JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Zusammenfassung

Im letzten Jahrzehnt gab es ein Wiederaufleben in der Verwendung von Pflanzenprotoplasten gegeben, die von Modellarten reichen Spezies zu beschneiden, für die Analyse von Signalwegen, Transkriptionsregulationsnetzwerke, die Genexpression, Genom-Bearbeitung und Genin. Darüber hinaus wurden erhebliche Fortschritte bei der Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten hergestellt worden, die noch mehr Interesse an der Nutzung dieser Systeme für Pflanzengenom erzeugt hat. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Automatisierung der Isolierung von Protoplasten und Transformation von einem 'Bright Yellow' 2 (BY-2) Tabaksuspensionskultur unter Verwendung einer Roboterplattform entwickelt. Die Transformationsverfahren wurden unter Verwendung eines orangefarbenen fluoreszierendes Protein (OFP) Reportergen (pporRFP) unter der Steuerung des Mosaikvirus 35S-Promotor Cauliflower validiert (35S). OFP-Expression in Protoplasten wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie bestätigt. Die Analysen enthalten auch Protoplasten Produktionseffizienz Methoden propidium Jodid. Schließlich wurden Low-Cost-Lebensmittel-Grade-Enzyme für die Protoplasten-Isolierungsverfahren verwendet, wodurch die Notwendigkeit für Labor-Grade Enzyme zu umgehen, die im Hochdurchsatz automatisierte Isolierung von Protoplasten und Analyse zu kostspielig sind. Basierend auf dem Protokoll in dieser Arbeit entwickelt wurde, kann der gesamte Vorgang von Isolierung von Protoplasten zur Transformation durchgeführt werden, in weniger als 4 Stunden, ohne Eingabe vom Bediener. Während das Protokoll in dieser Arbeit entwickelte mit der BY-2-Zellkultur bestätigt wurde, sollten die Verfahren und Methoden auf jede beliebige Pflanze Suspensionskultur / Protoplasten System übersetzbar sein, die Beschleunigung von Pflanzengenomforschung ermöglichen soll.

Einleitung

In den letzten Jahren hat es erhebliche Impulse auf die Gestaltung von transgenen Kulturen gelegt worden , um verschiedene Krankheiten 1, verleihen Herbizidresistenz 2, verleihen Dürre 3,4 und Salztoleranz 5, verhindern Herbivorie 6, erhöhen Biomasseertrag 7 und verringern Zellwand Widerspenstigkeit überwinden 8. Dieser Trend wurde durch die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge zur Erzeugung transgener Pflanzen Aided, einschließlich Genom-Bearbeitung mit CRISPR und Talens 9 und Gen durch dsRNA - Silencing 10, miRNA 11 und siRNA 12. Während diese Technologien die Erzeugung transgener Pflanzen vereinfacht haben, haben sie erstellt auch einen Engpass, wo die schiere Anzahl der transgenen Pflanzen erzeugt wird, nicht traditionellen Systemen mit gescreent werden, die auf die Pflanzenregeneration verlassen. Im Zusammenhang mit diesem Engpass, während zum Schweigen zu bringen und Genom-Editing-Konstrukte schnell in Pflanzen eingeführt werden kann, sind viele dergezielte Züge nicht den gewünschten Effekt zu erzeugen, die oft erst entdeckt, wenn Pflanzen im Gewächshaus analysiert werden. In dieser Arbeit haben wir ein Verfahren zur schnellen, automatisierten Hochdurchsatz-Screening von Pflanzenprotoplasten entwickelt, die speziell den aktuellen Engpass in der frühen Screening einer großen Anzahl von Genombearbeitung und Gen-Silencing Ziele zu adressieren.

