In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Zusammenfassung

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Zusammenfassung

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

Einleitung

Der Widerstand des Zentralnervensystems (ZNS) Erkrankungen (dh. Krebs, Epilepsie, Depression, Schizophrenie und HIV-assoziierte neurologische Störung) auf pharmakologische Therapien aufgrund der verschiedenen Mechanismen, einschließlich beschwerliche Arzneimittelpermeation über die Blut-Hirn - Schranke (BBB) . Die BBB ist die Grenze, die Gehirngewebe von den Substanzen isoliert im Blut zirkulieren. Innerhalb dieser Barriere eine Schicht aus Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs), von Perizyten und Astrozyten Endfüßen unterstützt wird , ist verantwortlich für die hohe Selektivität der BBB zu diesen wasserlöslichen Arzneimittel mit einem Molekulargewicht von mehr als 400 Da ^1. Eine andere drogenbedingten Widerstandsmechanismus ist mit dem Vorhandensein auf BMECs von Arzneimitteltransportern Efflux (P-Glykoprotein und multidrug resistance Proteine) verbunden, die zusammenwirken , um Arzneimittelpenetration in das ZNS zu reduzieren und erleichtern deren Extrusion aus dem Gehirn ^2.

Im letzten JahrzehntEine Vielzahl von nanotechnologische Ansätze entwickelt wurden , um die klinische und biologische Herausforderung der Bereitstellung von Arzneimitteln über die BBB ^3-6 zu erfüllen. In diesem Zusammenhang stellen Ferritin-Nanokugeln (FNN) eine völlig innovative und vielversprechende Lösung. Fnn sind 12 nm Sphären 24 selbstorganisierende Ferritin (Fn) Monomeren, die in einer Hohlkugelstruktur von 8 nm Innendurchmesser angeordnet sind. Ferritin-Untereinheiten können, indem der pH-Wert auf Neutralität, so dass verschiedene organische Moleküle zu verkapselnden bei saurem pH und wieder zusammengebaut in einem Formgedächtnis-Mode demontiert werden. Daher stellen fnn ein interessantes Modell für die Entwicklung von multifunktionalen Wirkstoffabgabesysteme ^7,8. Außerdem kann fnn mit BMECs dank der spezifischen Erkennung von Transferrin - Rezeptor (TfR) 1, zu interagieren , die auf der luminalen Membran dieser Zellen ⁹ exprimiert wird.

Bisher verschiedenen in vitro - Modelle der BBB wurden in orde entwickeltr trans-BBB Permeabilität für verschiedene Arzneimittel, die Toxizität gegen die BBB, oder die Wechselwirkung von Molekülen mit Efflux-Transporter zu erläutern. Tatsächlich werden diese Modelle als in vitro gültigen Ansätze für ein schnelles Screening von aktiven Molekülen , bevor sie mit in - vivo - Studien fortfahren. Diese Modelle bestehen aus einer einzigen Endothelschicht BMECs oder co-kultiviert BMECs und Astrozyten (seltener pericytes), erhalten von Tier (Ratte, Maus, Schwein und Rind) oder menschlichen Zelllinien ^10,11,12. Die transendotheliale Elektrischer Widerstand (TEER) und die scheinbare Permeabilität (P _app) von Tracern mit definiertem Molekulargewicht sind zwei kritische Parameter, die die Qualität der in - vitro - Modell werden verwendet , zu bestimmen. Hier beschreiben wir die Verwendung eines BBB in - vitro - Modell, basierend auf einer Co-Kultur von Ratten - BMECs (RBMECs) und Ratten - kortikalen Astrozyten (RCAs) zur Untersuchung der trans-BBB Permeation von Ferritin - Nanokäfige Einkapseln Fluorescein isothiocyanate (FITC).

Protokoll

1. Festlegung der BBB-Modell

Hinweis: Für die BHS-Modell schaffen wir schlagen vor, im Handel erhältliche primäre RBMECs und RCAs verwenden. Alle Schritte müssen mit sterilen Reagenzien und Disposables durchgeführt werden, in einer Laminarströmungsabzug behandelt.

1. Zellkultur
   1. Coat Zellkulturflaschen mit Poly-L-lysin 100 ug / ml (1 h bei RT) oder Fibronektin 50 ug / ml (1 h bei 37 ° C) die Anlagerung von RCAs oder RBMECs zu fördern, respectively. Dann thaw 1 x 10 ⁶ RCAs und 5 x 10 ⁵ RBMECs in Endothelzell-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 1% endothelialen Zellwachstumsergänzungsmittel und 1% Penicillin / Streptomycin (SECM). Seed RCAs in einem T175-Kolben in 20 ml SECM und RBMECs in einem T75-Kolben in 10 ml SECM.
      Hinweis: Das Auftauen und Aussäen Passagen RCAs und RBMECs müssen angepasst werden, in Bezug auf die Zelldichte und der Zeit in Kultur, entsprechend der Anzahl der Versuchsbedingungen mit der BBB-Modell getestet werden. Mit dem Starting mit 1 Flasche mit 1 x 10 ⁶ RCAs und 1 Flasche mit 5 x 10 ⁵ RBMECs ist es möglich , bis 20 BBB-Lagerschalen erhalten werden.
   2. Pflegen der Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ in einer befeuchteten Atmosphäre für etwa 6 Tage, bis etwa 80% Konfluenz für RCAs und über 90% Konfluenz für RBMECs. Abzulösen Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA-Lösung (Trypsin 1: 250) für 5 min (1 ml Trypsin für T75-Kolben und 2 ml für T175-Kolben). Stop Trypsin-Aktivität mit SECM (2: 1) Zentrifugenzellsuspensionen bei 750 × g für 5 Minuten und Resuspendieren der Pellets in 60 ml SECM.
   3. Teilen Sie die RBMECs in 3 T175-Flaschen und Kultur in SECM für weitere 3 Tage, bevor sie auf Einsätze Aussaat. Zählen Sie die Gesamtzahl der RCAs leben, durch eine Zellsuspension beobachtet 1: 1 verdünnt mit Trypanblau unter einem optischen Mikroskop in einer Burker Kammer.
2. Zellaussaat auf Einsätze
   1. Behandlung einer Seite der Polyethylen-Terephthalat (PET) -Membran von 6 Multi-Well transpaent Einsätze mit Poly-L-lysin 100 ug / ml und die andere Seite mit Fibronectin 50 ug / ml, Anhaftung von RCAs und BMECs zu ermöglichen. Behandeln Sie die Einsätze mit einer Pinzette, um den Kontakt mit der PET-Membran zu vermeiden.
      1. Legen Sie die Einsätze in einer 6-Well-Platte und fügen Fibronektin-Lösung (mindestens 500 & mgr; l) in die obere Kammer. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 ° C, entfernen Sie die Fibronektin - Lösung, nehmen die Einsätze aus dem Multi-Well - Platte und legte sie den Kopf auf den Boden einer 150 cm ² Petrischale, die hier als sterile Unterstützung für die verwendet wird , bereits Einsätze beschichtet.
      2. Hinzufügen sanft 800 ul Poly-L-Lysin auf die Unterseite des Einsatzes (wie in 1A gezeigt, als RCAs seeding bezeichnet) und Halten der Lösung auf den Einsätzen für 1 h bei RT.
      3. Absaugen die Lösung und lassen Sie die Einsätze für 15-30 min bei RT trocknen. Die Einsätze sind nun bereit für die Zellaussaat, kann aber auch für mehrere in der Multi-Well-Platte gespeichert werdenTage bei 4 ° C, bevor sie mit dem BBB Konstruktion fortfahren.
         Hinweis: Denken Sie daran, mindestens 3 beschichteten Einsätze frei von Zellen zu halten, als Kontrollen verwendet werden, um BBB-Einrichtung von FD40 Flussmessungen zu validieren.
   2. Seed RCAs (35.000 / cm ²⁾ auf die Unterseite der Poly-L-Lysin-beschichtete Einsätze, durch Eintropfen 800 & mgr; l der Zellsuspension auf den Kopf Einsatz (1A). Verlassen das RCA-Suspension auf die Einsätze 4 h bei RT, um eine effiziente Bindung der Zellen an die Membran zu ermöglichen.
   3. Saugen Sie das restliche Lösung, legen Sie die Einsätze in Vertiefungen , die 2 ml SECM und halten die Multi-Well - Platte bei 37 ° C und 5% CO ₂ in einer feuchten Atmosphäre, die SECM alle 2 Tage zu ändern.
   4. Nach 3 Tagen, wenn die RCAs haben die untere Fläche des Einsatzes, Samen RBMECs auf die obere Seite des Einsatzes, diesen Schritten folgt beschichtet:
      1. Nehmen Sie RBMECs aus T175-Flaschen und zählen dieInsgesamt lebenden Zellen, wie 1.1.2 und 1.1.3 in den Schritten berichtet.
      2. Seed RBMECs (60.000 / cm ²⁾ auf die obere Oberfläche des Einsatzes in SECM (1000 & mgr; l) (1B), so dass 3 - Einsätze mit den Astrozyten nur als TEER Hintergrund verwendet werden. Legen Sie die Multi-Well-Platte in Standardkulturbedingungen. Pflegen Sie das System zur Kultur für mindestens 3 Tage, alle 2 Tage, um die SECM in der inneren und der unteren Kammer zu verändern.

2. BBB Validation

1. TEER Mess
   1. Am ^3. Tag der Co-Kultur, die TEER überprüfen , indem Sie die BBB-Lagerschalen in eine geeignete Kammer eingefügt (das hat eine Kappe und wo beide Kammer und Kappe enthalten ein Paar spannungs Erfassungs- und Stromelektroden), gefüllt mit 4 ml SECM. Eine Verbindung mit einem Epithelgewebe Volt / Ohmmeter.
   2. Zusammen mit den TEER-Messungen der Zell BBB-Systeme, die TEER-Werte der drei Einsätze notieren Sie die RCAs Lager that wird von den Werten der BBBs erhaltenen abgezogen werden. Multiplizieren die resultierenden TEER - Werte durch die Oberfläche des Einsatzes (4.2 cm ^2), um die Ergebnisse als ² Ω x cm auszudrücken.
   3. Vom ^3. Tag der Co-Kultur, jeden Tag die TEER messen. Anmerkung: Nach einer anfänglichen Periode , wo der TEER zunimmt, sollten die aufgezeichneten Werte für mindestens zwei aufeinanderfolgende Tage ( in der Regel zwischen dem ^5. und ^7. Tag Kokultur) stabil bleiben. An diesem Punkt ist die BBB bereit für den zweiten Schritt der Validierung (Abschnitt 2.2) und / oder für die trans BBB Experimente.
      Hinweis: Die Vorgehensweise in Abschnitt 2.1 kann auf die folgenden Permeabilität Experimente (Abschnitt 3) gewidmet auf den gleichen BBB-Systeme durchgeführt werden. Betreiben Sie unter sterilen Bedingungen.
2. Trans-BBB Flux von FITC-Dextran 40 (FD40)
   1. Messen Sie den FD40 Fluss von der oberen in die untere Kammer der BBB-Modelle im Vergleich zu über 3 leere Einsätze(Siehe Hinweis in Abschnitt 1.2.1) nach den folgenden Schritten:
      1. 1 mg / ml FD40 (verdünnt in SECM) in die obere Kammer des BBBs, und nach 1, 2 und 3 Stunden zurückziehen 200 ul SECM aus der unteren Kammer und messen die Fluoreszenzintensität durch Spektralfluorimeters (λ _ex 488 nm, λ _em 515 nm, Schlitz 5).
      2. Besorgen Sie sich die Werte für die SECM Hintergrund fluorescenceby 500 ul virgin Medium Messung der gleichen analytischen Parametern. Ziehen Sie die SECM Hintergrundfluoreszenz von allen FD40 Fluoreszenzwerte.
      3. Bestimmung der Menge des durch FD40 durch Vergleich der beobachteten Fluoreszenzwerte mit einer Eichkurve mit bekannten Konzentrationen hergestellt (d. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / ml) des fluoreszierenden Tracers in 500 ul SECM gelöst.
      4. Berechnen der scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P _app) aus den Mittelflusswerte gemäß:
         P _app = J / AC
         Wobei J der Fluss des Moleküls (mol / sec) ist, A die Permeationsfläche (cm ²⁾ und C die Konzentration des Moleküls in der oberen Kammer (Mol / cm ³⁾ ist.
         Hinweis: Drei oder mehr BBB-Systeme, die geeignete TEER-Werte erreicht haben, müssen gewidmet werden ausschließlich zu diesem Validierungsverfahren und sollten nicht für die folgenden Permeabilität Experimente (Abschnitt 3) eingesetzt werden. Sterility ist nicht zwingend.

3. Trans BBB Permeation von FITC-geladen Ferritine (FNN)

Hinweis: Eine rekombinante Variante von humanem Ferritin (Fn), hergestellt in Escherichia coli und montiert in Nanokäfige (FNn) zur Verkapselung von verschiedenen fluoreszierenden Molekülen, aus dem NanoBioLab von Prof. Prosperi (Universität Mailand-Bicocca, Italien) erhältlich ist. Fnn mit FITC geladen, entsprechend einem zuvor beschriebenen Protokoll ¹³ und den Konzentrationen sowohl von Fn und die geladenen Moleküle genau determined.

1. Trans-BBB Flux von FITC und FITC-FNN
   1. Messen Sie die FITC-fnn Fluss von der oberen zur unteren Kammer validierter BBB Modelle (üblicherweise am ^5. - ^7. Tag der Co-Kultur), im Vergleich zu dem des freien Farbstoffes nach 7 und 24 Stunden der Inkubation gemäß die folgenden Schritte:
      1. In FITC-FNN (50 ug / ml FNN, 1,1 uM FITC) oder eine gleiche Menge an freiem FITC in die obere Kammer von mindestens 6 BBB-Systeme für jede Formulierung, um 2 ml SECM Lösung aus der unteren Kammer zurückzuziehen von mindestens 3 Einsätze nach 7 h, und von der unteren Kammer von anderen 3 Einsätze nach 24 Stunden.
      2. Messen der Fluoreszenzintensität von 500 & mgr; l der gesammelten Proben durch Spektrofluorimeter (λ _ex 488 nm, λ _em 515 nm, Schlitz 5).
      3. Beziehen Sie die SECM-Hintergrundfluoreszenz von 500 ul Medium Messung der gleichen analytischen Parametern. Ziehen Sie die SECM Hintergrundfluoreszenzvon allen FITC oder FITC-FNN Fluoreszenzwerte.
      4. Bestimmung der Konzentration des permeierten FITC oder FITC-fnn durch die erhaltenen Fluoreszenzwerte mit zwei verschiedenen Kalibrierungskurven erzeugt mit bekannten Konzentrationen zu vergleichen (d. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) des freien oder nanoformulated Farbstoff in 500 ul SECM gelöst.
2. FITC-FNN Lokalisierung in RBMECs
   1. Entfernen SECM aus der oberen Kammer der BBB-Systeme, waschen Sie die Einsätze mit PBS und fixieren die RBMECs auf mindestens zwei Einsätze für jede Versuchsgruppe durch Zugabe von 500 ul Paraformaldehyd (4% in Phosphatpuffer Saline-PBS) in der oberen Kammer 10 min bei RT.
   2. Waschen Sie die Einsätze dreimal mit PBS Restparaformaldehyd zu entfernen.
      Anmerkung: Von diesem Punkt an die Sterilität nicht notwendig ist.
   3. Schneiden Sie geeignete Stücke der PET-Membran, und fahren Sie mit der immunodecoration der Zellen gemäß den folgenden Schritten:
      1. Permeabilize RBMECs mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten. Durchführen eines Blockierungsschritt für 1 h bei RT mit einer Lösung, die 2% Rinderserumalbumin (BSA), 2% Ziegenserum in PBS. Inkubieren der Proben mit einem anti-von Willebrand Faktor (VWF) bei einer Verdünnung von 1:20, für 2 h bei RT.
      2. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, setzen die Zellen für 2 h bei RT zu einer 2% BSA, 2% Ziegenserum-Lösung mit einer geeigneten sekundären Antikörper bei einer 1 enthält: 300 Verdünnung, um zu offenbaren, die anti-VWR und DAPI bei a 1: 1500 Verdünnung für Kerne Erkennung.
   4. Montieren Sie die Einsatzstücke auf Objektträger unter Verwendung einer verblassungshemmenden Montagelösung (ein Tropfen pro Insert-Fragment), dann schließen Sie die Probe mit einem Deckglas. Analysieren durch konfokale Mikroskopie eine Öltauchlinse bei 40-facher Vergrößerung unter Verwendung von 1,5-Zoom und 1.024 x 1.024 Pixel Auflösung.

Ergebnisse

Während der Einrichtung der BBB-Modell, die Zellanheftung und Wachstum auf der Einsätze können mit einem Lichtmikroskop durch die transparente Natur der PET-Membranen werden überwacht. RCAs, bei einer Dichte von 35.000 Zellen / cm ^2, befestigen effizient an der Unterseite des Einsatzes nach 4 h Inkubation bei RT (2A) und wachsen , um die Membranoberfläche in 3 Tagen zu bedecken, eine spindelförmige Morphologie wobei (2B). RBMECs, bei ein...

Diskussion

Die in vitro hier beschriebene Verfahren stellt einen nützlichen Ansatz validierten die trans-BBB Lieferung von fluoreszierenden Molekülen auf Nanoformulierung mit Nanopartikeln zu studieren. Hier verwenden wir FNN, die einen guten Kandidaten stellt die Verlagerung von Fracht-Moleküle über die BBB zu studieren. Fnn ist das Gold nanovector für trans-BBB Lieferung von Arzneimittel / Mittel angesehen, da sie spezifisch durch die TfR1 Rezeptor erkannt wird, die auf der luminalen Membran BMECs exprimiert und ve...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000