Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Zusammenfassung

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (T_reg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the T_reg cells.

Zusammenfassung

Regulatory T (T _reg) Zellen, die Foxp3 als Transkriptionsfaktor exprimieren, sind Untergruppen von CD4 ⁺ T - Zellen. T _reg - Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immuntoleranz und Homöostase Wartung durch die Immunantwort regulieren. Die primäre Rolle der T _reg Zellen ist , die Proliferation von Effektor - T (T _eff) Zellen und die Produktion von Zytokinen wie IFN-γ, TNF-α und IL-2 zu unterdrücken. Es wurde gezeigt , dass T _reg Zellen die Fähigkeit , die Funktion von T - Zellen zu hemmen _eff während persistent Pathogen - Infektion und der Entwicklung von Krebs verbessert. Um die Funktion von T _reg Zellen unter ruhenden oder entzündeten Bedingungen, die eine Vielzahl von in - vitro - Unterdrückung Tests unter Verwendung von Maus oder humanen T - _reg - Zellen klären entwickelt worden. Das Hauptziel dieser Studie ist es, ein Verfahren zu entwickeln , um die Unterschiede im Phänotyp und unterdrückende Funktion zwischen ruhenden und aktivierten T _reg zu vergleichenZellen. Um aktivierten T - _reg - Zellen wurden die Mäuse infiziert mit lymphatischer choriomeningitis Virus (LCMV) Klon 13 (CL13), eine chronische Belastung von LCMV isolieren. T _reg Zellen aus der Milz von LCMV CL13-infizierten Mäusen isoliert zeigten sowohl die aktivierten Phänotyp und verbesserte suppressive Aktivität gegenüber T - Zellen aus naiven _reg Mäusen isoliert ruht. Hier beschreiben wir die Basisprotokoll für ex vivo - Phänotyp - Analyse aktivierten T - _reg - Zellen unterscheiden von T _reg ruhenden Zellen. Weiterhin beschreiben wir ein Protokoll für die Messung der suppressive Aktivität von vollständig aktivierten T _reg Zellen.

Einleitung

Regulatorische T (T _reg) Zellen exprimieren forkhead box P3 (Foxp3) als Transkriptionsfaktor für ihre Entwicklung und Funktion ^1. Zusätzlich exprimieren T _reg Zellen verschiedene andere Moleküle wie CD25 ^2, Lymphozytenaktivierung Gen 3 (LAG-3) ^3, Glucocorticoid-induzierter Tumor necrosis factor receptor ⁴ und zytotoxische T-Lymphozyten assoziiertes Protein 4 (CTLA-4) ⁵ auf ihrer Oberfläche oder intrazelluläre Region. Während einer chronischen Infektion mit verschiedenen Arten von Krankheitserregern wie Viren ^6,7, Bakterien ^8,9 und Parasiten ^10-12, oder im Verlauf der Krebsentwicklung ^13,14 geworden T _reg Zellen in aktivierten Zellen differenziert, verbesserte Unterdrückungsfunktion anzeigt Targeting - Effektor CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T - Zellen. Eine Reihe von Arbeiten haben vorgeschlagen , dass erweitert und aktivierten T - _reg - Zellen auf die Beeinträchtigung der CD8 ⁺ T - Zell - respons beitragene während Freund Retrovirus (FV) Infektion ^15-17. FV-induzierte T - Zellen hemmen _reg IFN-γ oder Granzym B Expression und zytotoxische Reaktivität von CD8 ⁺ T - Zellen ^15-17. Darüber hinaus wurde in einem Herpes simplex - Virus - Infektionsmodell berichtet geführt , die Depletion von CD4 ⁺ CD25 ⁺ T - Zellen in _reg Expansion der virusspezifischen CD8 ⁺ T - Zellen und schwere Gewebeschäden durch Infiltration von immunopathogenen CD4 ⁺ T - Zellen ^18-20.