Die Verwendung von Protoplasten zu intakten Pflanzenzellen gegenüber, hat mehrere Vorteile für die Entwicklung eines automatisierten Plattform. Zuerst Protoplasten werden aber nach Aufschluss der Pflanzenzellwand isoliert und mit dieser Barriere nicht mehr vorhanden ist , wird die Transformationseffizienz 13 erhöht. In intakten Pflanzenzellen gibt es nur zwei etablierte Methoden zur Transformation, Biolistik 14 und Agrobacterium -vermittelte Transformation 15. Keines dieser Verfahren kann leicht an Liquid-Handling-Plattformen übersetzt werden, wie Biolistik erfordert spezielle Ausrüstung für transformation, während Agrobacterium -vermittelte Transformation erfordert Kokultur und anschließende Entfernung der Bakterien. Weder sind zugänglich für Hochdurchsatzverfahren. Im Falle von Protoplasten wird routinemßig Transformations 16, unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) -vermittelte Transfektion durchgeführt , die nur mehrere Lösungs Austausch erfordert, und ist ideal für Liquid - Handling - Plattformen geeignet. Zweitens, Protoplasten, per Definition, Single-Zellkulturen sind, und damit die mit Verklumpung und Kettenbildung verbundenen Probleme in pflanzlichen Zellkulturen, die nicht in Protoplasten beobachtet. Im Hinblick auf die schnelle Screening eine plattenbasierte Spektrophotometer, Verklumpung von Zellen, oder Zellen in mehreren Ebenen werden in den Erwerb konsistente Messungen zu Schwierigkeiten führen. Da Protoplasten auch dichter ist als die Kulturmedien sind, sedimentieren sie auf den Boden des Wells, um eine Monoschicht bilden, die für plattenbasierte Spektrophotometrie förderlich ist. Schließlich, während Pflanzenzellkulturen sind primarily aus Kallus 17 abgeleitet, Protoplasten können aus einer Anzahl von Pflanzengeweben geerntet werden, zu der Fähigkeit führt die gewebespezifische Expression zu identifizieren. Zum Beispiel kann die Fähigkeit, Wurzel- oder blattspezifische Expression eines Gens kann sehr wichtig sein, um Phänotyp Vorhersage zu analysieren. Aus diesen Gründen sind die in dieser Arbeit entwickelten Protokolle wurden validiert Protoplasten isoliert von der weit verbreiteten Tabak (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow' 2 (BY-2) Suspensionskultur mit.

Die BY-2 - Suspensionskultur wurde als "HeLa" Zelle von höheren Pflanzen beschrieben worden ist , wegen seiner allgegenwärtigen Einsatz in der molekularen Analyse von Pflanzenzellen 18. Kürzlich wurden BY-2 - Zellen verwendet , um die Effekte der Pflanze zu untersuchen Stressoren 19-22, intrazelluläre Proteinlokalisation 23,24 und Grund Zellbiologie 25-27 der breiten Verwendbarkeit dieser Kulturen in Pflanzenbiologie demonstriert. Ein zusätzlicher Vorteil der BY-2 Kulturen ist dieFähigkeit , die Kulturen mit Aphidicolin zu synchronisieren, was zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit für Genexpressionsstudien führen kann 28. Darüber hinaus wurden für die Extraktion von BY-2 - Protoplasten unter Verwendung von Low-Cost - Enzyme 29,30, als Enzyme traditionell verwendet zur Erzeugung von Protoplasten sind unerschwinglich für Hochdurchsatz - Systeme Methoden entwickelt. Als solches beschriebene Protokoll unter validiert wurde die BY-2-Suspensionskultur verwendet, aber es sollte auf jede Pflanzenzellsuspensionskultur abänderbar ist. Proof-of-Concept - Experimente werden mit einem Orange - Fluoreszenz - Protein (OFP) Reporter - Gen (pporRFP) von den Hartkorallen Porites ausgeführt Porites- 31 unter der Kontrolle des CaMV 35S - Promotors.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Einrichtung Suspension Zellkulturen

  1. Bereiten Flüssigkeit BY-2 - Medien durch Zugabe von 4,43 g Linsmaier & Skoog Basal Medium, 30 g Saccharose, 200 mg KH 2 PO 4 und 200 & mgr; g von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) zu 900 ml destilliertem Wasser und pH-Wert auf 5,8 mit 0,1 M KOH. Nach dem Einstellen des pH, passen auf 1000 ml mit destilliertem Wasser und Autoklaven Endvolumen. Medien können bei 4 ° C zu 2 Wochen gelagert werden.
  2. Beimpfen eines 250 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der Flüssigkeit BY-2-Medien und einem einzigen Stück BY-2 Kallus (> 1 cm Durchmesser) gezüchtet auf festen BY-2-Medien (flüssig BY-2-Medien mit Zusatz von 1% Agar) und Dichtung mit Aluminiumfolie. Inkubiere Kultur bei 28-30 ° C unter Schütteln für 5 Tage.
    HINWEIS: BY-2-Kallus wird auf festen Medien zur Langzeitlagerung aufrechterhalten, wie Flüssigkulturen schnell überwuchern wird. Kultur Volumen kann je nach Bedarf eingestellt werden, in der Regel eine 100-ml-Kultur fähig sein wird, dreiunddreißig 6-w des Ladensell-Platten.
  3. Transfer 2 ml log-Phase BY-2-Kultur zu 98 ml frischem BY-2-Medien und Inkubation für 5-7 Tage bei 28-30 ° C unter Schütteln.
    Hinweis: Sub-Kultivierung von etablierten Flüssigkulturen können regelmäßig durchgeführt werden, unter Verwendung von 1: 100 Verdünnungen von 5-7 Tage alten Kulturen, anstatt Inokulation mit Kallus.
  4. Mischen Sie die Kultur gründlich, wie Zellen sich schnell absetzen und Transfer 6 ml der Zellkultur zu einem 15 ml konischen Boden Zentrifugenröhrchen und lassen Sie die Zellen für mindestens 10 min absetzen. Stellen Sie das gepackte Zellvolumen auf 50% des Gesamtvolumens von Überstand zu entfernen.
  5. Shake Tube durch Umdrehen und pipettieren 500 ul in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte für die Verdauung. Verwenden Sie weiter Bohrung Pipetten, die Zellen in diesem Stadium zu übertragen, da sie dicht sind und verstopfen Standard-Pipettenspitzen.

2. Isolierung von Protoplasten

  1. Schalten Sie alle Komponenten des Robotersystems (Abbildung 1A) und öffnen Sie die Platte mover Prüfvorgänge planen weichWare. Die Task-Scheduling-Programm integriert die Mikromaschine mit den anderen Geräten Übertragung von Platten zwischen den einzelnen Geräten zu ermöglichen.
  2. Vor dem Experimentieren, definieren Sie die technischen Spezifikationen für die Laborgeräte (zB Platten, Deckel) in das verwendete Protokoll sowie Start- und Endposition für jedes Stück labware, in der Platte Mover Software wie folgt:
    1. Klicken Sie auf Setup aus dem Hauptwerkzeugleiste in der Platte Mover Software und wählen Sie das Verwalten von Containertypen Befehl.
    2. Wenn der Behältertyp wird in der bestehenden Containertyp Bibliothek aufgeführt, dann wählen Sie den entsprechenden Container.
    3. Wenn der Behältertyp nicht in der vorhandenen Container Typbibliothek aufgeführt wird und klicken Sie auf Hinzufügen eines neuen Containertyp angeben.
    4. Einen neuen Behältertyp, legen Sie die Dimensionen des neuen Behälters (Höhe, Breite, Stapelabmessungen und Greifer Offset) in den entsprechenden Registerkarten und klicken Sie auf Speichern Nach dem Hinzufügen.
      1. Wenn die richtigen Abmessungen des Herstellers nicht verfügbar sind, dann genau bestimmen alle Dimensionen auf den Millimeter genau Sätteln mit. Fehler, die die Behälterabmessungen bei der Messung wird zu einem Ausfall der Platte Mover führen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 bis 2.2.4.1 für alle Containertypen, die die Platte Mover begegnen. Nach Abschluss dieses Schrittes für alle Labware, ist es notwendig, den Anfang und das Ende Position für jeden Behälter (Schritt 2.2.6) zu definieren.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll die labware beinhaltet die 6-Well-Platte, die Deep-Well-Platte, und die 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte.
    6. Um die Start- und Endposition jedes Behälters zu definieren, klicken Sie auf die Start / Ende Registerkarte in einem bestimmten Protokoll. Wählen Sie zuerst die Startposition jedes Behälters. Als nächstes überprüfen Sie die Box für Lidded / Unlidded sowohl an der Start- und Endposition. Wiederholen Sie dies für alle Container.
      HINWEIS: Wenn der Behälter auf einem anderen Stück EQU gelassen werdenipment (anstelle der Platte Mover) der Endstelle kann leer gelassen werden.
  3. Zu diesem Zeitpunkt manuell laden alle Platten in die Ausgangsposition für den gesamten Workflow. Laden Sie die 96-Well-fluoreszierenden Abschirmplatten in Hotel 2, 6-Well-Platten mit BY-2-Zellen in Hotel 3, eine 96 Deepwell-Platte, die für die Transformation verwendet wird, auf die Platte Heizung / Kühler Nest 2 und eine 50 ml konischen Rohr die Enzymlösung (siehe Supplemental Datei, Abschnitt 1.2.2) auf den Multimode Spender enthält.
    1. Wenn Transformation in dem Protokoll durchgeführt wird, vorge laden die 96 Deepwell - Platte mit 10 ul von Plasmid - DNA pro Well (1 ug / ul, A 260/280> 1,8), das die OFP - Reporterkonstrukt und brüten auf der Platte Heizer / Kühler bei 4 ° C. Jede Vertiefung wird für eine einzige Transformation verwendet werden, wodurch die Anzahl von Vertiefungen auf der Versuchsaufbau gefüllt abhängen.
  4. Laden Sie alle Lieferungen und Platten auf dem Automated Liquid - Handling - Plattform in den dafür vorgesehenen Stellen und die Position der einzelnen Elemente in der Automatisierungssteuerungssoftware (Abbildung 1B) definieren.
    1. Legen Sie eine 96-Well - Platte vorbelastet mit 200 ul 40% PEG in MMg (0,4 M Mannit, 100 mM MgCl 2, 4 mM MES, pH 5,7) in Spalte 1, 200 & mgr; l Propidiumiodid (PI, 1 ug / ml) in Spalte 2, und 200 ul Ethanol in Spalte 3 (Nest 2), und eine Schachtel mit Pipettenspitzen im Nest 8.
    2. Die Lage des Labware in der automatisierten Liquid - Handling - Plattform - Software, wählen Sie Extras aus dem Menü und klicken Sie auf Labware Editor zu definieren.
    3. Wählen Sie die Art von labware aus dem Pull - Down - Menü oder definieren einen neuen labware geben Sie die neue Labware - Taste.
    4. Definieren Sie die Position jedes Stück labware ausgewählt durch das Hauptprotokoll Registerkarte auswählen und auf Konfigurieren Labware. Stellen Sie sicher, dass jedes Stück von Labware auf der automatisierten Liquid-Handling-Plattform platziert istdefiniert, bevor das Protokoll läuft.
    5. Um die automatisierten Protokolle auslösen, klicken Sie auf das Profil Explorer - Fenster und wählen Sie den Namen des Protokolls ausgeführt werden (Isolierung von Protoplasten, Zellzahl und PEG-vermittelte Transformation).
    6. Klicken Sie auf Ausführen , um alle Geräte zu initialisieren, die in dem Protokoll verwendet wird.
    7. Schließlich wird in dem Fenster Arbeits Explorer, klicken Sie auf Arbeitseinheit hinzufügen alle Container / labware im System zu überprüfen und das automatisierte Protokoll beginnen.
      HINWEIS: Vollständige Beschreibungen der automatisierten Protokolle sind in der Supplemental-Datei enthalten.

3. Stellen Sie Standardkurve für Zellzahlen

  1. Manuell konzentrieren Protoplasten in einer Konzentration von 1 x 10 6 Protoplasten / ml in einem Volumen von 1 ml. Zentrifuge Protoplasten bei 1.000 xg für 10 min, und entfernt den Überstand.
  2. manuell hinzufügen 900 & mgr; l 70% Ethanol zu der Protoplastenpellet (bei 4 ° C gehalten)und resuspendieren Sie das Pellet. Inkubieren für 10 Minuten auf Eis Zellen zu fixieren.
  3. Füge 100 ul PI (1 ug / ml) zu den Protoplasten, die Kerne zu kennzeichnen und den Nachweis durch den Plattenleser.
  4. Last 80 & mgr; l Flüssigkeit BY-2-Medien in jeder Spalte und Zeile der 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte ab Spalte 2.
  5. In der Spalte 1 einer 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte, fügen Sie 70 ul Protoplasten und 50 ul BY-2-Medien in jede Vertiefung in der Spalte.
  6. Die Platte wird in Nest 6 der automatisierten Liquid-Handling-Plattform und führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung.
    1. Um eine serielle Verdünnung auf die automatisierten Liquid - Handling - Plattform durchzuführen, klicken Sie auf Wizard Serielle Verdünnungs starten und das Transfervolumen (60 ul), die Anzahl der Mischungen und Volumen (2, 70 & mgr; l), anfängliche Brunnen (Spalte 1, Zeilen AF) einstellen, Verdünnung Brunnen (Spalten 2-11, Reihen AF) und ansaugen und abgeben Eigenschaften (0,5 mm von gut unten).
    2. Nach der Einstellung der Parameter speichern eind das Protokoll führen.
      HINWEIS: Da alle Protoplasten mit PI (aufgrund Fixierung von Zellen) markiert sind, wird die Fluoreszenz ist proportional zur Konzentration Protoplasten.
    3. Nachdem die serielle Verdünnung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus Nest 9 und in den Plattenleser ein und die Standardkurve Protokoll in der Plattenleser Software.
      HINWEIS: Eine Standardkurve wird dann durch einen Vergleich der Fluoreszenz von PI (Anregung 536 nm / Emission 620 nm) in jeder Vertiefung mit der bekannten Protoplasten Konzentration erzeugt werden.
  7. Nach Abschluss der Leserprotokoll Platte, entfernen Sie die Platte und sammeln Sie alle transgenen Zellen für Autoklaven oder anderen de-Vitalisierung Verfahren wie in Biosicherheit Protokolle definiert ".

4. Die mikroskopische Analyse der Transformation

  1. Entfernen Sie Platte mit transformierten Protoplasten (das Produkt der automatisierten Protokolls 3, Supplemental - Datei) von Hotel 1 des Robotersystems.
  2. Wendeauf inverses Mikroskop, Kamera und Leuchtstofflampe.
  3. Wählen Sie das 10X-Objektiv für die erste auf den Protoplasten konzentriert, schalten Sie die Halogenlampe, und schließen Sie den Auslöser für die Leuchtstofflampe.
  4. Lastplatte auf mikroskopisches System und Fokus auf den Protoplasten Hellfeld-.
  5. Nachdem auf Protoplasten konzentriert, schalten Sie die Halogenlampe, und öffnen Sie den Auslöser für die Fluoreszenzlampe ausgeschaltet.
  6. Wählen Sie das CY3 / TRITC-Filter-Set für die Visualisierung des pporRFP Proteins durch den transgenen Protoplasten zum Ausdruck gebracht.
  7. Scannen Sie jede Vertiefung die Anzahl der Protoplasten zur Bestimmung der pporRFP Fluoreszenzmarker exprimieren.
  8. Berechnen der Transformationseffizienz als die Gesamtanzahl der Protoplasten, die fluoreszierenden Markierung, um die Gesamtanzahl der Protoplasten exprimiert.
  9. Sammeln Sie alle Platten transgenen Zellen in zugelassenen Biosicherheit Beutel für Autoklaven oder anderen de-Vitalisierung Verfahren enthalten, wie in Biosicherheit Protokolle "definiert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

In der gegenwärtigen Studie variierte die Verdopplungsrate des BY-2 14 bis 18 h in Abhängigkeit von der Temperatur, bei der die Kulturen wurden, im Einklang mit früheren Berichten einer mittleren Zellzykluslänge von 15 Stunden inkubiert. Mit dieser Verdopplungsrate, eine 1: 100 Ausgangs Inokulum wurde verwendet, um Kulturen zu starten, was zu Kulturen mit einem gepackten Zellvolumen (PCV) von 50% in 5-7 Tagen. In dem aktuellen Protokoll, in denen Kulturen in 200 ml Medium gezüchtet ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Das oben beschriebene Protokoll wurde für Isolierung von Protoplasten, Aufzählung und Transformation mit der BY-2 Tabaksuspensionszellkultur erfolgreich validiert; jedoch könnte das Protokoll leicht an jede Pflanzensuspensionskultur erweitert werden. Derzeit Isolierung von Protoplasten und Transformation wurde in zahlreichen Pflanzen, darunter Mais (Zea Mays) 10, Karotte (Daucus carota) 32, Pappel (Populus euphratica) 33, Traube (Vitis vinifera)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interesse haben.

Danksagungen

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FFormerly Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

Referenzen

  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13(2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831(2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

GenetikHeft 115TabakProtoplastenTransformationenzymatische VerdauungHigh Throughput ScreeningAutomatisierungRobotik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten