Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Zusammenfassung

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Zusammenfassung

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Blutkreislauf und sind an Entzündungsstellen schnell rekrutiert. Priming ist ein kritisches Ereignis, das die phagozytischen Funktionalität von Neutrophilen erhöht. Obwohl umfangreiche Studien die Existenz und die Bedeutung der neutrophilen Priming während der Infektion und Verletzungen enthüllt haben, bedeutet , diesen Prozess der Visualisierung in vivo nicht erreichbar gewesen. Das Protokoll bereitgestellt wird, ermöglicht die Überwachung des dynamischen Prozesses der Neutrophilen in lebenden Tieren Priming durch drei Methoden kombinieren: 1) Signal DsRed reporter - verwendet als ein Maß für Priming 2) in vivo - Markierung von Neutrophilen - erreicht durch Injektion von Fluoreszenz-konjugiertem anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoklonaler Antikörper (mAb) und 3) intravital konfokale Bildgebung. Oxazolon-induzierte Mausohr Hautentzündung, geeignete Sedierung von Tieren, wiederholte Injektionen von anti-Ly6G mAb und zurück: Mehrere wichtige Schritte sind in diesem Protokoll beteiligtention der Fokusdrift während der Bildgebung. Obwohl einige Einschränkungen beobachtet, wie die Grenze der kontinuierlichen Bilderzeugungszeit (~ 8 h) in eine Maus und das Austreten von Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran aus den Blutgefäßen in der Entzündungszustand liefert dieses Protokoll ein Grundrahmen für die intravital Abbilden grundierten Neutrophilen Verhalten und Funktion, die zur Prüfung von anderen Immunzellen in der Maus Entzündungsmodellen leicht erweitert werden kann.

Einleitung

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden und kurzlebig Leukozyten im Umlauf. Sie sind schnell zu den Standorten der Infektion oder Verletzung rekrutiert, wo sie als professionelle Phagozyten durch Freisetzung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffzwischenprodukte zusammen mit Granulat enthält , um antimikrobielle Peptide und Proteasen ¹ dienen. Während ihrer Rekrutierung, sind Neutrophile "grundiert" durch verschiedene Mittel , einschließlich mikrobielle Produkte, Lockstoffe, und inflammatorischen Zytokinen, was zu einer deutlich verbesserten Phagozyten Funktionalität bei der Ankunft an einem Ort der Entzündung ^2. Die Mechanismen von Neutrophilen Priming extensiv wurden in vitro untersucht ^3,4; jedoch dynamische Überwachung des Prozesses in vivo ist bisher nicht möglich gewesen.

Vor kurzem hat intravital Bildgebung eine wichtige Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik von biologischen Prozessen in lebenden Organismen werden. Intravital Bildgebung kann über herkömmliche Einphotonenanregung Mikroskopie (zB konfokale) oder Multiphotonen - Mikroskopie Ansätze ⁵ durchgeführt werden. Im Laufe der Zeit wurden in dieser Technik erzielt deutliche Verbesserungen erhöhte Bildauflösung ermöglicht, eine verbesserte Bildtiefe, verringerte Gewebelichtschäden und eine verbesserte Bildstabilisierung ^6,7. Aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit , dynamische Visualisierung von Zellmigration und Interaktion im Laufe der Zeit zu ermöglichen, hat Intravitalmikroskopie wurde ⁸ verschiedenen Bereichen der Studie in der Immunologie ausgiebig angewendet. Intravital Imaging ermöglicht Immunologen besser zu verstehen und in lebenden Tiermodellen Immunreaktionen sowohl auf zellulärer und molekularer Ebene zu kontextualisieren.

