaging-Port auf dem Mikroskoptisch Einsatz. Sichern Sie an Ort und Stelle mit Labor Band.
   4. Verwenden Sie einen Locher eine 2 cm x 2 cm großes Loch zu stanzenin einer flexiblen Gummiauflage und legen Sie die Gummiauflage auf dem Mikroskoptisch mit dem Loch in der Unterlage mit dem Loch in der benutzerdefinierten Stufe Einsatz ausgerichtet ist.

3. Herstellung von Schwanzvenenkatheter und Reagenzien für die Injektion während der Bildgebung

1. Schneiden Sie ein 30 cm Länge von Polyethylen (PE) Rohr.
2. Mit einer Pinzette, bewegen Sie die Metallnadel einer 31 G-Nadel hin und her, bis er aus der Kunststoff-Fittings bricht.
3. Mit einer Pinzette, legen Sie das stumpfe Ende der abgelösten Nadel in den PE-Schlauch.
4. Legen Sie eine 31 G-Nadel in das andere Ende des PE-Schlauch.
5. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und legen Sie sie in den 31 G-Nadel und spülen Sie alle Luft aus dem Schlauch und Nadel mit PBS. PBS für die Aufrechterhaltung der Hydratation verwendet wird und Blut Osmolarität ^9,18 jedoch isotonischer Kochsalzlösung kann auch verwendet werden.
6. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 200 ul 3 mg / kg 155 kDa Dextran-Tetramethylrhodamin (TMR) Oder Quantenpunkte für die vaskuläre Kennzeichnung.
7. Bereiten andere injizierbare Proteine ​​wie beispielsweise eine 165 Aminosäure - Isoform des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (VEGFA ₁₆₅₎ in einer 1 cc Spritze und auf Eis stellen . Injizieren von 0,2 mg / kg VEGFA ₁₆₅ ¹⁹ bei einer Konzentration von 0,05 mg / ml.

4. Einsetzen des Verweil Schwanz Venenkatheter

1. Legen Sie das Tier unter Narkose unter Verwendung eines Induktionskammer mit 5% Isofluran mit O ₂ als Trägergas.
2. Übertragen Sie die Maus auf die chirurgische Plattform, sobald es vollständig betäubt und reagiert nicht auf einer Zehe Prise.
3. Offene Isoflurananästhesie Linie auf die chirurgische Plattform, schließen Sie die Anästhesie Leitung an die Induktionskammer und legen Sie den Nasenkegel über das Tier Schnauze. Reduzieren Sie die Isofluran von 5% auf 2,5%.
4. Anwenden Augensalbe für die Augen der Maus Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern.
5. Erhitzen Sie das Tier unter der Heizlampefür weitere 2 min Zirkulation in den Schwanz zu erhöhen, wie verlangsamt Zirkulation mit tiefer Narkose.
6. Sterilisieren Sie die Maus Schwanzvene mit 70% Ethanol.
7. Legen Sie die Spitze des 31 G-Nadel aus dem in Abschnitt 3 in die seitliche Schwanzvene des Tieres konstruiert Katheter und drücken Sie die Nadel in 2-3 mm.
8. Ziehen Sie die Spritze Blut zu sehen, zurück, um den Katheter gewährleistet in die Schwanzvene gelegt wird.
9. Verwenden, um eine 1 cm Länge lab Band über der Nadel angeordnet, um die Nadel an Ort und Stelle parallel zu der Vene entlang der Länge des Schwanzes zu halten.

5. Hautlappen chirurgischen Eingriff Expose die Brusttumor

1. Mit dem Tier auf der chirurgischen Plattform Tupfer des Tumors und der ventralen Oberfläche mit 70% Ethanol. Anmerkung: Wie beschrieben, ist dieses Verfahren nicht vollständig aseptischen Bedingungen durchgeführt. Für lange Imaging-Sitzungen, wo Infektion ein Störfaktor werden kann, wird empfohlen, eine aseptische Technik zu verwenden.
2. Mit sterile Zange, heben Sie die Bauchhaut und mit einer sterilen Schere eine subkutane Schnitt entlang der ventralen Mittellinie ca. 1 cm Länge. Vermeiden Sie das Peritoneum während der Einschnitt Punktierung.
3. Vorsichtig schneiden das Bindegewebe der Brustdrüse und Tumor entfernt vom Peritoneum Anbringen der Brusttumor zu belichten.
4. Mit einer Schere und Pinzette vorsichtig entfernen und die Faszien und Fett von der freiliegenden Oberfläche des Tumors unter Beibehaltung der Integrität der Gefäßversorgung des Tumors und die Minimierung von Blutungen wegschneiden. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Tumor-Architektur und Gefäßversorgung des Tumors zu halten.