Mäuse chronisch mit dem 13 - Stamm von lymphatischer choriomeningitis Virusklon infiziert (LCMV CL13) ^21-24 haben den Phänotyp und die Funktion der Effektor - T - Zellen (T _eff) und T _reg Zellen während der chronischen Virusinfektion weit verbreitet zu charakterisieren. Während persistent LCMV - Infektion, Virus-spezifischen T - Zellen _eff schrittweise ihre Effektor - Funktion verlieren und erschöpft T (T _exh) Zellen werden. Auf der anderen Seite, T_reg Zellen verstärken ihre Fähigkeit , ²⁵ Virus-spezifischen T - Zell - Antwort zu unterdrücken. Die Abnahme der Funktionsfähigkeit der T _eff Zellen kann durch verschiedene Faktoren wie Aufregulation von inhibitorischen Rezeptoren auf T _eff Zellen veränderte Funktion von Antigen-präsentierenden Zellen, die Herstellung von immunregulatorischen Zytokine und erhöhter Frequenz oder verstärkte Funktion von T _reg erklärt Zellen ^26. Unter den Faktoren , die bei T - Zell - Unterdrückung, den programmierten Zelltod - Protein-1 (PD-1) exprimierenden T _exh Zellen und T - _reg - Zellen wurden als Kennzeichen der Antigen Persistenz und unterdrückende Umwelt weit betrachtet. Vor kurzem wurde berichtet , dass die Blockade des PD-1 - Weg und Ablation von T _reg Zellen verbesserte T - Zell - Funktion führen und Viruslast während LCMV chronischen Infektion ²⁷ verringert. Darüber hinaus werden T _reg Zellen während einer chronischen Infektion von Mäusen mit LCMV aktiviert ^23,25 und ihre unterdrückende Funktion ²⁵ verstärkt. PD-1 ist stark auf T - Zellen exprimiert _reg sowie T _exh Zellen und der Grad der PD-1 durch T - Zellen exprimiert _reg korreliert mit der Stärke ihrer suppressive Funktion T - Zell - Proliferation ²⁵ zu hemmen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren mit den Merkmalen von aktivierten T - _reg - Zellen von Mäusen , infiziert mit LCMV CL13 und ruhenden T _reg Zellen isoliert aus naiven Mäusen isoliert zu vergleichen. Weiterhin erläutern wir eine Reihe von Prozessen aktiviert T _reg Zellen zu trennen und ihre ex vivo Phänotyp zu untersuchen, sowie ihre suppressive Aktivität in vitro zu messen.

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Protokoll

In dieser Studie wurden die Mäuse in einem spezifischen Pathogen freie Einrichtung des Yonsei Laboratory Animal Research Center of Yonsei University gehalten. mit von der International genehmigten Protokollen Animal Care und Use Committee des Yonsei Laboratory Animal Research Center an der Yonsei University Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den koreanischen Food and Drug Administration Richtlinien durchgeführt.

1. Herstellung der Lösungen

1. Bereiten 2% RPMI-Medium durch Verdünnen fötalem Rinderserum (FBS) und 2% Penicillin-Streptomycin und 1% in RPMI
2. Bereiten komplettem RPMI-Medien. Zu RPMI Medien Hinzufügen 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 1% L-Glutamin und 50 uM 2-Mercaptoethanol.
3. Bereiten fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Puffer. so, Ergänzungs phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% FBS zu tun.
4. Bereiten Sie T-Zell-Isolationspuffer. Dazu ergänzen PBS mit 2% FBS und 2 mM ethylenediaminetetraacetic Säure.

2. Isolierung von Milzlymphozyten

1. Entfernen der Milzen von naiven oder LCMV CL13-infizierten Mäusen , wie zuvor beschrieben , ¹⁹ und legen sie in 60 mm x 15 mm Petrischalen , die 10 ml von 2% RPMI - Medien.
   HINWEIS: In dieser Studie Experimenten 5 bis 6 Wochen alten C57B1L / 6J weibliche Mäuse erhielten 2 x 10 ⁶ plaquebildenden Einheiten (pfu) von LCMV CL13 durch intravenöse Injektion über die Schwanzvene. Opfern , um die Mäuse am Tag 16 nach der Infektion (16 d pi) ^25. Analyse ge angepassten naive Mäuse wurden am selben Tag.
2. Legen Sie eine Zelle Sieb in einen 50-ml-Röhrchen und spülen Sie ihn mit 2 ml 2% RPMI Medien. Legen Sie die Milz auf die 70 & mgr; m Zellsieb und schleifen den Kolben einer Spritze. Spülen Sie die Zelle Sieb mit 2 ml 2% RPMI Medien und entfernen Sie sie aus dem 50-ml-Tube.
3. Füllen des Röhrchens mit 2% RPMI-Medium und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendierenZellpellet in 1 ml Lysepuffer ACK. Inkubieren der Proben bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
   HINWEIS: Das Volumen der ACK Lysepuffer oben für eine Milz angegeben ist. Scale up das Volumen entsprechend für gepoolte Milzproben.
4. Füllen des Röhrchens mit 2% RPMI-Medium und Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in einer Dichte von 1 x 10 ⁷ Zellen / ml in kompletten RPMI - Medium.
   HINWEIS: Für die Live-Zellzählung, Flecken Zellen mit Trypanblau und nur Zellen leben zählen, die nicht gefärbt werden mit Hämozytometer.

3. Phänotypisierung von Splenic Herkömmliche T (T _conv) Zellen und T - Zellen _reg

HINWEIS: Vor Isolierung T _reg Zelle, untersuchen den Phänotyp splenic von naiven oder infizierten Mäusen isoliert Lymphozyten durch die Zellen mit verschiedenen Antikörpern Färbung und Durchflusszytometrie sie durch die Strömung zu analysieren.

1. Dann werden 50 & mgr; l der Zellen(5 x 10 ⁵ Zellen) unter insgesamt Milz- Lymphozyten in jede Vertiefung einer neuen U-Boden - 96-Well - Platte und fügen 150 ul Puffer FACS pro Vertiefung. Zentrifuge bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C.
2. Überstand verwerfen. Rühre das Zellpellet und mit 200 & mgr; l FACS-Puffer pro Vertiefung. Zentrifuge bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C (2 mal).
3. Bereiten Sie die Antikörper-Cocktail für die Färbung Zelloberflächenmarker in 50 & mgr; l FACS-Puffer pro Vertiefung mit den folgenden Antikörpern und Reagenzien. Anti-CD4 violetten Farbstoff, Anti-CD25 grünen Farbstoff, Anti-PD-1 violetten Farbstoff, Anti-CD8-PerCP Cy5.5 Farbstoff und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz nahen Infrarot (IR) fluoreszierenden Reaktivfarbstoff.
   HINWEIS: Um den Phänotyp von aktivierten T - _reg - Zellen zu analysieren, anti-CD103 ^23,25 kann für Zelloberflächenmarker Färbung hinzugefügt werden.
4. Zellpellet mit 50 ul Antikörper-Cocktail pro Vertiefung. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. Wasche die Zellen zweimal mitFACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C.
5. Nach dem letzten Waschschritt, dekantiert den Überstand und fixieren die Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C mit 100 ul Puffer Fixierung hergestellt gemäß dem Protokoll des Herstellers.
6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Permeabilisations-Waschpuffer (hergestellt nach dem Protokoll des Herstellers) durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C.
7. Bereiten Sie die Antikörperlösung für die intrazelluläre Foxp3-Färbung und Zellpellet mit 50 ul Anti-Foxp3 Antikörperlösung.
   HINWEIS: weiter Um die Phänotypen von T _conv und T _reg Zellen analysieren, anti-CTLA kann in diesem Schritt hinzugefügt werden.
8. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C und wiederholen Sie Schritt 3.6. Nach dem letzten Waschschritt, Resuspendieren des Zellpellets in 200 & mgr; l FACS - Puffer und den Phänotyp der Zellen durch Durchfluss - Zytometer ²⁵ untersuchen.
9. Tor der lebenden Zellen population. Um die Phänotypen von T _conv Zellen während der LCMV - Infektion CL13 analysieren, untersuchen die Häufigkeit von Foxp3 ^- PD-1 ⁺ Zellen unter CD4 ⁺ oder CD8 ⁺ T - Zellen.
   HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der Foxp3 ^- PD-1 ⁺ mehr als 50% sowohl in CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T - Zell - Populationen mit 16 d pi mit LCMV CL13.
   1. Um die Frequenz und Phänotypen von T _reg Zellen analysieren, untersuchen Sie die Frequenzen von Foxp3 ⁺ oder Foxp3 ⁺ PD-1 ⁺ Zellen unter CD4 ⁺ T - Zellen.
      HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der Foxp3 ⁺ Foxp3 ⁺ bzw. PD-1 ⁺ Zellen ist mehr als 20% der CD4 ⁺ T - Zellpopulation, respectively.

4. Isolierung von CD4 ⁺ CD25 ⁺ T - Zellen _reg

HINWEIS: Die Volumina aller Reagenzien unten angegeben sind für eineAusgangszellzahl von 1 x 10 ⁷ gesamt Splenozyten.

1. Bereiten Sie die Zellen, wie in Abschnitt 2 unter Verwendung von naiven und LCMV chronisch infizierten Mäusen beschrieben. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml der T-Zellisolierungspuffer. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Zellpellet in 40 ul Puffer.
2. Für CD4 ⁺ T - Zell - Anreicherung der magnetischen Zellseparationssystem, 10 ul Biotin-Antikörper - Cocktail hinzufügen und gut mischen. Inkubieren für 10 min bei 4 ° C.
3. Zugabe von 30 ul Puffer, 20 ul von Anti-Biotin - Mikrokügelchen für die Kennzeichnung von nicht-CD4 ⁺ T - Zellen und 10 & mgr; l von CD25-PE - Antikörpers zur Fluoreszenzmarkierung von CD25 ⁺ Zellen. Gut mischen und Inkubation für 15 min im Dunkeln.
4. 2 ml Puffer und übergeben die Zellen durch ein 40 & mgr; m Zellsieb in ein neues 50 ml Rohrzelltrümmer zu entfernen. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C.Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l Puffer mit einer Dichte von bis zu 1,25 x 10 ⁸ Zellen.
5. Übernehmen Sie die Zellen auf die Säule und sammeln die nicht markierten Zellen, die die Säule passieren. Die Säule wird durch Zugabe von 2 ml Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der isolierten CD4 ⁺ T - Zellen in 90 ul Puffer.
6. Für magnetische Markierung von CD25 ⁺ Zellen, mit 10 & mgr; l anti-PE - Mikrokügelchen, gut mischen und bei 4 ° C für 15 min im Dunkeln inkubiert.
7. 2 ml Puffer und wasche die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l Puffer mit einer Dichte von bis zu 1 x 10 ⁸ Zellen.
8. Um die CD4 ⁺ CD25 ⁺ T - _reg - Zellen anreichern, gelten die Zellen auf die Säule für eine positive Selektion, und waschen Sie die column durch Zugabe von 2 ml Puffer. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
9. Wenn die Säule nach dem letzten Waschschritt leer ist, fügen Sie 1 ml Puffer auf die Säule, und spülen Sie den Kolben der magnetisch markierten CD4 ⁺ CD25 ⁺ Zellen.
10. Wiederholen Sie die Schritte 4,8-4,9 um die Reinheit der isolierten CD4 ⁺ CD25 ⁺ T _reg Zellen zu verbessern. Waschen der Zellen mit FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der isolierten CD4 ⁺ CD25 ⁺ T _reg Zellen bei einer Konzentration von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml in kompletten RPMI - Medium.
11. Um die Reinheit der isolierten CD4 ⁺ CD25 ⁺ T - _reg - Zellen zu überprüfen, können 2 x 10 ⁵ Zellen aus der Summe der isolierten CD4 ⁺ CD25 ⁺ T - _reg - Zellen. Beflecken die Zellen mit 50 & mgr; l FACS-Puffer, enthaltend anti-CD4-FITC und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz nahen IR-fluoreszierenden Reaktivfarbstoff.
    HINWEIS: CD25 wurde bereits mit PE während der Isolierung gekennzeichnet.
12. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. Waschen der Zellen mit FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Nach dem Waschen des Zellpellets in 100 & mgr; l FACS-Puffer resuspendiert und die Reinheit mittels Durchflusszytometrie überprüfen.
13. Tor der Live-Zellpopulation. Um die Reinheit von T _reg Zellen analysieren, bestätigen den Prozentsatz der CD4 ⁺ CD25 ⁺ Zellen.
    HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der CD4 ⁺ CD25 ⁺ Zellen unter gereinigter Zellen über etwa 80%.

5. Isolierung von CD8 ⁺ T - Zellen und Labeling of CD8 ⁺ T - Zellen

HINWEIS: Die Volumina aller Reagenzien unten angegeben sind für eine Startzellzahl von 1 x 10 ⁷ Splenozyten insgesamt.

1. Vorbereitung der Zellen, wie in Kapitel 2 unter Verwendung von naiven Mäusen beschrieben. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml der T-Zellisolations Schwabbelscheibeer. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Zellpellet in 40 ul Puffer.
2. Für CD8 ⁺ T - Zell - Isolierung der magnetischen Zellseparationssystem, 10 ul Biotin-Antikörper - Cocktail für Nicht-CD8 ⁺ T - Zell - Markierung hinzufügen und gut mischen. Inkubieren Sie für 5 min bei 4 ° C.
3. Zugabe von 30 ul Puffer und 20 ul Anti-Biotin-Mikrokügelchen. Gut mischen und Inkubation für 10 min bei 4 ° C.
4. Übernehmen Sie die Zellen auf die Säule und sammeln die nicht markierten Zellen, die die Säule passieren. Die Säule wird durch Zugabe von 2 ml Puffer dreimal.
5. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der isolierten CD8 ⁺ T - Zellen in 2 ml Puffer.
6. Um die Reinheit der isolierten Zellen kontrollieren, bereiten 50 ul Antikörperlösung in FACS-Puffer. Resuspendieren der 2 x 10 ⁵ Zellen unter isolierten CD8 ⁺ T - cells in 50 ul Antikörperlösung.
   HINWEIS: Antikörper-Lösung herzustellen, fügen Anti-CD8-FITC, und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz (nahen IR-fluoreszierenden Reaktivfarbstoff) in FACS-Puffer.
7. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. Waschen der Zellen mit FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Nach dem Waschen Zellpellet in 100 ul FACS-Puffer, und überprüfen Sie die Reinheit der Zellen mittels Durchflusszytometrie.
8. Tor der Live-Zellpopulation. Um die Reinheit von CD8 ⁺ T - Zellen zu überprüfen, bestätigen den Prozentsatz der CD8 ⁺ T - Zellen.
   HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der CD8 ⁺ Zellen unter den Zellen gereinigt wird über etwa 90%.
9. Hinzufügen PBS zu den isolierten CD8 ⁺ T - Zellen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. Resuspendieren der isolierten CD8 ⁺ T - Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 ⁷ Zellen / ml in PBS.
10. Um die CD8 ⁺ T CE - Kennzeichnunglls für die in vitro - Suppression Assay Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff in PBS verdünnen , um eine Konzentration von 5 uM bei RT zu erhalten.
    HINWEIS: Die ungefähre Anregungs- und Emissionspeaks des Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff in der Studie verwendet werden, sind 405 und 450 nm, respectively.
11. Gut mischen gleiche Volumina der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff (5 & mgr; M) und der Zellsuspension (1 x 10 ⁷ Zellen / ml von CD8 ⁺ T - Zellen) in einem 15 ml - Röhrchen, und Inkubieren bei 20 min bei 37 ° C. Mischen Sie den Schlauch alle 10 min.
12. Füllen Sie den Schlauch mit kaltem komplettem RPMI Medien auf, und lassen Sie das Röhrchen für 10 min bei RT. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml mit vorgewärmten RPMI Komplettmedium. Inkubieren der Zellen für 15 min bei RT.

6. Einrichten der In - vitro - Suppression - Test unter Verwendung CD4 ⁺ CD25 ⁺ T _{reg und CD8 ⁺ T - Zellen}

1. Zur Herstellung von anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen, übertragen das entsprechende Volumen von magnetischen Kügelchen auf ein 15 ml Röhrchen (2,5 ul / 1 x 10 ⁵ Zellen). Fügen Sie ein gleiches Volumen von PBS und mischen. Waschen durch Zentrifugation bei 300 g für 2 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Verdünnen Sie die magnetischen Kügelchen in komplettem Medium (50 & mgr; l / Well).
2. Aliquot von 50 & mgr; l CD4 ⁺ CD25 ⁺ T _reg Zellen pro Vertiefung U-Boden 96-Well - Platte (1 x 10 ⁵ Zellen / Vertiefung). Je 50 ul von CD8 ⁺ T - Zellen als Responder - T (T _bzw.) Zellen pro Vertiefung (1 x 10 ⁵ Zellen / Vertiefung). In 50 ul des verdünnten anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen in pro Vertiefung.
   HINWEIS: In diesem Schritt Etikett und Kontrollvertiefungen setzen sich wie folgt zusammen : "nicht - stimulierten CD8 ⁺ T - Zellen nur" ohne anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen; "CD8 ⁺ T - Zell - only" mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen; "CD8 ⁺ T - Zellen erst"Mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen;". T _reg Zelle nur "mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen T _reg Zellen können durch vollständige Medien und co-kultiviert mit T _bzw. Zellen in einem anderen Verhältnis von T verdünnt werden , _bzw. Zellen: T _reg Zellen (1: 0,25-1: 1).
3. Zugabe von 50 & mgr; l oder geeigneten Volumen Medium in alle Vertiefungen auf ein Gesamtvolumen von 200 ul. Die Platte mit Folie und Inkubation in einem CO ₂ Inkubator bei 37 ° C für 72 Stunden.

7. Analyse der CD8 ⁺ T - Zellproliferation und Cytokin - Produktion von CD8 ⁺ T - Zellen

1. Für die Cytokinproduktion Analyse nach 3 Tagen Kultur, trennen den Überstand von jeder Vertiefung in eine andere Platte und führen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
   HINWEIS: Der Überstand kann bei -70 ° C aliquotiert und gelagert werden. In diesem Experiment wurde anti-Maus-IFN-γ Antikörper-beschichteten Platte verwendet IFN-γ Produktion Übereinstimmung zu erkennening des Herstellers s Protokoll. Zu IFN-γ Produktion von proliferierenden CD8 ⁺ T - Zellen auf einem Einzelzellebene, intrazelluläre Cytokin - Färbung bestimmen kann durchgeführt werden.
2. Nach Abtrennen der Überstand aus jeder Vertiefung, waschen Sie die Platte, die Zellen mit FACS-Puffer und Zentrifuge bei 300 g für 2 min bei 4 ° C (3-mal) enthält.
3. Nach dem Waschen den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Zellpellets mit 50 ul Antikörper - Cocktail für die Färbung von proliferierten CD8 ⁺ T - Zellen. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C.
   HINWEIS: Antikörper-Cocktail vorzubereiten, fügen anti-CD4 FITC, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz (nahen IR-fluoreszierenden Reaktivfarbstoff) in FACS-Puffer.
   HINWEIS: Antikörper gegen verschiedene Marker wie CD44 oder CD69 können mit anderen Antikörpern kombiniert werden , um zu bestätigen , Aktivierung von CD8 ⁺ T - Zellen. Denken Sie daran , dass CD8 ⁺ T - Zellen haben bereits mit der Zellproliferation Tracking v markiert wordenIolet Farbstoff in Schritt 5.10.
4. Wasche zweimal durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Nach dem letzten Waschschritt, den Überstand verwerfen, und fixieren die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln bei 4 ° C mit 100 ul Fixierungspuffer.
5. Wasche zweimal durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Die Proliferation der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff-markierten CD8 ⁺ T - Zellen mittels Durchflusszytometrie resuspendieren der Zellen mit 200 & mgr; l FACS - Puffer und zu messen.
   1. Tor der CD8 ⁺ T - Zell - Population unter den lebenden Zellen. Messen Sie die Prozentsätze der geteilten und ungeteilten Zellen gemäß der Verdünnung der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff und CD8 ⁺ T - Zell - Verdünnung nach der folgenden Gleichung. Inhibition% = [(% der proliferierten CD8 ⁺ T - Zellen in Abwesenheit von T - Zellen _reg -% der proliferierten CD8 ⁺ T - Zellen in Gegenwart von T _reg Zellen) / (% der proliferierten CD8 ⁺ T - Zellen indas Fehlen von T _reg - Zellen)] x 100. Weitere Analyse der Daten durch die Durchflusszytometrie Software ²⁵ verwendet wird .

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Ergebnisse

Wir erzeugten Mäuse mit persistenten Virusinfektion , indem sie mit 2 × 10 ⁶ pfu von LCMV CL13 intravenös injiziert wird . Um die phänotypische Veränderungen in T _reg Zellen und T _conv Zellen während der chronischen Virusinfektion, Milzlymphozyten erhalten von naiven und infizierten Mäusen wurden gefärbt mit verschiedenen Antikörpern und analysiert mittels Durchflusszytometrie untersucht. CD4 ⁺ T _conv (1A, o...

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Diskussion

Obwohl nur eine kleine Anzahl von T _reg Zellen in Mäusen und Menschen vorhanden sind , ist es wichtig , ihre Funktion zu verstehen , wie sie die Immunantwort bei der Regulierung und Aufrechterhaltung der Immuntoleranz eine wichtige Rolle spielen. Die Anzahl und die unterdrückenden Funktionen von T _reg Zellen erhöht sich während einer chronischen Virusinfektion ^15-20 sowie Krebsprogression ^13,14. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der fortgesetzten Antigen-Stimulation. Zur Au...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4	RM4-5	BD Biosciences	553047
Cytofix/Cytoperm		BD Biosciences	554714
U-Bottom Tissue Culture Plates		BD Biosciences	353077
Fixation buffer		BD Biosciences	554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25	7D4	BD Biosciences	553072
Cell strainer, 70 mm		BD Biosciences	352350
Cell strainer, 40 mm		BD Biosciences	352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)	29F.1A12	BioLegend	135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4	RM4-5	Biolegend	100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a	53-6.7	eBiosicence	45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640		GE Life Sciences	SH30027
PBS (1x)		GE Life Sciences	SH30256
ACK Lysing Buffer		Gibco	A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution		Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml		Gibco	10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit		Life technologies	L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns		Miltenyibiotec	130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns		Miltenyibiotec	130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0)		Promega	V4231
2-Mercaptoethanol		Sigma Life Science	M7522
Fetal Bovine Serum		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II flowcytometer		BD Biosciences
Flowjo		TreeStar
Hematocytomer		Marienfeld superior