Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Zusammenfassung

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Zusammenfassung

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Einleitung

In Nervenverletzungen sind die proximalen und distalen Nervenstümpfe oft von der direkten Neuausrichtung Nervenfaszikel verhindert aufgrund der Läsionsstelle ^1-2. Normalerweise werden Axon Striche hoch geordnete und ausgerichtete Bündel von Axonen zusammen, die komplexe Netzwerke von Konnektivität bilden. Allerdings ist die Nervenregeneration ein chaotischer Prozess wegen schlecht organisiert Axon Ausrichtung ^3-4. Um daher eine ausreichende Anzahl von regenerierenden Axonen zu erzeugen, das der Läsionsstelle brücken, ist es notwendig, gut organisierte axonalen Ausrichtung zu induzieren. Darüber hinaus begleitet Demyelinisierung Nervenverletzunge....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle Verfahren zur Isolierung der Zellen wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Michigan State University genehmigt.

1. Herstellung von vorgespannter anisotroper Oberfläche

1. Mischen Sie eine 10: 1-Lösung von Base und Härter und gießen Sie die Mischung in eine Gewebekulturschale (12 cm Durchmesser). Verwenden Sie 4.900 mg Base und 490 mg Mittel für die gesamte Vernetzungs Mischung härtet.
2. Halten Sie die Gelmischung unter Vakuum für 20 min Luftblasen zu entfernen.
3. Legen Sie das Gel-Gemisch in dem Ofen über Nacht Aushärtung bei 60 ° C.
4. Nachdem die Membran aushärtet PDMS, Behandlung der Oberfläche....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Die vorgedehnten Zellkultursystem DRG axon Ausrichtung gefördert ^10. DRG-Neuronen wurden auf vorgestreckten und ungereckten Oberflächen für 12 Tage. Die Axone wurden für β-III-Tubulin gefärbt ihre Ausrichtung zu zeigen. 2 vergleicht axon Ausrichtung auf den vorgestreckten und ungestreckte PDMS Substrate nach 12 Tagen Kultur. Die DRG Axone parallel zur Streckrichtung ausgerichtet sind, während sie zufällige Ausrichtung zeigte und bildeten ein miteinande.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Zur Induktion Axon Ausrichtung auf vorgedehnte Oberfläche gibt es zwei wichtige Schritte: 1) die PDMS-Membran muss flach sein und homogener Dicke; und 2) Gliazellen müssen aus dem DRG entfernt werden. Nach dem Mischen in einem Ofen die PDMS und Vernetzer und der Härtung sollte das vernetzte PDMS Gel sorgfältig ein Verkanten zu vermeiden, auf einer flachen Tischplatte und behandelt gehalten werden. Die Sauerstoffplasmabehandlung der PDMS Membran sollte innerhalb von 6 h von PLL-Beschichtung eingehalten werden, da die.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.