Jüngste Fortschritte in der transgenen sowie Knock-in-Reporter Mäusen haben nützliche Tools zur Verfügung gestellt, die dynamischen Verhalten von Neutrophilen in lebenden Tieren, die für die Überwachung. Lysozym M Promotor getriebene Enhanced Green Fluorescent Protein Knock-inMäuse wurden Motilität von Neutrophilen, Monozyten zu charakterisieren und Makrophagen während verschiedener Entzündungsprozessen einschließlich Extravasation, bakterielle Infektion und sterile Entzündung ^9-15 breit verwendet. Ferner wurden bei der Untersuchung der Aktivitäten der Neutrophilen extrazellulären regulierten Mitogen - Kinase und Proteinkinase A im entzündeten Darm ¹⁶ eingesetzten transgenen Mäusen eine zytoplasmatische Fluoreszenz - Resonanz - Energie - Transfer - Biosensor zum Ausdruck. Ein Mausmodell mit hoher Spezifität für die Fluoreszenz die Expression in Neutrophilen ist die Catchup Knock-in - Maus, die wie auch das fluoreszierende Protein tdTomato Cre - Rekombinase produziert, die sich zur Expression von lymphocyte antigen 6G (Ly6G) ¹⁷ gekoppelt ist. Visualisierung von Ly6G-defizienten Neutrophile über diesem Modell hat gezeigt , dass diese Zellen normale Funktionalität in einer Vielzahl von sterilen oder infektiösen in vivo Entzündungs ​​Kontexten ausüben. Transgene Mäuse, die DsRed fluoreszierende p ausdrückenrotein Gen unter der Kontrolle des Maus-interleuikin-1β (IL-1β) -Promotor (Pil1-DsRed) verwendet wurden, um die motile Verhalten von IL-1β produzierenden Zellen sichtbar zu machen - angenommen Neutrophile, inflammatorische Monozyten einschließen und aktivierte Makrophagen - Schwellen in entzündeter Haut ^18.

In vivo als Alternative dienen zur Verfolgung der zellulären und molekularen Verhalten von Neutrophilen in entzündeten Geweben Markierung kann. Nach intravenöser Injektion von niedrigen Dosen von fluoreszenzmarkierten anti-Gr-1 monoklonalen Antikörpers (mAb), die Rekrutierung Kaskade von Gr-1 ⁺ Neutrophilen in Maushautläsionen infiziert mit Staphylococcus aureus ^19. In - vivo - Verabreichung von Konjugaten wurde enthaltend visualisiert Streptavidin- konjugiertes 705 nm quantum dots und biotinyliertes anti-Ly6G mAb spezifisch etikettieren zirkulierende Neutrophile ^20. Darüber hinaus Endozytose solcher Konjugate in neutrophil Vesikel ermöglicht Verfolgung von Transporthochgeschwindigkeits Vesikel in Neutrophilen in das Interstitium migrieren. In vivo Markierung mit Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gegen P-Selektin - Glykoprotein - Ligand-1 (PSGL-1), L-Selectin (CD62L), Integrin & agr; M (CD11b ) und Chemokin (CXC - Motiv) Rezeptor 2 (CXCR2) in einem TNF-induzierten Entzündungsmodell wurde während der frühen Entzündung ²¹ die Regulationsmechanismen im Spiel erläutert. Polarisiert Neutrophilen herausragen PSGL-1 angereicherte Uropoden mit CD62L sich auf aktivierten Blutplättchen zu interagieren, was bei der Umverteilung von CD11b und CXCR2, Rezeptoren, die die Migration von Neutrophilen treiben und initiieren die Entzündung.

IL-1β ist eines der Gene , die Signatur ²² in grundierten Neutrophilen erhöht ist. In Pil1-DsRed Reporter - Mäuse, DsRed Fluoreszenzsignale (dh., Die Aktivierung von IL-1β - Promotor) positiv mit IL-1β - mRNA - Expression und IL-1β Protein - Produktion korrelieren. ^{18 Zur Überwachung wurde der Prozess der Neutrophilen - Grundierung, ein Intravitalmikroskopie - Verfahren mit Oxazolon (OX) beteiligt Induktion von Hautentzündung entwickelt im Pil1-DsRed Mausmodell folgende in vivo - Markierung von Neutrophilen mit Fluoreszenz-konjugierten anti-Ly6G mAb. Über dieses Modell ist es möglich, das Verhalten und die Funktion der neutrophilen Granulozyten grundiert in Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten und Störungen zu untersuchen.}

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Protokoll

Alle Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Toledo durchgeführt.

1. Phänotypisierung von Pil1-DsRed Mäuse

HINWEIS: Nachkommen werden von der Zucht heterozygot Pil1-DsRed Mäuse mit Wildtyp (WT) C57BL6 Mäuse erzeugt. Drei bis vier Wochen alte Welpen werden als bereit für die Phänotypisierung. Submandibular Blutung der Mäuse folgt einem festgelegten Protokoll mit geringfügigen Änderungen ^23.

1. Isolation von weißen Blutkörperchen aus dem Vollblut von Maus Pups
   1. In 20 ul Heparin zu je 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Erwerben Sie einen Welpen aus dem Käfig. Notieren Sie sich die Erkennungsmarke des Welpen. Es ist nicht erforderlich, Welpen, bevor sie aus der submandibular Vene Blutentnahme zu betäuben.
   3. Halten Sie Welpe durch Hals Genick und stechen Sie die submandibular Vene in the Backentasche mit einem 5 mm Lanzette verwenden. Tragen Sie eine ausreichende Kraft, um eine kleine Einstich zu schaffen, so dass Tropfen Blut aus dem Einstich ausstrahlen. Verwenden Sie für jeden Welpen eine neue Nadel.
   4. Sammeln Sie 3 bis 5 Tropfen Blut pro Welpe in einem Heparin-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen. Reinigen Sie die Einstichstelle und Druck auf die Hämostase erleichtern.
   5. Setzen Sie Welpen in neuen Käfig und beobachten für 30 Minuten vor dem Käfig in die Tieranlage zurück.
   6. Sammeln von Blut aus erwachsenen Mäusen eines bekannten Phänotyp als positive und negative Kontrollen.
   7. Hinzufügen 500 ul rote Blutkörperchen lysierende Puffer zu jedem Röhrchen, Wirbelrohre, und Inkubieren während 5 - 10 min auf Eis.
   8. Langsam 400-500 ul fötales Rinderserum (FBS) unterhalb der Zellsuspensionen in jedes Röhrchen. Eine klare Schnittstelle zwischen der oberen Schicht Zellsuspension und der unteren Schicht von FBS zu beachten.
   9. Cap Rohre und Zentrifuge Proben bei 1500 × g für 5 min.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.7 - 1.1.9 auf Pelzther entfernen roten Blutkörperchen. Wiederholen Sie nicht, wenn die Lyse das erste Mal, ausreichend ist. Das Pellet sollte schwierig sein, nach dem Zentrifugieren zu erkennen.
2. Lipopolysaccharide (LPS) Stimulation und Kultur
   1. Die Zellen in 200 ul kompletten Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium.
   2. Übertragen die Zellsuspension auf eine Durchflusszytometrie Röhre.
   3. Machen LPS Arbeitslösung von 10 ul LPS-Stammlösung Mischen (1 mg / ml) mit 990 ul komplettem RPMI-1640-Medium.
   4. Geben Sie 20 & mgr; l von 10 & mgr; g / ml LPS-Arbeitslösung zu 200 & mgr; l Zellsuspension.
   5. Kappenröhrchen lose und inkubieren Proben für 4 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2.
3. Durchflusscytometrieanalyse
   1. Öffnen Sie das Datenerfassungsprogramm für die Durchflusszytometrie. Richten Sie Erwerb Vorlage vor Erwerb zu probieren.
   2. Klicken Sie auf den Dot-Plot-Werkzeug in der Werkzeugpalette. Zeichnen Sie ein forward Streuung (FSC) vs Seitenstreuung (SSC) Plot. Stellen Sie die FSC und SSC Spannungsparameter in eine lineare Skala.
   3. Wählen Sie die niedrigsten Schwellen von FSC und SSC durch das Zytometer erlaubt. Bewerben Schwellen 200 und 50 für FSC und SSC sind.
   4. Innerhalb des FSC vs SSC Plot, ein Gate G1 ziehen, die Monozyten, Granulozyten und dendritischen Zellen und schließt Schmutz, rote Blutkörperchen und Lymphozyten enthält.
   5. Klicken Sie auf das Histogramm-Werkzeug in der Werkzeugpalette. Zeichnen Sie ein FL2 (rote Fluoreszenz-Kanal) Histogramm. Verwenden Sie einen negativen Kontrollprobe die Basislinie von FL2 Signale und eine positive Kontrollprobe zu setzen ein Tor zu zeichnen, um alle DsRed positive Ereignisse aufzunehmen.
   6. Auf der Fluidik Bedienfeld des cytometer, stellen Sie die Flüssigkeit Modus auf "RUN" und der Fließgeschwindigkeit auf "HALLO" (ca. 60 & mgr; l / min). Erwerben 10.000 Ereignisse pro Probe.
   7. Bestimmen Pup Phänotyp durch den Prozentsatz der DsRed-positiven Zellen aus der G1-Gate zu messen.

