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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Zusammenfassung

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

Einleitung

Die Blut-Liquor - Schranke (BCSFB) ist einer der drei Sperrstellen zwischen Blut und Gehirn 1. Seine morphologische Korrelat sind die Epithelzellen des Plexus (CP) 2,3, eine endotheliale-epithelialen Konvolut, das in den Ventrikeln des Gehirns stark gefäß und befindet. Der CP dient der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), sowie zur Trennung der letzteren aus dem Blut zu erzeugen. Um die Barrierefunktion, die CP - Epithelzellen zeigen eine geringe pinozytotische Aktivität exprimieren spezifische Transporter und sind dicht verbunden durch ein kontinuierliches Netzwerk von Tight Junctions (TJs) 2,3 zu erreichen.

Menschliche Plexuspapillom (HIBCPP) Zellen, abgeleitet von einem bösartigen Plexuspapillom einer japanischen Frau 4, wurden verwendet , um einen funktionellen in vitro - Modell des BCSFB zu konstruieren. HIBCPP Zellen zeigen einige Eigenschaften eines funktions BCSFB wie die Bildung von TJStränge, die Entwicklung eines hohen transepithelialen Membranpotential, die als transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) und kleinere Permeabilitäten für Makromoleküle bestimmt werden kann. Darüber hinaus exprimieren HIBCPP Zellen charakteristische Transporter, die die ionische Mikro regulieren dienen können, und apikal / basolateralen Polarität 5,6,7 zeigen.

Die BCSFB wurde für Krankheitserreger (Bakterien, Viren und Pilze) in das zentrale Nervensystem (ZNS) 8 als Eintrittsstelle dargestellt funktionieren. Die Invasion von Krankheitserregern, einschließlich Neisseria meningitidis (N. meningitidis), ein gramnegative Bakterium, können schwere Krankheiten wie Meningitis verursachen. Der Nachweis , dass sie die Schutz epitheliale Barriere des CP überwindet , ist von histopathologischen Beobachtungen bei Patienten unterstützt mit Meningokokken - Erkrankung in den Gefäßen erhöhte Mengen an Meningokokken aufweisen und CP Epithelzellen 9,10. Um sich den Eintritt in die Wirtszellen bacteria fallen oft endozytotischen Mechanismen, die vermittelt werden, oder ausgelöst durch spezifische Oberflächenrezeptoren auf den Wirtszellen. Da Interaktionen von Pathogenen mit diesen Rezeptoren Spezies sein können spezifische 11, Tiermodelle können nur in beschränktem Umfang zu Rate gezogen werden. Die HIBCPP Zelllinie bietet die Möglichkeit, den Invasionsprozess sowie die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen im menschlichen Modellsystem zu studieren. Zellkultur-Einsätze Einsatz ermöglicht es uns, aus zwei verschiedenen Zellseiten Interaktionen von Pathogenen mit Wirtszellen zu analysieren. Viele Bakterien, einschließlich N. meningitidis, sind die Auswirkungen der Schwerkraft während der Infektion Assays stark unterworfen. Für eine optimale Wechselwirkung der Pathogene mit den HIBCPP Zellen während des Assays werden die Bakterien zunächst in das obere Kompartiment der Zellkulturfiltereinsatz System hinzugefügt. Zur Infektion von der apikalen oder der basolateralen Zellenseite ermöglichen jeweils zwei Varianten der in vitro - System gewesen ESTAblished: Im Standardsystem HIBCPP Zellen der oberen Kammer des Filtereinsatzes ausgesät, imitiert die Situation , wenn Mikroorganismen auf der CSF-Seite angeordnet sind und in Kontakt mit der apikalen Seite der Zellen (1A, C) erhalten. Im Gegensatz dazu spiegelt unter Verwendung der HIBCPP Zellen in einer umgekehrten Zellkulturfiltereinsatz System die Bedingungen, wenn Bakterien in den Blutstrom eingegeben haben. Mikroorganismen Verbreitung im Blut und Begegnung CP Epithelzellen aus der basolateralen Seite (1B, D). Bemerkenswert ist es in diesem Modellsystem wurde gezeigt , daß Bakterien eindringen HIBCPP Zellen in einem polaren Mode gezielt von der basolateralen Zellenseite 5,7.

Anschließend auf eine Infektion des CP können die Invasion von Krankheitserregern des angeborenen Immunsystems durch Ligation an Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) erkannt werden. Nun beschriebenen Mitglieder der PRRs gehören zu den Toll-like Rezeptor (TLR) -Familie. TLRs kann bind charakteristische Strukturen von infektiösen Mikroorganismen, die genannte pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) sind. Ligierung der Rezeptoren führt zur Aktivierung von Wirtszellsignalkaskaden , die Expression auslösen von Zytokinen und Chemokinen 12, die wiederum Transmigration von Immunzellen über den BCSFB 13,14 stimulieren. Es hat sich gezeigt , dass HIBCPP Zellen mehrere TLR auf mRNA - Ebene und , dass eine Infektion mit N. ausdrücken meningitidis resultiert in der Sekretion von mehreren Cytokinen und Chemokinen, einschließlich CXCL1-3, IL6, IL8 und TNFa 15,16.

Hier beschreiben wir Kultivierung und Infektion der menschlichen Zelllinie HIBCPP in einer umgekehrten Zellkultureinsatz System, das die BCSFB nachahmt. Dieses Modellsystem ermöglicht Interaktionen von Pathogenen mit der in vivo relevant basolateralen Zellenseite sowie die nachfolgende zelluläre Antwort zu studieren.

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Protokoll

1. Bereiten Sie Cell Culture Filterpatronen für Seeding HIBCPP Zellen in einem Inverted Modellsystem

  1. Pre-warmen DMEM / F12 (Ham) mit 5 ug / ml Insulin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% fötalem Kälberserum (FCS).
  2. Verwenden einer sterilen Pinzette 0,33 cm² Wachstumsbereich Zellkulturfiltereinsätze mit einer Porengröße von 3 um den Kopf stellen, in eine 12-Well - Platte (Abbildung 1E).
  3. Füllmedium in das untere Kompartiment der Zellkulturfiltereinsatz (ca. 3 ml) und 100 & mgr; l auf die Oberseite des Filtereinsatzes. Flood die Platte sowie das untere Fach mit Medium. Absaugen übermäßige Medium derart , daß das untere Fach des Filtereinsatzes bleibt gefüllt (Figur 1E).
    Hinweis: Es wird empfohlen, eine serologische Pipette für diesen Schritt zu verwenden.
  4. Abdeckung 12-Well-Platte mit dem Deckel und übertragen die vorbereiteten Zellkulturfiltereinsätze in den Inkubator, 37 ° C,5% CO 2 bis zur Zugabe der Zellen.

2. Kultivierung und Passagierung von HIBCPP Zellen

  1. Bereiten DMEM / F12 (Ham), ergänzt mit 5 ug / ml, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% FCS.
  2. Vorwärmen Medium und PBS in einem 37 ° C Wasserbad. Absaugen Medium von Kolben. 10 ml PBS in den Kolben und wirbeln. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt.
  3. 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA in den Kolben und wirbeln. Legen in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2.
  4. Nach etwa 20 Minuten wird der Kolben aus dem Inkubator entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen aus dem Boden des Kolbens abgelöst werden und zeigen eine runde Form, wenn sie mit dem Mikroskop vermessen.
    Anmerkung: Die Zellen lösen sich nicht vollständig voneinander und werden oft in Agglomerate gefunden. Es wird empfohlen, die Zellen 38 bis Passage zu verwenden.
  5. So stoppen Sie Trypsinierung 17 ml Medium hinzu. Resuspendieren der Zellen durch Pipettieren auf und ab und übertragen die Aussetzungin einen 50-ml-Tube. Zentrifuge bei 50 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
  6. Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen Medium und die Zellen durch Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers.
    Anmerkung: Die Konzentration der resuspendierten Zellen HIBCPP sollte 1 x 10 6 Zellen / ml sein. Für die Versorgung der Zellen HIBCPP wird vorgeschlagen , eine Menge von 1-6 x 10 6 Zellen in 10 ml Medium zu einem T75-Kolben zu übertragen. Ändern Medium jeden zweiten Tag.

3. Seeding Inverted Zellkulturfilterpatronen mit HIBCPP Zellen

  1. Auf der jeweils invertierte Filtereinsatz (dh der unteren Seite des Filters) 80 & mgr; l der Zellsuspension hinzu (dh. 8 x 10 4 Zellen) (1E).
    Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Zellen gleichmäßig in der Suspension verteilt werden durch das Rohr vor der Aussaat zu invertieren.
  2. Decken Sie die ausgesäten-Zellkulturfiltereinsätze mit dem Deckel der 12-Well-Platte und den Transfer in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2.
  3. Am ersten Tag, füllen 1 ml Medium in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Heben Sie die Zellkulturfiltereinsätze mit einer Pinzette aus der 12-Well - Platte verwenden, entsorgen Sie das Medium nach innen, drehen Sie die Filtereinsätze und legen Sie sie in der Standard - Orientierung in die vorbereitete 24-Well - Platte (Abbildung 1E).
  4. jeden zweiten Tag Legen Sie die Zellen in frisches Medium. Bereiten Sie 24-Brunnen mit frischem Medium und übertragen Sie die Filtereinsätze zu. Füllen Einsätze mit 0,5 ml frisches Medium. Überprüfen Sie TEER jeden Tag, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
  5. Wenn TEER-Werte von HIBCPP ausgesät-Zellen auf Zellkultureinsätzen über 70 Ω x cm² (etwa 4 Tage nach dem Aussäen), dann wird der Zellkultur in Medium weiterhin enthaltend 1% FCS und 5 & mgr; g / ml Insulin. Bereiten Platten mit 24 Vertiefungen mit 1 ml Medium für jede Vertiefung. Übertragen Filtereinsätze auf die vorbereiteten Kavitäten und Austauschmedium in der oberen Kammer.
    Anmerkung: Diese Serumentzug nach Konfluenz führt zur Bildung voneine höhere Membranpotential.
  6. Absaugen Medium aus dem Filterfach, Transfer zum gut vorbereitet und mit 500 & mgr; l Medium zu füllen. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. Setzen Sie die Zellen über Nacht in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2.

4. Messung der transepitheliale Elektrischer Widerstand (TEER)

  1. Tauchen Sie die Elektrodenspitzen von Epithelgewebe Cell 15 min in 80% Ethanol. Übertragen Cell unter der Haube und lassen Elektrode trocken für einen Moment. Platzieren Elektrode in entsprechende Kulturmedium für die Zellen für weitere 15 min verwendet zu äquilibrieren.
  2. Messungen durchführen, indem Sie den längeren Arm der Elektrode so, dass sie den Boden der unteren Kammer jedes Mal berührt, stellen Sie den kürzeren Arm in den Filtereinsatz Fach.
    Hinweis: Die Widerstandswerte von Zellkulturfiltereinsätze ohne Zellen in Medium sollte als Blindwerte verwendet werden ((Messwert (Ω) - Blindwert (Ω)) x FilterOberfläche (dh 0,33 cm²)).
  3. Ort der Elektrode wieder in 80% Ethanol für 15 min Nach der Messung. An einem trockenen Rohr.

5. Bestimmung der parazelluläre Permeabilität

  1. Man löst 1 g FITC-Inulin in 200 ml Kulturmedium mit 5 ug / ml Insulin 1% FCS ergänzt. Anwenden 50 ug / ml der Lösung in das obere Filterabteil vor der Infektion der Zellen.
  2. Nach der Infektion sammeln Mediumproben aus dem unteren und um zu bestimmen, wie viel Inulin aus der Filterkammer durch die Zellschicht geleitet.
  3. Bereiten Sie eine FITC-Inulin Standardlösung und führen 1: 2-Verdünnungen, 10-mal (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% und 0%) . Bestimmen Sie Fluoreszenz durch Messung aller Proben in Mikrotiterplatten-Lesegerät.

6. Herstellung von Bakterien zur Infektion von HIBCPP Zellen auf Zellkulturfilterpatronen

  1. Einen Tag vor dem Experiment, schaben ter gefroren N. meningitidis - Stämme mit einem Glycerin-Lager und Streifen aus auf Schokolade - Agar mit Vitox ab. Wachsen über Nacht in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  2. Auszug 20-30 Kolonien aus der Nachtkultur und Transfer in ein Röhrchen mit 8 ml Proteosepepton Medium ergänzt mit 0,042% NaHCO 3, 0,01 M MgCl 2 und 1% PolyViteX.
  3. Schütteln, um die Bakterien für 1,25 Stunden bei 220 rpm, 37 ° C. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 2.684 g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und resuspendieren das Bakterienpellet mit 8 ml serumfreiem Medium. Vortex eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten.
  4. Zu Kulturdichte bestimmen, wird eine Verdünnung von 1:10 bei einer optischen Dichte (OD) von 600 nm zu messen. Stellen Sie die Bakteriensuspension auf eine OD 600 von 0,1.
    Hinweis: Diese Suspension ca. enthält. 1 x 10 8 CFU / ml.
  5. Um die Bakterienzellkonzentration bestätigen, verdünnte die Suspension schrittweise (1:10) bis zu einerVerdünnung von 10 -5 und Platte auf Schokoladen - Agar - Platten.
    Anmerkung: Ähnliche Verdünnungsreihen durchgeführt werden müssen Bakterienwachstumskurven zu berechnen.

7. Die Infektion von HIBCPP Zellen auf Zellkulturfilterpatronen und Bestimmung der bakteriellen Invasion durch Doppelimmunfluoreszenz

  1. Nachdem weiterhin eine epitheliale Gewebe unter Verwendung Cell-Zellkultur in Medium mit 1% FCS und 5 & mgr; g / ml Insulin, täglich Zellen messen. Wenn Zellen, die einen TEER von etwa 500 Ω x cm² erreicht haben, tragen die Infektion aus.
  2. Infizieren , die Zellen mit der hergestellten Bakteriensuspension bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10. Bewahren die infizierten Zellen in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für den angegebenen Zeitraum.
    Hinweis: Das MOI kann durch Berücksichtigung der Anzahl der Zellen pro Zellkulturfiltereinsatz bei Konfluenz (1,21 x 10 6 Zellen / cm 2) berechnet werden.
  3. Stoppen Sie den InfektIons durch dreimal mit 500 & mgr; l serumfreiem Medium (SFM), enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) in die Filterkammer Waschen angewendet, 1 ml zu dem unteren Abteil.
  4. Blockieren mit 500 ul SFM, das 1% BSA-Puffer in dem Filterfach und 1 ml in der unteren Kammer 20 min bei Raumtemperatur Anhaftung von Antikörpern gegen unspezifische Bindungsstellen zu verhindern.
  5. Inkubieren mit 100 & mgr; l primärer Antikörper anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) in dem Filterraum und 500 & mgr; l in der unteren Kammer für 20 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss.
  6. Waschen Sie die Zellen, die durch das Medium aus dem Filterfach Absaugen, übertragen Sie den Filtereinsatz mit einem gut vorbereitet mit 1 ml SFM, die 1% BSA und füllen Sie den entleerten Filterfach mit 500 & mgr; l SFM 1% BSA enthielt. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt.
  7. Fix-Zellen mit 500 ul 4% Formaldehyd in dem Filter compartment, 1 ml in der unteren Kammer für 10 min bei Raumtemperatur.
  8. Waschen Sie die Zellen, die durch das Medium aus dem Filterfach Absaugen, übertragen Sie den Filtereinsatz mit einem gut vorbereitet mit 1 ml PBS und füllen Sie den entleerten Filterfach mit 500 ul PBS. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt.
    Anmerkung: Die Proben können über Nacht in PBS bei 4 ° C gelagert werden.
  9. Cut feste Zellkultur filtert der Einsätze aus und waschen mit 250 ul PBS 1% BSA enthält. Inkubiere Zellen für 15 min bei Raumtemperatur mit 250 ul markiertem fluoreszierend (Anregungswellenlänge 594 nm) sekundären Antikörper Huhn-anti-Kaninchen (1: 500), extrazelluläre Bakterien zu färben.
    Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss.
  10. Permeabilisieren Zellen mit 250 ul PBS, enthaltend 1% BSA und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält.
  11. Inkubieren mit 250 & mgr; l primärer Antikörper anti N. meningitidis α-OMP (1: 200) für 30 min extra- und intrazellulären Bakterien zu färben. Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält.
  12. Anwenden 250 ul fluoreszenzmarkierten (Anregungswellenlänge 488 nm) sekundärer Antikörper (1: 500), gekennzeichnet fluoreszierend (Anregungswellenlänge 660 nm) Phalloidin (1: 250) und 4', 6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) ( 1: 50.000) 1 h lang bei Raumtemperatur zu färben extra- und intrazellulären Bakterien, Aktin-Zytoskelett und Kerne.
    Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss.
  13. Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält. Einbetten der Zellen Medium und lagern bei 4 ° C bis zur Untersuchung über Mikroskop bei der Montage.
  14. Bestimmen Sie Anzahl der Invasion Bakterien pro vordefinierten Feld. Tun Sie dies durch 20 Felder pro Filtermembran zu zählen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Invasion Bakterien.
    Hinweis: Multiplizieren Sie die mittlere Keimzahl in den 20 mikroskopischen Feldern mit einer Fläche zientient. Das Ergebnis drückt die Menge der gesamten Bakterien in einer 0,33 cm² Zellkulturfiltereinsatz. Diesen Wert durch die Menge der Bakterien in Medien während der Dauer der Infektion gezüchtet.

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Ergebnisse

Hier beschreiben wir die Kultivierung und Infektion von HIBCPP Zellen in einer umgekehrten Zellkultureinsatz System. Dieses Modell ermöglicht es uns Invasionsmechanismen und die zugrunde liegenden molekularen Signalwege von der basolateralen Zellseite zu studieren, eine physiologische Situation von Bakterien reproduzieren Verbreitung und Epithelzellen über den Blutstrom (Abbildung 1) eingeben.

Die HIBCPP Zel...

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Diskussion

Die Epithelzellen des CP bilden die BCSFB, die die CSF aus dem Blut 2,3 trennt. Wir stellten kürzlich die HIBCPP Zelllinie als funktionelles menschliches Modell des BCSFB. Die Zellen zeigen wichtige Barrierefunktionen der BCSFB in vitro, einschließlich der Entwicklung eines hohen Membranpotential, eine geringe Permeabilität für Makromoleküle sowie die Anwesenheit von kontinuierlichen Strängen von TJs 5. Die TJ-Proteine ​​tragen zu einem apikalen / basolateralen Polarität der Zel...

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)Life TechnologiesD1306
12-well platesStarlabCC7682-7512
24-well platesStarlabCC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMPThis antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany)
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
Bovine serum albumine (BSA)Calbiochem12659
Chocolate agar platesBiomerieux43109
Cytochalasin DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o PhenolredGibco11039-047
Dimethyl sulfoxideSigmaD2650
Fetal calf serum (FCS)Life Technologies10270106
FITC-InulinSigmaF3272
InsulinSigma19278
MgCl2Sigma2393
NaHCO3Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
Penicillin/StreptomycinMP Biomedicals1670049
PolyvitexBiomerieux55651
Proteose peptoneBD211684
Serum-free mediumGibco10902-096
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µmGreiner662630
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterileGreiner658175
Triton X-100SigmaT8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrodeMilliporeMERSSTX00

Referenzen

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