Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Zusammenfassung

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Zusammenfassung

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

Einleitung

Visualisierung großer DNA - Moleküle gebunden auf Glas oder Perlenoberflächen wurde zur Untersuchung von DNA-Protein - Wechselwirkungen, Proteindynamik auf DNA - Substrat, ^1,2 und Polymerphysik verwendet. ^3,4 Eine Plattform für Single-tethered großen DNA - Molekülen hat ein paar deutliche Vorteile gegenüber anderen DNA Immobilisierungsverfahren. ⁵ Erstens hat ein großes DNA - Molekül auf der Oberfläche gebunden eine natürliche ungeordneten Konformation ohne Scherströmung, die für ein DNA-bindendes Protein von entscheidender Bedeutung ist seine Bindungsstelle zu erkennen. Zweitens ist es sehr einfach, die chemische Umgebung um DNA-Moleküle für eine Reihe von enzymatischen Reaktionen in einem Strömungsraum zu ändern. Drittens ist ein Mikrofluidik - Scherströmung induziert DNA - Molekular zu 100% der vollen Konturlänge Dehnung auf, was sehr schwierig ist , die alternative DNA - Verlängerung wie Oberflächenimmobilisierung ⁶ und Nanokanal Haft nähert sich zu erreichen. ⁷ A vollständig stretched DNA-Molekül stellt auch eine Positionsinformation, die zur Überwachung der enzymatischen Bewegungen auf der genomischen Karte nützlich sein kann.

Dennoch hat die DNA Anbinden Ansatz eine kritische Nachteil dadurch, dass der interkalierende Farbstoff wie YOYO-1 in der Regel verursacht tethered DNA-Moleküle leicht durch Fluoreszenzanregungslicht durchbrochen werden. Im Allgemeinen große DNA-Moleküle mit einem fluoreszierenden Farbstoff zur Sichtbarmachung unter einem Fluoreszenzmikroskop gefärbt werden. Hierzu YOYO-1 oder andere TOTO Reihe Farbstoffe sind in erster Linie verwendet , da diese Farbstoffe nur fluoreszieren , wenn sie doppelsträngige DNA interkalieren. ⁸ Es ist jedoch bekannt , dass bis-interkalierenden Farbstoffes verursacht lichtinduzierten DNA Photospaltungs weil fluoreszierend gefärbte DNA - Moleküle der Interkalation von Fluorophore. ⁹ Ferner ist auf der Oberfläche gebunden sind empfindlicher , da Scherströmungen ausüben können Kräfte brechen auf frei DNA - Moleküle bewegen. Daher entwickelten wir FP-DBP als neuartige DNA-Anfärbung Proteinfarbstoff zum Abbilden großer DNA-Moleküle an der Oberfläche gebunden. Der Vorteil der Verwendung von FP-DBP ist , dass es nicht photo Spaltung der DNA - Moleküle bindet , an die verursacht. ¹⁰ Außerdem FP-DBP nicht die Konturlänge von DNA nicht erhöht, während bis-interkalierende Farbstoffe , die Konturlänge erhöhen um etwa 33%.

Dieses Video - Methode stellt die experimentellen Ansatz zu einer PEG-Biotin - Oberfläche großer DNA - Moleküle zu binden. Abbildung 1 unterschiedliche Ansätze von Anbindehaltung DNA mit stumpfen Enden und klebrigen Enden zeigt. Somit kann diese Färbemethode für jede Art von DNA - Moleküls angewandt werden. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Strömungskammeranordnung , die durch eine Spritzenpumpe gesteuert werden kann , um Scherströmungen erzeugen , um DNA - Moleküle als auch zu laden , Chemikalien- und Enzym strecken Lösungen. 3 zeigt Mikroaufnahmen von vollständig gestreckten DNA - Moleküle auf der PEGylat gefesselteed Fläche ¹¹ und gefärbt mit FP-DBP.

Protokoll

1. DNA Biotinylierung

1. Biotinylierung von blunt ended DNA unter Verwendung von Terminal - Transferase (TdT)
   Hinweis: Die Verwendung von T4-DNA (166 kbp), das eine stumpfe ended DNA ist.
   1. Zugabe von 5 & mgr; l von 2,5 mM CoCl _2, 5 & mgr; l 10 × Reaktionspuffer, 0,5 ul 10 mM Biotin-11-dUTP, 0,5 ul terminaler Transferase (10 Einheiten) und 0,5 ul T4 - DNA (0,5 ug / ul) zu dem Reaktionsgemisch. Machen zu einem Endvolumen von 50 & mgr; l von 38,5 & mgr; l Wasser zugegeben.
   2. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 1 Stunde.
      Hinweis: Erweiterte Reaktionszeit kann Ausbeute doppelt angebundenen DNA, dh es ist möglich , dass Biotinen an beiden Enden markiert sind.
   3. Die Reaktion durch Zugabe von 5 ul 0,5 M EDTA, pH 8.
   4. Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C.
2. Biotinylierung von klebrigen Enden DNA unter Verwendung von DNA - Ligase
   Hinweis: Verwenden Sie λ-DNA (48,5 kbp), das eine klebrige-End-DNA ist.
   1. 1 ul T4-DNA-Ligase, 5 ul 10 × Ligationspuffer, 1 ul 25 ng / & mgr; l λ-Phagen-DNA, und fügen 43 ul Wasser auf ein Endvolumen von 50 & mgr; l zu machen.
   2. Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C.

2. Funktionalisierte Oberflächenderivatisierung

. Hinweis: Um ein Ende eines DNA - Moleküls auf der Glasoberfläche anbinden, eine primäre Amingruppe auf einem Deckglas silanisiert gefolgt von Biotin-PEG - Beschichtung , wie in Figur 1 gezeigt Dieser PEGylierung Prozess ist wichtig für Einzelmolekül - DNA - Bildgebung , da es kann erheblich zufälliges Rauschen durch Anlagerung von unerwünschten Molekülen auf der Oberfläche erzeugt verringern.

1. Piranha Reinigung
   Hinweis: Piranha-Lösungen reagieren heftig mit organischen Materialien, daher sollte es mit Vorsicht behandelt werden, die nach einer ordnungsgemäßen Sicherheitsrichtlinien.
   1. Platz Deckgläser auf einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Rack, und halten Sie sie by PTFE Gewindedichtband der Länge nach, halb auf dem Rand der Oberflächen und zur Hälfte auf dem Rack. Nach dem Wickeln für die Handhabung der Zahnstange während des Reinigungsvorganges ein langes Stück (~ 5 cm) des Bandes verlassen.
   2. Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit 350 ml H ₂ SO ₄ und 150 ml H ₂ O ₂ Piranha - Lösung in einem Abzug zu machen. Legen Sie das Rack in Piranha-Lösung für 2 Stunden.
   3. Leere Piranha-Lösung aus dem Becher und rinse Deckgläser gründlich mit entionisiertem Wasser, bis der pH des Wassers in dem Becher erreicht neutral. Verwenden Sie pH-Papierstreifen.
   4. Beschallen die Racks von Deckgläsern in den Becher Wasser, 30 min. Leere Wasser aus dem Becher kurz vor Amino Silanisierung. Verwenden Sie 75 W von Beschallungsleistung zu reinigen und zu derivatisieren die Glassubstrate.
2. Aminosilanisierung auf der Glasoberfläche
   1. 2 ml N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylendiamin und 10 ml Eisessig zu 200 mlMethylalkohol in einem sauberen Polypropylenbehälter für die Aminosilanisierung Lösung vorbereitet.
   2. Legen gereinigt Deckgläser in der Polypropylenbehälter. Schüttle sie bei 100 Upm und Raumtemperatur für 30 min.
   3. Beschallen den Becher mit derivatisierten Abdecküberzüge für 15 min bei 75 W für mindestens 30 min schütteln sie bei 100 Umdrehungen pro Minute und Raumtemperatur.
   4. Entleeren der Lösung aus dem Becherglas und spülen Deckgläser vorsichtig einmal mit Methylalkohol und zweimal mit Ethylalkohol. Shop Deckgläser in Ethylalkohol und nutzen sie innerhalb von zwei Wochen.
3. PEGylierung des Deckplättchens
   1. Machen 10 ml 0,1 M Natriumbicarbonat (NaHCO _3). Filtern der Lösung mit einem 0,22 um-Spritzenfilter.
   2. Man löst 2 mg Biotin-PEG-Succinimidylcarbonat (Biotin-PEG-SC) und 80 mg PEG-Succinimidyl - valerat (mPEG-SVG) in 350 & mgr; l NaHCO _3. Verwenden Sie ein Lichtschutzrohr.
   3. Mischen Sie den Schlauch kräftig für 10 sec, und es Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min zu entfernen Blasen.
   4. Spülen einen Glasobjektträger mit Aceton und anschließend mit Ethylalkohol gespült. Lassen Sie den Schieber vollständig an der Luft trocknen.
   5. Einen Tropfen (50 ul) von PEG-Lösung auf dem sauberen Glas-Objektträger. Decken Sie die Tröpfchen sanft mit einem Amino silanisiert Deckglas, ohne Blasen zu erzeugen.
   6. Die Objektträger für 3 Stunden bis über Nacht in einem dunklen, gut eingeebnete feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen leeren Pipettenspitzenhalter als die Kammer, mit Wasser auf dem Boden. Siegel Rest PEG-Lösung in dem Rohr und halten sie bei 4 ° C.
   7. Spülen Sie die pegyliertes Deck gründlich mit entsalztem Wasser. Bewahren Sie es in einem dunklen und trockenen Ort bis zum Gebrauch.

3. Montage einer Flusskammer

1. Fabrizieren ein gestanztes Acrylhalter, wie in Abbildung 2. Stellen Sie sicher , dass der Durchmesser der Rohreinsatz 0,762 mm ist, und bezeichnen ein Loch ein Einlass ist und das andereeinen Auslass (Abbildung 2).
2. Legen Sie doppelseitige Klebeband Streifen (Breite 5-6 mm) auf einem Acryl-Halter (Abbildung 2), Ausrichten senkrecht zu einer Ein- und Austrittsloch, keine Kanalbohrungen gestört. Verwenden Sie diese Bandstreifen als Mehrkanalwände Kammern zu machen. Schrubben Sie das Band mit einer Pipettenspitze.
3. Legen Sie ein pegyliertes Deckglas auf der Oberseite, um die Strömungskammern machen, mit dem PEGylierten Seite nach unten.
4. Um eine Lösung nicht auslaufen, drücken Sie die Spitze eines Deckglases über den Bereich, in dem doppelseitigen Klebebändern platziert werden. Fügen Sie schnell trocknend Epoxidkleber die Ränder der Kammer am oberen und am unteren Rand (gelbe Farbe in Abbildung 2) zu schließen.
5. Verbinden ein kurzes Stück (2,5 cm) der Rohrleitung (Außendurchmesser OD, 0,042 ") zu einer gasdichten Spritze und Abdichten der Verbindung mit Epoxy-Klebstoff.
6. Verbinden eine lange flexible Schlauch (OD: 0,03 "), um den Schlauch an der Spritze verbunden, und abdichten das Gelenk mit Epoxidkleber.
7. Füllen Sie den tubing an der Spritze mit DI-Wasser verbunden. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblase.
8. Legen Sie den Schlauch in das Loch der Strömungskammer mit Epoxid-Kleber versiegelt.
9. Legen Sie eine gelbe Spitze (200 ul Spitze) auf der anderen Loch als Reservoir.

4. Probe Laden in Flusskammer

Hinweis: Neutravidin kann mit anderen Proteinen Avidin wie Streptavidin ersetzt werden. Alle Reaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden, es sei denn, es erwähnt wird. Nehmen Probenlösung in einem gelben Spitze, und installieren Sie die Spitze mit der Lösung auf das Loch von Acrylhalter (Abbildung 2b).

1. Stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe bei 50 & mgr; l / min. Last 20 ul Avidin-Protein (25 ug / ml in T50-Lösung, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), und halten Sie es für 10 Minuten.
2. Last 20 ul biotinylierten Oligodesoxynukleotide (100 & mgr; M in 1 × TE), und halten Sie es für 10 Minuten. Wenn Terminal-Transferase verwendet wird, lassen Sie die Ladevon Oligodesoxynukleotide.
3. Last 20 ul DNA-Lösung aus Schritt 1 in die Strömungskammer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ul / min und Halten für 30 min.
4. Waschen Sie die Flusskammer mit 1 × TE und laden 40 ul FP-DBP ¹⁰ (~ 80 nM).
5. Beobachten DNA unter einem Fluoreszenzmikroskop mit kontinuierlichen Fluss von Anfärben Moleküle in 1 × TE auf einem 60X Objektiv. Verwenden 488 nm Festkörperlaser zur Anregung von FP (eGFP) -DBP. Für volle Strecke von DNA-Molekülen, gelten unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten entsprechend den DNA-Längen verwendet. So gelten beispielsweise 50 & mgr; l / min für 48,5 kbp von λ-DNA und 100 & mgr; l / min für 166 kbp von T4 DNA.
   1. Für das Recycling des Acrylhalter tränken montierten Strömungskammern in einem Haushalt Reinigungslösung ^12. Entfernen Sie Bänder und Epoxy mit einer Rasierklinge und reiben mit den Händen völlig sie auszuziehen. Unclog Löcher mit Spritzennadeln. Halten Sie die Halter in entsalztem Wasser bis zur weiteren Verwendung.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt zwei verschiedene DNA Anbinden Methoden in Abhängigkeit von terminalen Strukturen des DNA - Moleküls. 1a veranschaulicht , wie die klebrigen Enden DNA - Moleküle mit komplementären biotinylierten Oligonukleotiden hybridisiert werden, die auf dem Avidin-beschichteten PEG Oberfläche immobilisiert sind. 1b zeigt die Zugabe von biotinyliertes ddNTP oder dNTP an die Hydroxylgruppe eines stumpfen ended DNA durch terminale Tr...

Diskussion

Hier präsentieren wir eine Plattform zur Visualisierung von langen DNA-Molekülen biotinyliert für auf Oberflächen zu verankern. Wir haben einen Ansatz für die DNA - Moleküle gebunden an eine Avidin Protein beschichtete Oberfläche mit biotinyliertem Rinderserumalbumin berichtet. ⁶ In der früheren Ansatz, fanden wir eine entscheidende Frage der DNA - Photospaltung durch Bis-Einlagerungs Farbstoffe verursacht wird, die auf die gefesselte DNA - Moleküle Fleck Oberfläche. Da diese kontinuierlich angeregt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack			Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™ tape
Sulfuric acid	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35% in water
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine	Sigma-Aldrich	104884
Glacial Acetic Acid	Duksan Chemicals	414	99% Purity
Methyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99.9% Purity
Polypropylene Container	Qorpak	PLC-04907
Ethyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	A300202	99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe Filter	Sartorius	16534----------K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetone	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	99% Purity
Microscope Slides	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support			Custom Fabrication
Double-sided Tape	3M		Transparent type
Quick-dry Epoxy	3M
Polyethylene Tubing	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe	Hamilton	81165
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma base
Microscope	Olympus	IX70
EMCCD Camera	Q Imaging	Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.