6. Vorbereitung der Tiere für die Mikroskopie

1. Übertragen Sie das Tier auf die vorgewärmten Abbildungsstufe mit dem auf dem Deckglas platziert ausgesetzt Tumor auf der Bühne Einsatz über das Mikroskopobjektiv für die Bildgebung. Achten Sie darauf, die Schwanzvene Katheter sanft mit dem Tier zu übertragen, um nicht die Nadel zu entfernen.
2. Platz the Anästhesie Bugspitze über die Schnauze des Tieres Anästhesie Satz auf 3% Isofluran aufrecht zu erhalten.
3. Positionieren Sie das Tier so, dass der Tumor in das Loch des Gummikissen ruht und in Kontakt mit dem Deckglas.
4. Verwenden Sie zwei Gummi-Pads, um sanft den Tumor in Position zu halten und fixieren Sie diese mit Labor Band an den Mikroskoptisch Bewegung während der Bildaufnahme zu reduzieren.
5. Füllen der Kammer aus dem Gummikissen mit PBS, das Gewebe zu halten hydratisiert und optischem Kontakt mit dem Deckglas erhalten.
6. Starten Sie das Tier die Überwachung der Vitalfunktionen mit einem Pulsoximeter Sonde. Bringen Sie einen Clip Sensor an den Oberschenkel des Tieres. Alternativ kann eine Manschette, die verwendet werden, um den Hals zu passen kann konfiguriert ist.
7. Legen Sie die Heizkasten über das Tier zu halten bei 30 ° C ^20.
8. reduzieren Sie langsam das Niveau von Isofluran auf 0,5-1% Narkose zu halten und den Blutfluss aufrechtzuerhalten.

7. Bildaufnahme und Injektion von Fluorescent Farbstoffe und injizierbare Proteine

1. Verwendung des Mikroskop-Okular Fokus auf den fluoreszierenden Tumorzellen auf der Oberfläche des Tumors.
2. Wählen Sie einen Bereich von Interesse durch Bereiche mit fließenden Blutgefäße zu finden. Die Auswahl eines Bereichs von Interesse mit fließenden Blutgefäße ist entscheidend für die Tumorgefäße zu bewerten.
3. Sobald eine Region von Interesse ausgewählt wurde Schalten Sie das Mikroskop in Multibildgebungsmodus.
4. Den oberen und unteren Grenzen einer z-Serie. Stellen Sie die obere Grenze der z-Serie durch die Schärfeneinstellvorrichtung mit dem Ziel auf den gewünschten Startposition zu bewegen und auf die Z-Position "Oben" Taste. Bestimmen die Obergrenze der z-Reihe durch die Kollagenfaser-Netzwerk an der Oberfläche des Tumors in der Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) -Kanal Visualisierung und Beobachtung, wenn keine Zellen, aber nur Kollagenfasern sichtbar sind.
   1. Stellen Sie die Untergrenze der z-Reihe durch das Ziel auf den gewünschten Abbildungstiefe bewegt (typically 50-150 & mgr; m) und dann auf die Z-Position "Unten" -Taste.
   2. Stellen Sie die Schrittgröße um den gewünschten Wert in die Schrittgröße Feld eingeben. Bestimmen Schrittgröße basierend auf Überlegungen zur Auflösung und Aufnahmezeit (in der Regel 2 & mgr; m für die hochauflösende 3D-Rekonstruktion verwendet und 5 um auf andere Weise).
5. Stellen Sie den Zeitraffer-Intervall auf die Time-Lapse-Panel durch Umschalten und Eingabe der gewünschten Ablaufzeit in die Time-Lapse-Feld. Für eine optimale zeitliche Auflösung das Zeitintervall für die kontinuierliche Bildgebung auf 0 sec. Hinweis: Für lange Zeitraffer-Bildgebung ist es empfehlenswert, das Zeitintervall zwischen den Aufnahmen zu 10 Sekunden bis zum Ziel gesetzt, Tauchflüssigkeit aufzufüllen.
6. Nachdem die Parameter für die Abbildung bestimmt worden sind, injizieren langsam 155 kDa-Dextran-TMR.
   1. Entfernen Sie die Spritze mit PBS in die Schwanzvene Katheter und ersetzen mit der Spritze, die 155 kDa Dextran-TMR kümmert sich keine Blasen in den li vorstellenne.
   2. injizieren Sie langsam 155 kDa Dextran-TMR in die Maus, mit einem maximalen Volumen von 200 & mgr; l, und ersetzen Sie die Spritze mit der Spritze PBS enthält. Kritischste Schritt: Führen Sie die Injektion langsam und Vorkehrungen treffen, um zu vermeiden Lösung außerhalb der Vene zu bekommen.
7. Starten Sie den Erwerb der Z-Stack-Zeitraffer-Bildgebung durch einen Klick auf den Z-Stapel und Zeitraffer-Tasten, sie zu drücken und dann auf die Aufnahmetaste klicken.
8. Wenn andere fluoreszierende Dextrane, dh 10 kDa - Dextran-Fluorescein - Isothiocyanat (FITC), oder Proteine, dh VEGFA ₁₆₅ haben im Voraus vorbereitet worden ist , injizieren sie nach dem Beginn der Bildaufnahme für at = 0 min Start.
   1. Entfernen Sie die Spritze mit PBS in die Schwanzvene Katheter und ersetzen mit der Spritze , die 10 kDa Dextran-FITC oder VEGFA ₁₆₅ kümmert sich keine Blasen in die Leitung einzuführen.
   2. injizieren Sie langsam injizierbaren in die Maus über die Schwanzvene Katheterund ersetzen Sie die Spritze mit einer Spritze mit PBS.
9. Alle 30-45 min, injizieren langsam 50 ul PBS oder Kochsalzlösung Hydratation des Tieres zu halten.

8. Euthanasie

1. Bei Beendigung der Bildaufnahme, euthanize das Tier.
   1. Erhöhen Sie die Isofluran bis 5%.
   2. Halten Sie das Tier unter 5% Isofluran bis 30 Sekunden, nachdem er aufhört, das Tier von der Bühne zu atmen und zu entfernen.
   3. Führen Sie Zervikaldislokation vollständige Euthanasie zu gewährleisten.

9. Bildverarbeitung

1. Erwerben Sie Bilder in 16-Bit-TIFF-Dateien für jeden einzelnen Kanal zu jedem Zeitpunkt und sparen nacheinander.
2. Führen Trennung der spektralen Überlappung (dh GFP und GFP), die Abschaffung der xy Drift und die Erzeugung von Filmen von Zeitraffer-Sequenzen unter Verwendung von etablierten Verfahren in ImageJ ^9. Führen Sie 3D - Oberflächenrekonstruktionen von hochauflösenden Bildern ¹³.

Ergebnisse

Erweiterte Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht einzelne intravital Zellauflösende Bildgebung von mehrzelligen Prozesse im Tumormikromilieu. Durch fluoreszenz Markierung von Tumorzellen, Makrophagen, den vaskulären Raum und Visualisieren des Kollagenfasernetzwerk der zweiten Harmonischen Erzeugungssignal, mehrere Kompartimente in der Tumor-Mikroumgebung verwendet werden gleichzeitig während der Bildgebung verfolgt. Tumorzellen mit fluoreszierenden Proteinen markiert können in transgene...

Diskussion

Zelluläre Interaktionen, die sich spontan in der Tumor-Mikroumgebung auftreten können, auf Veränderungen in der Tumorzellbeweglichkeit und intravasation führen. Hochauflösende intravital Bildgebung von lebenden Tumorgewebe ermöglicht die Visualisierung von mehrzelligen Dynamik , die hochtransienten ^10,13,24 sein kann. End-Punkt in - vivo - Tests oder Zeitraffer-Bilder mit diskreten Zeitpunkten erworben wesentlichen Informationen über die molekularen Mechanismen von Prozessen in der Tu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch