Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie

Zusammenfassung

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Zusammenfassung

Zu entwerfen und Ingenieur Materialien durch die Eigenschaften des Gehirns inspiriert, ob für mechanische simulants oder für die Geweberegeneration Studien sich das Hirngewebe gut sein müssen an verschiedenen Längen- und Zeitskalen charakterisiert. Wie viele biologische Gewebe weist Hirngewebe eine komplexe, hierarchische Struktur. Jedoch im Gegensatz zu den meisten anderen Geweben ist Gehirn sehr geringe mechanische Steifigkeit, mit Young'schen Elastizitätsmoduln E in der Größenordnung von 100 s von Pa. Diese geringe Steifigkeit Herausforderungen experimentellen Charakterisierung von Schlüssel mechanischen Eigenschaften darstellen kann. Hier zeigen wir einige mechanische Charakterisierung Techniken, die angepasst wurden, um die elastischen und viskoelastischen Eigenschaften von hydriertem, konformen biologischen Materialien wie Hirngewebe zu messen, auf unterschiedlichen Längenskalen und Beladungsraten. Am mikroskaligen führen wir Kriechen-Compliance und Kraft Entspannung Experimente mit Rasterkraftmikroskop-fähigen Einzug. An den MesosCale, führen wir Experimente Auswirkungen Vertiefung ein Pendel-basierte instrumentierten Eindringkörper verwendet wird. Am makroskaligen führen wir Parallelplattenrheometrie die frequenzabhängigen Scherelastizitätsmodul zu quantifizieren. Wir diskutieren auch die Herausforderungen und Einschränkungen bei den einzelnen Methoden verbunden. Zusammen ermöglichen diese Techniken eine gründliche mechanische Charakterisierung von Hirngewebe, das besser genutzt werden kann, um die Struktur des Gehirns zu verstehen und bio-inspirierte Materialien zu konstruieren.

Einleitung

Die meisten Weichteile biologische Organe umfassen, sind mechanisch und strukturell komplexen, von geringer Steifigkeit im Vergleich zu mineralisiertem Knochen oder technischen Materialien und weisen eine nichtlineare und zeitabhängige Verformung. Im Vergleich zu anderen Geweben im Körper, ist bemerkenswert Hirngewebe kompatibel ist , mit Elastizitätsmoduln E in der Größenordnung von 100 s von ¹ Pa. Das Hirngewebe zeigt strukturelle Heterogenität mit deutlichen und ineinandergreifenden grauen und weißen Substanz Regionen, die auch funktional unterscheiden. Verständnis Hirngewebe Mechanik wird in der Konstruktion von Materialien und Rechenmodelle unterstützen die Antwort des Gehirns während Verletzungen zu imitieren, Vorhersage mechanischer Beschädigung zu erleichtern, und das Engineering von Schutzstrategien ermöglichen. Zusätzlich können solche Informationen verwendet werden Entwurfsziele für die Geweberegeneration zu betrachten und zu einer besseren strukturellen Veränderungen im Hirngewebe zu verstehen, die mit Erkrankungen wie Multiple Sklerose und Autismus assoziiert sind. Here, wir beschreiben und verschiedene experimentelle Ansätze zeigen, dass die viskoelastischen Eigenschaften von mechanisch nachgiebigen Gewebe einschließlich Hirngewebe, auf der Mikro-, Meso- und Makroskalen zur Verfügung stehen zu charakterisieren.

Am mikroskaligen führten wir Kriechen-Compliance und Relaxationsexperimente Kraft mit Rasterkraftmikroskop (AFM) -fähigen Einzug. Typischerweise wird AFM-fähige Vertiefung verwendet , um den Elastizitätsmodul (oder momentane Steifigkeit) zur Abschätzung einer Probe ^2-4. Jedoch kann das gleiche Instrument auch zur Messung mikroskaligen viskoelastischen (zeit- oder geschwindigkeitsabhängig) Eigenschaften ^5-10 verwendet werden. Das Prinzip dieser Experimente, die in 1 gezeigt, ist eine AFM - auskragenden Sonde in das Gehirngewebe einrücken, eine festgelegte Größe der Kraft oder Eindringtiefe, zu pflegen und die entsprechenden Änderungen in Eindringtiefe und Kraft messen, die jeweils über die Zeit. Mit Hilfe dieser Daten können wir die Kriechen comp berechnenliance J _C und Entspannungsmodul G _R.

Am mesoskaliger führten wir Einfluss Einzug Experimente in Flüssigkeit getauchten Bedingungen, die die Gewebestruktur und Hydratationsniveaus, mit einem Pendel-basierten instrumentierten Nanoindentor halten. Der Versuchsaufbau ist in Figur 2 veranschaulicht. Da das Pendel mit dem Gewebe in Kontakt tritt, Sondenverdrängung als Funktion der Zeit aufgezeichnet wird , bis die oszillierende Pendel im Gewebe zur Ruhe kommt. Aus der resultierenden gedämpften harmonischen Schwingungsbewegung der Sonde kann man die maximale Eindringtiefe x _max, Energiedissipation Kapazität K und Verlustqualitätsfaktor Q des Gewebes ^11,12 (die der Rate der Energieabgabe bezieht) berechnen.

Im makroskopischen verwendeten wir eine parallele Platte-Rheometer der frequenzabhängigen Scherelastizitätsmoduln zu quantifizieren,der Speichermodul G bezeichnet 'und Verlustmodul G "des Gewebes. In dieser Art von Rheometrie wenden wir einen harmonischen Winkelspannung (und Scherbeanspruchung entspricht) mit bekannten Amplituden und Frequenzen und messen die Reaktions - Drehmoment (und eine entsprechende Scherspannung) , wie in Abbildung 3 dargestellt. aus der resultierenden Amplitude und Phasenverzögerung des gemessenen Drehmoments und geometrischen Variablen des Systems, können wir G 'und G "bei angelegten Frequenzen von Interesse ^13,14 berechnen.

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Protokoll

Ethik-Statement: Alle Versuchsprotokolle, die vom Animal Research Committee von Boston Kinderkrankenhaus und im Einklang mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt.

1. Maus Gehirngewebe Acquisition Verfahren (für AFM-fähigen Vertiefung und Auswirkungen Vertiefung)

1. Bereiten Sie eine Ketamin / Xylazin-Mischung die Mäuse zu betäuben. Kombinieren 5 ml Ketamin (500 mg / ml), 1 ml Xylazin (20 mg / ml) und 7 ml einer 0,9% igen Kochsalzlösung.
2. Injizieren Maus (Rasse: TSC1; Syn-Cre; PLP-eGFP; Alter: p21, Geschlecht: männlich oder weiblich) mit 7 ul pro Gramm Körpergewicht der Ketamin / Xylazin Lösung.
3. Sobald die Maus vollständig betäubt, wie durch einen Mangel an Reaktion auf Zehen und Schwanz kneift demonstriert, einschläfern die Maus durch Enthauptung große Dissektion Schere.
4. Entfernen Sie den Schädel durch die Mitte kleiner Dissektion Schere Abholzen. Ab dem Cerebellum, remOve Stücke des Schädels unter Verwendung einer gebogenen Pinzette. Nach dem Schädel entfernt wird, Extrahieren des Gehirns durch einen flachen Spatel mit dem Gehirn anzuheben, bei dem Cerebellum ausgehend und das Gehirn auf einer Petrischale legen. Entfernen Sie das Cerebellum aus dem Gehirn mit einer Rasierklinge.
5. Bei Verwendung gehen eine ganze Gehirn für Schlag Indentationstests auf frischem Gewebe, Transfer Gehirn in einen Rundbodenrohr mit CO ₂ -unabhängigen Nährmedium für adulte neurale Gewebe auf Eis und fahren Sie mit Abschnitt 4. Ansonsten 1.6 für das Schneiden von Verfahren zu Schritt.
6. Stellen Sie die Vibratom Einstellungen auf eine Geschwindigkeit von 0,7 mm / sec, einer Schwingungsfrequenz von 70 Hz und einer Schichtdicke von 350 um. Umgeben die Vibratom Schale mit Eis. Platzieren Sie einen Klecks Sekundenkleber auf die Vibratom Platte und montieren Gehirn, so dass koronalen Scheiben geschnitten werden kann, mit dem Gehirn zuerst zu schneiden durch die dorsale Seite orientiert.
7. Füllen Sie das Vibratom Schale mit genug Dulbecco phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) nur das Gehirn versenken. Erziehendas Gericht auf der Vibratom so dass Klinge in der DPBS gerade eingetaucht ist.
8. Drücken Sie beginnen Abschnitte schneiden koronalen Hirn 350 um dick zu beginnen.
9. Mit Pinseln Schädigung des Gewebes zu vermeiden, übertragen Sie die Hirnschnitten aus dem Vibratom DPBS Bad und in einem Rundhalsrohr mit CO ₂ -unabhängigen Nährmedium für adulte neurale Gewebe auf Eis und führen Messungen an frischem Gewebe innerhalb von 48 Stunden. Um AFM-fähige Vertiefung Experimente beginnen, gehen Sie zu Abschnitt 3.

2. Schwein Hirngewebe Acquisition Verfahren (für Rheologie)

1. Besorgen Sie sich eine sagittal geschnittenen Schweine halben Gehirn innerhalb von ~ 1 Stunde des Opfers von einem lokalen Metzger. Legen Sie die Hälfte des Gehirns in CO ₂ -unabhängigen Nährmedium für erwachsene Nervengewebe, und speichern Sie auf dem Eis.
2. Verwenden einer Rasierklinge oder einem Skalpell eine ca. 5 mm dicke koronale Gehirn in Scheiben schneiden und lagern in CO ₂ -unabhängigen Nährmedium für erwachsene Nervengewebe zu machen. Stellen Sie sicher, dass die Scheibe surface ist so flach wie möglich. Verwenden Sie vorsichtig seitliche Bewegungen mit Rasiermesser / Skalpell während des Schneidens.
3. Shop Schwein Hirngewebe in CO ₂ -unabhängigen Nährmedium für adulte neurale Gewebe auf Eis und rheometry Messungen (Abschnitt 5) auf frischem Gewebe innerhalb von 48 Stunden durchzuführen.

3. Atomkraftmikroskop-fähigen Einrückungen

1. Bereiten Sie 60 mm Durchmesser Petri (P60) Gerichte mit Muschel abgeleitet bioadhäsiven gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Bereiten Sie eine Bestandsaufnahme der neutralen Pufferlösung von 0,1 M Natriumbicarbonat in sterilem Wasser mit einem optimalen pH-Wert von 8,0 aus. Filter-sterilisieren (0,2 Mikron) das Natrium-Bikarbonat-Puffer und lagern bei 4 ° C.
   2. In einer laminaren Strömungshaube, eine Lösung von 6,25% mussel abgeleitetes bioadhäsiven und 3,125% NaOH in dem Puffer Natriumbicarbonat mischen.
   3. Pipette 100 ul der Bio-Klebelösung von 3.1.2 auf eine 60 mm-Durchmesser Petri (P60) Schale und die Verwendung Pipettenspitze Sol zu verbreitenUTION in einen 3-5 cm Durchmesser-Kreis.
   4. Lassen Sie P60 in Laminarströmungsabzug offenen Speisen und lassen Lösung trocken (~ 30 min). Geschirr spülen 1x mit PBS und 2x mit sterilem Wasser. Lassen Sie Gerichte der Luft trocknen in Laminar-Flow-Haube und lagern in einem verschlossenen Plastikbeutel bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
2. Kalibrieren Sie die AFM und Set-up Gehirnprobe in der AFM.
   Hinweis: Folgen Sie AFM Kalibrieranweisungen gemäß den Hersteller.
   1. eine AFM-Sonde mit einer Nennfederkonstante von 0,03 N / m und 20 & mgr; m Durchmesser Borosilikat Wulst in den Sondenhalter vorsichtig laden.
   2. Kalibrieren Sie die Federkonstante und inverse optische Hebel Empfindlichkeit (InvOLS) des AFM Cantilever die thermische tune Methode ^15,16 verwenden.
      HINWEIS: Wenn die Federkonstante für eine AFM-Sonde berechnet wird, es sollte bei wiederholter Anwendung konstant bleiben. Allerdings müssen die Ausleger InvOLS jedes Mal neu kalibriert werden der Laser mit dem Cantilever neu ausgerichtet wird. Zusätzlich Kalibrierungsollte steifer als der Ausleger, wie beispielsweise Polystyrol gegenüber einem Substrat mehrere Grßenordnung durchgeführt werden.
   3. Schalten Sie auf der Bühne montierten Heizung und Solltemperatur auf 37 ° C.
   4. Montieren Sie den Hirnschnitt auf die P60 Gerichte in Abschnitt vorbereitet 3.1.
      1. Gießen Sie vorsichtig mit einem 350 & mgr; m dicken Hirnschnitten, sowie die CO ₂ -unabhängigen Medium aus dem Rundkolben in eine P60 Schale mit dem Muschel abgeleitet bioadhäsiven beschichtet.
      2. Durch die sanft die P60 Schüssel kippen, positionieren Sie den Hirnschnitt in der Mitte der Schale. Falls erforderlich, Pipette langsam Medium von einem manuellen Pipettierer ein Hirnschnitt zu entfalten, die auf sich selbst gefaltet hat oder besser in der Lage, das Gehirn in Scheiben schneiden in der Mitte der Schale.
      3. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Medien einen P1000 Pipettierer verwenden (ohne Vakuum nicht verwenden).
      4. Setzen Sie Deckel auf P60 Teller und lassen das Gehirn Scheibe für 20 Minuten einzuhalten.
   5. Entfernen Sie die AFM-Kopf, legen Sie den Hirnschnitt in der P60 montiertGericht auf der AFM - Bühne, und fügen Sie ~ 2 ml CO ₂ -unabhängigen Medium vorgewärmt.
   6. Sorgfältig fügen Spannung einen Tropfen Medium auf die AFM-Sonde es bricht aufgrund schützen Oberfläche, wenn es in die Medien umgebenden Hirnschnitt verringert wird.
   7. Positionieren Sie die AFM-Kopf auf die Bühne und beginnen, den Kopf gesenkt, bis es in die Medien eingetaucht ist.
   8. Mit Hilfe der Draufsicht CCD-Kamera, die Position des Lasers auf dem Ausleger.
      HINWEIS: Die Ausrichtung des Lasers auf dem Cantilever wird leicht aufgrund des Unterschieds im Brechungsindex von Luft und Medium gewechselt.
   9. Warten Sie 5 Minuten für die Ausleger einzustellen in einer warmen Flüssigkeit eingetaucht ist, dann setzen Sie die Spiegelausrichtung auf eine freie Ablenkung von 0 V.
   10. Führen Sie einen thermischen Spektrum auf der AFM - Sonde gemäß den Anweisungen des Herstellers ^16. Verwenden Sie den Sitz des ersten thermischen Spitzen neu zu berechnen die InvOLS der AFM-Sonde in den Medien.
   11. Mit dem optischen Mikroskop,Bewegen Sie den Probentisch, so dass die Hirnregion von Interesse unter der AFM-Sonde.
       HINWEIS: Das Corpus callosum dunkel erscheinen wird, wie es undurchsichtiger als die umgebende graue Substanz ist. Die Rinde ist besser als das Corpus callosum.
   12. Setzen Sie die Spiegelausrichtung auf eine freie Ablenkung von 0 V.
   13. Auf der Summe und Ablenkung Meter in der AFM-Software, klicken Sie auf "Engage", um die AFM Kopf engagieren.
   14. Mit der Position Einstellrad auf der AFM-Kopf, senken Sie den Kopf, bis der Kontakt zwischen dem Cantilever und Probe hergestellt wird.
3. (Optional) Falls gewünscht, messen den Elastizitätsmodul der Probe, wie zuvor beschrieben ^4,17,18.
4. Führen Kriechcompliance Experimente.
   1. Konstruieren Sie eine aufgebrachte Kraft Funktion im Funktionseditor der Software. Die Kraft-Funktion besteht aus einer 0,1 sec Rampe auf einen Sollwert von 5 nN und halten Sie ihn für 20 Sekunden, gefolgt von einer 1 sec auf eine angelegte Kraft von 0 nN nach unten Rampe.
      1. Auf dem Einrücken Master Panel unter dem Einkerbungsverfahren, wählen Sie "Load" für Indenter-Modus; "N" für Einheiten; und "Funktionseditor" für Indenter Funktion.
      2. Im Funktionseditor, auf dem Segment Parms-Panel, erstellen Sie eine aufgebrachte Kraft Funktion Segment, das bei 0 nN beginnt, endet bei 5 nN, mit einer Zeit von 0,1 Sekunden. Klicken Sie auf "Einfügen ->".
      3. Für das nächste Segment auf 5 nN, Ende bis 5 nN, und die Zeit bis 20 Sekunden starten. Klicken Sie auf "Einfügen ->."
      4. Für das letzte Segment auf 5 nN, Ende auf 0 nN, und die Zeit bis 1 s starten. Klicken Sie auf "Zeichnen" und die Funktion Editor-Fenster zu schließen.
   2. An der Kraft-Vorsprung des Master-Panel, überprüfen Sie "Indenter Rampe nach Trigger" und die ausgeübte Kraft Funktion einstellen, nach Erreichen eines Triggerpunkt von 0,1 V auslösen
   3. Klicken Sie auf "Einzelkraft" auf der Unterseite des Kraft Tab des Master-Panel, das die konstruierten angelegten Kraftfunktion für Kriechcompliance auslösen.
   4. Nach demEinzelkraft Vertiefung beendet ist, heben Sie den AFM-Kopf, so dass er aus dem Kontakt mit der Probe ist, und dann den Kopf wieder einrasten und wieder Null frei Ablenkung.
   5. Positionieren Sie die Probenbühne einen neuen Bereich von Interesse zu suchen, und die AFM-Kopf senken Kontakt zu machen. HINWEIS: Die AFM-Kopf muss von der Probenoberfläche zurückgezogen werden, wenn der Probentisch bewegt wird. Geschieht dies nicht, kann es zu Schäden an den empfindlichen AFM Cantilever führen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.3-3.4.5, bis die gewünschte Menge an Daten gesammelt wurden.
5. Führen Kraft Relaxationsexperimente.
   1. Konstruieren Sie eine angelegte Vertiefung Funktion im Funktionseditor der Software. Die Vertiefung Funktion besteht aus einer 0,1 sec Rampe auf einen Sollwert von 3 um und halten Sie ihn für 20 Sekunden, gefolgt von einer 1 sec zu einer Eindringtiefe von 0 & mgr; m Rampe ab.
      1. Auf dem Einrücken Master Panel unter dem Einkerbungsverfahren, wählen Sie "Einrücken" für Indenter-Modus; "M" für Einheiten; und "; Funktionseditor "für Indenter Funktion.
      2. Im Funktionseditor, auf dem Segment Parms-Panel, erstellen Sie eine aufgebrachte Kraft Funktion Segment, das bei 0 & mgr; m beginnt, endet bei 3 & mgr; m, mit einer Zeit von 0,1 Sekunden. Klicken Sie auf "Einfügen ->".
      3. Für das nächste Segment, auf 3 & mgr; m, Ende bis 3 um, und die Zeit bis 20 sec starten. Klicken Sie auf "Einfügen ->."
      4. Für das letzte Segment auf 3 & mgr; m, Ende auf 0 & mgr; m, und die Zeit bis 1 sec starten. Klicken Sie auf "Zeichnen" und die Funktion Editor-Fenster zu schließen.
   2. An der Kraft-Vorsprung des Master-Panel, überprüfen Sie "Indenter Rampe nach Trigger" und die ausgeübte Kraft Funktion einstellen, nach Erreichen eines Triggerpunkt von 0,1 V auslösen
   3. Klicken Sie auf "Einzelkraft" auf der Unterseite des Kraft Tab des Master-Panel, das die konstruierten angelegten Einbuchtung Funktion für Kraft Entspannung auslösen.
   4. Nachdem die einzige Kraft Einzug beendet ist, heben Sie den Kopf AFM, so dass esaus dem Kontakt mit der Probe und anschließend wieder einzurücken den Kopf und Wiedernulldurchbiegung.
   5. Positionieren Sie die Bühne einen neuen Bereich von Interesse zu suchen, und den Kopf senken, um Kontakt herzustellen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 5,3-5,5, bis die gewünschte Menge an Daten gesammelt wurden.
6. Beschließen Experimente und clean-up.
   1. Nach Experimenten Abschluss der AFM Kopf zu heben und es aus der Probe zu entfernen.
   2. Verwenden Sie ein Labor Gewebe vorsichtig überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, ohne den Ausleger zu berühren.
   3. Reinigen Sie den AFM Cantileverhalters eine geringe Menge an Ethanol. Sie nicht die empfindliche Elektronik auf dem Cantileverhalters zu Ethanol aus. Entfernen Sie die AFM-Cantilever und in einen Vorratsbehälter.
   4. Entsorgen Sie das Gehirn Gewebeprobe durch geeignete Biosicherheit Protokolle folgen.
7. Mit MATLAB Kriechcompliance berechnen und Entspannung moduli zwingen Eindringkörpergeometrie verwenden, nach der Lösung abgeleitet von Lee und Radok 1960 ^19.
   1. Berechnen Kraft F und Eindringtiefe von Daten auf der Cantilever - Position z, Ablenkung d, und die Federkonstante k _c
      
      und .
   2. Suchen Sie den Kontaktpunkt entlang der Eindringtiefen - Kurve des Algorithmus in Lin beschriebenen et al. ^20.
   3. Definieren Sie ein Fenster von Interesse für die Datenanalyse. Das Fenster von Interesse ist die Region , in der entweder Kraft (für Kriechcompliance) oder Eindringtiefe (für Kraft Entspannung) auf einem Sollwert gehalten (dh Region 3 wie in 1C, D gezeigt).
   4. Zur Einhaltung Experimente Kriechen, berechnen die experimentellen Kriechnachgiebigkeit Modulus, J _c (t), in Reaktion auf einen Schritt Lastn 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      .
      wobei H (t) die Sprungfunktion Heaviside und R der Radius der sphärischen Sonde.
   5. Zur Kraft Relaxationsexperimente, berechnen die experimentelle Kraft Relaxationsmodul, G _R (t), als Reaktion auf eine Tiefe Schritt Vertiefung :
      .

4. Auswirkungen Einrückungen

1. Kalibrieren Sie den instrumentierten Nanoindentor und stellen Standardeinstellungen dynamische Auswirkungen Experimente auf hydratisierte Hirngewebe zu ermöglichen, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Montieren Sie eine kugelförmige Sonde, indem sie auf das Pendel Gleiten mit einer Pinzette.
   2. Klebe ein Quarzglasprobe auf die Proben Post, die in die Translationseingeschraubt istStufe.
   3. Gehen Sie auf die Kalibrierungsmenü und wählen Sie "Liquid Cell." Folgen Sie den Anweisungen des Software-Kontakt mit dem Quarzglas-Probe zu machen.
   4. Wählen Sie "Normal" für den Indenter Typ und den Standardwert von 0,05 mN für die Indenter laden. Klicken Sie auf "Weiter", um die Kalibrierung für die normale Eindringkörper Konfiguration durchführen.
   5. Bewegen Sie den Probentisch zurück von mindestens 5 mm. Montieren Sie den Hebelarm, der die Sonde in die Flüssigkeit Zelle abgesenkt werden kann, und wiederholen Sie die Flüssigkeit Zellenkalibrierung in der neuen Konfiguration von "Liquid Cell" für den Indenter Typ auswählen. Klicken Sie auf "Weiter", um die Flüssigkeitszelle Kalibrierungsfaktor erhalten.
   6. Aktivieren Sie die Flüssigkeitszelle Software-Option von dem Experiment Menü gehen und die Auswahl von "Spezielle Optionen." Verwenden Sie die neueste Kalibrierungswert.
   7. Erhöhen Sie die Kondensatorplattenabstand, da dies zu einer größeren maximal messbare Tiefe führen wird, die notwendig ist, wenn hig Prüfunghly-konformen Materialien.
      1. Unter dem System-Menü wählen Sie "Nicht kopiergeschützte Einstellungen" und "Maschinenparameter", um die Pendeltest Lastrate ändern, Nulllast-Rate und Standby bis 0,5 mN / sec Offset Rampe, 0,1 mN / s und 3 V sind.
      2. Mit einem Schraubenschlüssel, drehen Sie die drei Muttern, die den Kondensatorplattenabstand im Uhrzeigersinn in kleinen Schritten zu steuern.
      3. Nach jeder vollen Umdrehung im Uhrzeigersinn, wählen Sie "Brücken-Box-Einstellung" unter dem Menü Wartung und erhalten Test ein gutes Pendel, das die Gegenausgleichsgewicht weg von dem Pendel bewegen erfordert.
      4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.7.2-4.1.7.3, bis die ungefähre Tiefe Kalibrierung einen Wert von 70.000 nm / V oder höher liest.
   8. Positionieren Sie einen neuen Anschlag am unteren Rand des Pendels, das Ein- und Ausschalten über eine Stromversorgung umgeschaltet werden kann. Ziehen Sie die Original-Anschlag hinter dem Pendel sitzt ein potenzielles Hindernis der Pendelbewegung zu entfernen und ermöglichen höhereAufprallgeschwindigkeiten sowie höhere Eindringtiefen in den Anforderungen entsprechenden Proben.
   9. Lassen Sie das Gerät ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen (ca. 1 Stunde).
   10. Während das Kabinett ausgleicht, zum Systemmenü zurück und "Nicht kopiergeschützte Einstellungen" und wählen Sie "Maschinen-Parameter." Stellen Sie die Tiefenkalibrierung (DCAL) Kontaktgeschwindigkeit bis 1 & mgr; m / sec, die primäre Vertiefung Kontaktgeschwindigkeit bis 3 & mgr; m / sec, und die extrem niedrigen Lastkontaktgeschwindigkeit auf 1 & mgr; m / sec.
   11. Unter dem Menü Kalibrierung, führen Sie eine Standardtiefe Kalibrierung in dieser neuen Konfiguration.
   12. Schalten Sie die Stromversorgung für den Elektromagneten und setzen Sie ihn auf 10 V. Zum Experiment Menü und wählen Sie "Impact" und "Adjust Impulse Verschiebung." Folgen Sie den Anweisungen der Software (automatische Ansagen), um die Schaukel Abstand des Pendels zu kalibrieren.
2. Montieren Sie die Maus Hirngewebe in der Flüssigzelle.
   1. Nachdem das gesamte Gehirn aus ste Erntep 1.5, lagern Sie ihn sofort in CO ₂ -unabhängigen Nährmedium für erwachsene Nervengewebe Medien auf Eis.
   2. Wenn die Auswirkungen Vertiefung Setup vollständig abgeschlossen ist, sorgfältig das Gehirn in eine Petrischale übertragen zusammen mit CO ₂ -unabhängigen Medium. Schneiden Sie das Gehirn in 6 mm dicke Abschnitte mit ebenen Flächen auf beiden Seiten.
   3. Halten Sie die in Scheiben geschnittenen Gewebes auf die Aluminiumprobe Post mit einer dünnen Schicht aus Cyanacrylat-Klebstoff.
   4. Schieben Sie die Flüssigkeit Zelle über den zweiten O-Ring auf der Probe Post, und füllen Sie die Flüssigkeit Zelle mit 5 ml CO ₂ -unabhängigen Medium vollständig in das Gewebe einzutauchen. Diese Probe Post wird dann auf die Translationsstufe innerhalb des instrumentierten Nanoindentor sorgfältig montiert.
3. Messung der Auswirkungen Antwort des Hirngewebes.
   1. Entfernen Sie ggf. die sphärische Sonde und ersetzen Sie es mit der Sonde von Interesse, ohne den Hebelarm zu entfernen.
   2. Unter dem Menüsystem wählen Sie "Nicht kopiergeschützteEinstellungen "und" Maschinen-Parameter. "Ändern Sie die primäre Auswirkung Kontaktgeschwindigkeit bis 5 & mgr; m / sec.
   3. Mit der Probe Bades niedrig (-Z-Richtung) und weit entfernt von dem Pendel (+ x-Richtung), in der -x-Richtung bewegt, bis die Spitze am Hebelarm richtig über dem Bad befindet. Bewegen Sie sich in der + z-Richtung, bis die Spitze vollständig im Bad und vor der Probe eingetaucht ist.
   4. Mit dem Probentisch Kontrollfenster, stellen Kontakt sorgfältig und dann die Bühne weg von etwa 30 & mgr; m von der Probenoberfläche zurück.
   5. Unter dem Experiment Klicken Sie im Menü "Impact" einen Einfluss Experiment einzurichten. Wählen Sie eine bestimmte Impulsbelastung, die direkt auf die resultierende Aufprallgeschwindigkeit basierend auf der Schaukel Abstand Kalibrierung beziehen wird. Führen Sie das geplante Experiment.
   6. Wenn das Pendel zurück schwingt und die Probenoberfläche weiter zur Messebene zu bewegen, drehen Sie den unteren Anschlag Schalter aus.
   7. Beobachten Sie, wie das Pendel schwingt forward die Probe zu beeinflussen. Die Verschiebung der Sonde als Funktion der Zeit wird von der Software erfasst werden.
   8. Wenn das xyz Bühne Fenster erscheint, den Anschlag Schalter auf der Rückseite.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,8 so viele unterschiedliche Belastungen und Standorte zu testen, wie gebraucht.
4. Analysieren der erfassten Verschiebung vs. Zeitverhalten des Pendels mit angepassten MATLAB - Skripte die maximale Eindringtiefe x _max, Energiedissipation Kapazität K und Verlustqualitätsfaktor Q zu bestimmen. ¹¹
   1. Gehen Sie auf die Menü Analyse und exportieren Sie die Daten in einer Textdatei.
   2. Nehmen der zeitlichen Ableitung des Verschiebungsgeschwindigkeitsprofil als Funktion der Zeit zu erhalten. Nullpunktverschiebung als Kontaktstelle x _o1.
      HINWEIS: Die Aufprallgeschwindigkeit v _in die maximale Geschwindigkeit unmittelbar vor dem Kontakt x _max der Verformung entspricht , bei dem die Sonde.Geschwindigkeit zuerst auf Null abnimmt. x _o2, die x _r äquivalent ist, ist die Position , zu reinitiieren Kontakt mit dem verformten Probe in dem nächsten Zyklus erforderlich. Rückprallgeschwindigkeit v _out ist die Geschwindigkeit , mit der Verschiebung x _r.
   3. Definieren K (ohne Einheit) als die Energie , die von der Probe dissipiert normiert durch die Summe der wiedergewonnen und abgeführt Probenenergien während des ersten Schlagzyklus. Berechnen K auf der Basis der intrinsischen Eigenschaften des Pendels ²¹ (wie beispielsweise Drehsteifigkeit und Dämpfungskoeffizient), x _o1, x _max, x _r, v _in und v _out.
      HINWEIS: Für weitere Informationen kann man die Arbeit von Kalcioglu konsultieren et al, 2011..
   4. Da Verschiebung als gedämpften harmonischen Schwingungsbewegung beschrieben werden kann, passt eine exponentielle Abklingfunktion auf die Maxima der disPlatzierung-Zeit-Kurve.
   5. Berechnen Q (ohne Einheit) als π durch die Anzahl der Zyklen multipliziert , die für die Schwingungsamplitude um einen Faktor von e zu verringern. Ein höherer Q - Wert bedeutet einen geringeren Energieverlustrate.

5. Rheologie

1. Set-up und Kalibrieren des Rheometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Initialisieren Sie das Rheometer durch das Gerät / Bedienfeld zu öffnen. Auf dem Bedienfeld Registerkarte klicken Sie auf "initialisieren."
   2. Montieren Sie den 25 mm-Durchmesser-Messplatte (PP25) und das thermische System.
   3. (Optional) Zur Reduzierung der Schlupf zwischen Rheometer Platten und dem Gewebe, ausschneiden Klebstoff Schleifpapier Scheiben, die die Form des oberen Rheometerplatte übereinstimmen und das Schleifpapier an der oberen und unteren Platte haften.
   4. Nehmen Sie Kontakt zwischen der oberen und der unteren Platte, indem Sie auf "Null gesetzt Lücke" auf dem Bedienfeld.
   5. Null, um die normalen Kraftaufnehmer durch clicking "Normalkraft zurück."
   6. Führen Sie einen Trägheitstest durch die Registerkarte Dienst auf dem Bedienfeld zu öffnen, klicken Sie auf "Messsystem" und dann auf "Trägheitstest". Notieren Sie sich die alte und neue Trägheit. Stellen Sie sicher, dass die Trägheit der Sonde innerhalb der zulässigen Grenze liegt, wie vom Hersteller angegeben.
2. Legen Sie die Probe in Rheometer.
   1. Nachdem das Gewebe Ernte und einen koronalen Segment des Schweins Gehirn zu ~ 5 mm Dicke, speichern Sie es auf Eis in CO ₂ -unabhängigen Medium schneiden.
   2. Legen Sie das Gehirn zwischen den beiden Platten. Entfernen Sie große Wassertropfen von der oberen und unteren Oberfläche der Probe ein Verrutschen zu verhindern, aber nicht austrocknen die Probe.
   3. Langsam die Messplatte absenken, bis die Platte mit der oberen Oberfläche des Gewebes und der gemessenen Normalkraft steht im Einklang mit 0,01 mN nach 5-10 min Ruhepause in Vollkontakt ist.
      1. In der Systemsteuerung, geben Sie nacheinander niedrigere Höhen in die Messposition und klicken Sie auf "Messposition", um langsam die Messplatte senken.
      2. Wenn innerhalb eines Millimeters des Kontaktes mit dem Gewebe, in Schritten von 0,1 mm der Messplatte absenken, bis die Platte mit der oberen Oberfläche des Gewebes vollständig in Kontakt steht. Stellen Sie sicher, dass die gemessene-Normalkraft konstant bei 0,01 mN nach 5-10 min Ruhepause.
      3. Notieren Sie sich die anfänglich gemessenen Normalkraft. Wiederholte Messungen sollten bei den gleichen Druckspannungen / Stämme eingenommen werden.
   4. Schneiden Sie die Probe mit einer Plastikklinge, wenn die Probe den Durchmesser der Platte überschreitet. Pipette ein kleines Volumen (~ 1-2 ml) von Medien an den Rändern der Probe um das Gewebe zu hydratisieren.
   5. (Optional) Senken Sie die thermische Haube. Auf dem Bedienfeld, stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C und klicken Sie auf "Set".
3. Führen Sie eine Amplitudensweep des linearen viskoelastischen Bereich des Materials zu schaffen (dh die ScherStämme , bei denen G 'und G' 'konstant sind) mit Frequenzen von Interesse (zB 1 rad / sec).
   1. Wählen Sie "Datei / Neu". Unter dem Gel wählen Sie die Registerkarte "Amplitude Sweep: LVE-Bereich." Wählen Sie Fenster und klicken Sie auf "Messung. 1: Amplitude sweep" Klicken Sie doppelt auf das Schwingungsfeld. Geben Sie den Anfangs- und End - Stamm (beispielsweise 0,01 bis 105), die Frequenz (beispielsweise 1 rad / sec) und die Anzahl von Punkten pro Dekade (zB 6 Punkte / DEC). Wählen Sie "OK" und klicken Sie auf Start. "
   2. Wiederholen Sie diesen Vorgang für mehrere Scheiben mit wiederholten Versuchen Konsistenz des linearen elastischen Bereich zu gewährleisten. Die axiale Kompression der Probe sollte zwischen den Proben konstant bleiben.
4. Führen Sie eine Frequenz - Sweep des Gewebes bei einer Dehnung im linearen viskoelastischen Bereich des Gewebes (zB 1% Dehnung) ²² und in einem Frequenzbereich von Interesse (zB 0,1 bis 100 rad / sec).
   1. Klicken "Datei / Neu" und unter dem Gel Registerkarte "Frequenz-Sweep" aus. Klicken Sie auf Fenster / Messung 1: Frequenz-Sweep. Klicken Sie doppelt auf das Schwingungsfeld. Geben Sie den Frequenzbereich (zB 0,1 bis 100 rad / s), die Belastung (zB 1% Dehnung) und die Anzahl der Punkte pro Dekade (zB 6 Punkte / Dezember). Wählen Sie "OK" und klicken Sie auf "Start", um die Frequenz-Sweep initiieren.
5. Wiederholen Frequenz-Sweep (Schritt 5.4) in Duplikaten oder dreifacher Ausführung.
6. Überprüfen Sie die Daten, die von dem Rheometer automatisch berechnet und exportiert werden: G 'und G "als Funktion der Frequenz (Frequenz - Sweep) oder Scherspannung (Amplitude Sweep) . HINWEIS: G' und G '' sind aus der Stichprobe des (maximal berechnet ) T _'0 und Drehverschiebungswinkel (oder Ablenkwinkel) Reaktions - Drehmoment Amplitude Und PhasenverzögerungGleichung 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, der Reaktion der Probe auf die angelegte oszillierende Belastung (Abbildung 3):
   
   
   wobei R und h sind der Radius und der Höhe der Probe.

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Ergebnisse

Abbildung 4 zeigt repräsentative Vertiefung und Kraft gegenüber der Zeit Antworten (4B, E) für Kriechcompliance und Relaxationsexperimente zwingen, da eine angelegte Kraft oder Eindringtiefe (4A, D) sind. Unter Verwendung dieser Daten und der Geometrie des Systems, die Kriechnachgiebigkeit J _c (t) und Entspannungs Moduli Kraft G _R (t) für unterschiedliche Regionen des Gehirns (4C, F)

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Diskussion

Jede Technik, die in diesem Papier misst verschiedene Facetten der mechanischen Eigenschaften des Hirngewebes. Kriechnachgiebigkeit und Spannungsrelaxation Moduli sind ein Maß für zeitabhängige mechanische Eigenschaften. Die Speicher- und Verlustmodul repräsentieren geschwindigkeitsabhängigen mechanischen Eigenschaften. Schlag Einbuchtung misst auch geschwindigkeitsabhängigen mechanischen Eigenschaften, sondern im Rahmen der Energiedissipation. Wenn Gewebe mechanische Eigenschaften zu charakterisieren, sowohl AFM-...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine	Lloyd Laboratoried		perscription drug
Ketamine	AnaSed Injections		perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome)	Leica	VT1200
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Petri Dish Heater	Asylum Research	-
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere	Novascan	PT.GS
Cell-Tak	Corning	354240	mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N	Sigma-Aldrich	59223C	alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage	Micro Materials Ltd.	-	probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell	Micro Materials Ltd.	-
Parallel Plate Rheometer MCR501	Anton-Parr	-
PP25	Anton-Parr	-	25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper	McMaster-Carr	4184A48	alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive	Henkel	20268	alternate suppliers can be used