2. Die Induktion von Hautentzündung in Pil1-DsRed Mäuse

1. Anästhesieren Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion eines Anästhetikums Cocktail, enthaltend 100 mg / kg Ketamin, 10 mg / kg Xylazin und 1 mg / kg Acepromazin. Adäquat narkotisierten Mäusen zeigen keine Hinterpfote Rückzug bis Fuß Prise.
2. Tragen Sie Haarentfernungs-Creme auf die dorsale Oberfläche beider Ohren der Maus. Warten Sie 30 Sekunden bis 1 Minute. Wischen Sie Ohr Oberfläche mit Wasser benetzten Baumwolle und an der Luft trocknen.
3. Messen Sie die Ohrdicke Mikrometer verwendet und ersetzen Maus in einem separaten Käfig. Beachten Sie, bis aus der Narkose (~ 15 - 30 min). Zu lösen, indem die Haarentfernung Produkt induzierte Hautentzündung, lassen Sie die Maus für 3 Tage ruhen, bevor weitere Experimente durchgeführt.
4. Bereiten 1,25% (w / v) OX von in 1 ml Aceton 16,7 mg OX Lösen und Mischen 750 ul OX / Aceton-Lösung mit 250 ul Olivenöl. Bereiten Trägerlösung 750 ul Aceton mit 250 durch Mischen &# 181; l Olivenöl.
5. Re-betäuben Maus durch ip-Injektion von Anästhetikum Cocktail (2.1). Messen Sie die Ohrdicke wie zuvor.
6. Bewerben 12,5 ul von 1,25% OX auf jeder Seite des rechten Ohres. Bewerben 12,5 ul Aceton / Olivenöl Fahrzeug Lösung auf jeder Seite des linken Ohr.
7. Halten Sie die Maus von Käfiggenossen trennen, bis sie vollständig Beleidigung seine Ohren von anderen Mäusen zu verhindern gewonnen, dann ersetzen Sie die Maus in ihren ursprünglichen Käfig und zurück zur Tierhaltung Möglichkeiten.
   HINWEIS: Haarentfernung in kleinere Hautentzündung nach durch Änderung der Ohrdicke führen kann. Diese kleine Entzündung wird 3 Tage später gelöst durch normale Ohrdicke bestätigt. Nach der topischen Anwendung für 24 Stunden, OX-behandelten Ohren zeigen signifikant (p <0,01) im Vergleich Fahrzeuglösung allein behandelten Ohren Schwellung.

3. Die Markierung von Neutrophilen in Pil1-DsRed Mäuse

HINWEIS: In - vivo - Markierung von Neutrophilen durch eine niedrige Dosis fluorescence-konjugiert Neutrophilen-spezifischen mAb folgt eine kürzlich entwickelte Protokoll ^19. Retro-Orbital - Injektionen werden nach einem festgelegten Protokoll mit einigen Modifikationen ²⁴ durchgeführt.

1. Bereiten anti-Ly6G mAb Arbeitslösung durch 10 ul 0,5 mg Verdünnung / ml Alexa Fluor 647-konjugiertem anti-Ly6G mAb (Klon 1A8) in 90 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
2. Transfer von 100 & mgr; l anti-Ly6G mAb-Arbeitslösung (50 ug / ml) in eine U-100 Insulin-Spritze mit 28 Gauge-Nadel.
3. Anesthetize einen erwachsenen Pil1-DsRed Maus durch ip-Injektion des zuvor Anästhetikum Cocktail beschrieben (2.1). Setzen Sie den narkotisierten Maus Bauch auf einer sauberen Arbeitsplatte nach unten.
4. Wenden Sie sanft nach unten Druck auf die Haut dorsalen und ventralen einer Maus Auge teilweise den Augapfel aus der Steckdose herausragen.
5. Setzen Sie vorsichtig die Nadel, Fase nach unten, in einem Winkel von ca. 30 ° am inneren Augenwinkel in die Retro-OrbitalSinus.
   fühlen Druck, Durchdringung und erleichtert Widerstand, sobald die Nadel Einsätze in den Sinus Der Bediener kann: Hinweis.
6. Langsam und gleichmäßig injizieren 100 ul anti-Ly6G mAb-Arbeitslösung (5 ug mAb / Maus / Injektion) in der Maus. Entfernen Sie schnell die Nadel. Eine kleine Menge der Blutung schlägt eine erfolgreiche Injektion.
7. Sofort 1,25% OX und Fahrzeug-Lösung auf der rechten und linken Mausohren gelten.
8. Nach 8 Stunden, zu verwalten 100 ul frisch anti-Ly6G mAb Arbeitslösung vorbereitet (5 ug mAb / Maus / Injektion) über retro-orbitale Injektion in die gleiche Maus.
9. Der Blutgefäße, unmittelbar vor der Bildgebung zu visualisieren, zu verwalten 100 ul 30 mg / ml Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -konjugiertem Dextran (150 kDa) durch retroorbitale Injektionszwecke.

4. Intra Imaging von Neutrophilen-Priming in Pil-1-DsRed Mäuse

1. Anästhesieren Maus mit ip-Injektion von Anästhetikum-Cocktail (2.1).0; Bewerben veterinär Salbe Maus Augen Trockenheit während der Narkose für die Bildgebung zu verhindern.
   1. Vorbereitung 1 ml Halbdosis Anästhetikum Cocktail von 500 ul ursprünglichen Anästhetikum Cocktail mit einem gleichen Volumen von PBS verdünnt.
   2. Übertragen halbe Dosis Betäubungsmittel Cocktail zu 1 ml Spritze mit einem Schmetterling 27-Gauge-Nadel.
   3. Setzen Sie die Nadel von Schmetterling in Maus Bauch intraperitoneal und befestigen Sie die Schmetterlingsflügel auf den Bauch durch Abkleben.
2. Legen Sie ein Deckglas in der Mitte der Abbildungsstufe. Kleben der Kanten des Deckglases es in Position zu halten.
3. Geben Sie einen Tropfen PBS auf der ventralen Oberfläche des Mausohr sowie auf dem Deckglas.
4. Position narkotisierten Maus mit seinem Ohr über das Deckglas. Montieren Sie die Spitze des Ohres, Rückenseite nach unten, gebildet, indem das Ohr zwischen dem Deckglas und einem Glasträger, auch an Ort und Stelle über die Tape gehalten.
5. Schalten Sie auf einem Multi-Laser-Fluoreszenz-Konfokalmikroskop und alle damit verbundenen equipment. Schalten Sie die Raumbeleuchtung Umgebungslicht zu minimieren.
6. Öffnen Sie die Bildaufnahme-Software. Wählen Sie die Laserkanäle für den Nachweis von Fluoreszenzfarbstoffen im Dye-Listenmenü.
7. Stellen Sie den Fokus auf das entzündete Ohr Haut durch Beobachtung der grünen Signale aus den Blutgefäßen und rote Signale von den DsRed ⁺ Zellen durch Okular.
8. Führen Sie einen schnellen Scan mit Scangeschwindigkeit von 2 & mgr; s / Pixel und einer Auflösung von 512 × 512 Pixeln. Wählen Sie eine Pseudo für jeden Kanal in der Live-View-Menü. Stellen Sie den Fokus Knopf, um das Ende zu setzen und den Ort der Scanvorgang zu starten.
9. Führen Sie langsam Scans mit Scangeschwindigkeit von 4 - 8 & mgr; s / Pixel und einer Auflösung von 800 × 800 oder 1024 × 1024 Pixel. Stellen Sie die Hochspannung, Verstärkung und Offset für jeden einzelnen Kanal der Intensität der Signale zu maximieren, während die Sättigung (rote Punkte) zu vermeiden. Es sollte nur wenige rote Pixel in jedem Kanal sein.
10. Erstellen dreidimensionaler Bildsätze durch Abtasten the Ohr Haut oberflächlich in das Stratum corneum beginnen und nach unten mit x, y, z Volumen von 317 & mgr; m × 317 & mgr; m × 30 & mgr; m (40X-Objektiv) voran, 635 & mgr; m × 635 & mgr; m × 30 & mgr; m (20fach-Objektiv), oder 1270 & mgr; m × 1270 & mgr; m × 50 & mgr; m (10X-objektiv) bei 2 & mgr; m z-Schritten.
    HINWEIS: Das Stratum corneum die äußerste Schicht der Epidermis ist und leicht lokalisiert auf seine starke Autofluoreszenz-Signal basieren können.
11. Im Zeitraffer-Imaging Experimente, Aufzeichnung dreidimensionale Bilder alle 2 oder 4 min für bis zu 8 Stunden.
12. Intermittently, wie Maus aus der Narkose zu erholen beginnt, basierend hinwies, die die Zuckungen Whiskers auf der Beobachtung, verwalten von 5 bis 10 & mgr; l halbe Dosis Narkose Cocktail durch Butterfly-Nadel.
    HINWEIS: der Anästhesie Dosis vorsichtig - Überdosis verursachen Maus Tod. Alternativ könnte in einem Gefäß Inhalationsanästhesie an der Maus für kurzfristige Anästhesie und angewendet werdenNasenkonus könnte für die Langzeitbilderzeugung verwendet werden.
13. Entfernen Sie die narkotisierten Maus von der Bühne bei der Abbildung vollständig ist. Nehmen Sie Band und entfernen Butterfly-Nadel aus dem Bauch der Maus. Bringen Sie die Maus in einen separaten Käfig im Tier Gehäuse Möglichkeiten.
    HINWEIS: Für kurzfristige Bildgebung (<1 Stunde), Mäuse erholen vollständig aus der Narkose schnell in 1-3 Std. Für die Langzeitbildgebung (~ 8 h), erholen Mäuse langsam, mit einer typischen Erholungszeit von 12 bis 16 Stunden. Somit ist die orale Verabreichung Wasser zumindest mehrmals während der Erholungsphase empfohlen schwerer Dehydrierung zu verhindern.
14. Prozess Imaging - Datensätze, einzelne Zellen verfolgen, erzeugen Migrationspfade, und berechnen Sie die Direktionalität und die Geschwindigkeit der Zellmigration unter Verwendung von Bildanalysesoftware ^25.

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Ergebnisse

Screening von Pil1-DsRed-Mäusen basiert auf der phänotypischen DsRed Fluoreszenzsignal durch ihre peripheren Blutleukozyten mittels Durchflusszytometrie durchgeführt produziert. LPS - Stimulation bekannt ist IL-1β - Produktion in myeloischen Zellen , einschließlich Neutrophile, Monozyten und dendritischen Zellen ^26-28 induzieren. Somit werden isolierte Leukozyten 4 h mit LPS inkubiert vor der Zytometrie Analyse fließen. Myeloischen Zellen für die Zirkulation auf Basis v...

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Diskussion

Das Ziel dieser Studie ist es, eine Technologie zur Überwachung des Prozesses der Neutrophilen-Priming in lebenden Tieren zu entwickeln, die noch nicht von den derzeit verfügbaren Techniken erfüllt. Um dieses Ziel zu erreichen, drei etablierten Methoden durchgeführt werden : 1) Induktion von Hautentzündung in IL-1β Promotor getriebene DsRed Reportermäusen als Maß für die Grundierung, 2) in vivo - Markierung von Neutrophilen mit niedrigen Dosen von Fluoreszenz-konjugiertem anti-Ly6G mAb und 3) intravita...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer	Lonza	10-548E
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamine hydrochloride	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Hair-removal cream	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
Butterfly infusion set (27 G needle)	BD	387312
FACSCalibur cytometer	BD
CellQuest Pro software	BD
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging