Novel Object Exploration als Potential Assay für höherer Ordnung Repetitive Verhalten bei Mäusen

Zusammenfassung

Higher order restricted, repetitive behaviors (RRBs) disrupt the lives of affected individuals. These behaviors are challenging to model in rodents, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for RRBs difficult. Here we describe novel object exploration as a potential assay for higher order RRBs in mice.

Zusammenfassung

Restricted, repetitive behaviors (RRBs) are a core feature of autism spectrum disorder (ASD) and disrupt the lives of affected individuals. RRBs are commonly split into lower-order and higher-order components, with lower order RRBs consisting of motor stereotypies and higher order RRBs consisting of perseverative and sequencing behaviors. Higher order RRBs are challenging to model in mice. Current assays for RRBs in mice focus primarily on the lower order components, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for higher-order RRBs difficult. Here we describe a new assay, novel object exploration. This assay uses a basic open-field arena with four novel objects placed around the perimeter. The test mouse is allowed to freely explore the arena and the order in which the mouse investigates the novel objects is recorded. From these data, patterned sequences of exploration can be identified, as can the most preferred object for each mouse. The representative data shared here and past results using the novel object exploration assay illustrate that inbred mouse strains do demonstrate different behavior in this assay and that strains with elevated lower order RRBs also show elevated patterned behavior. As such, the novel object exploration assay appears to possess good face validity for higher order RRBs in humans and may be a valuable assay for future studies investigating novel therapeutics for ASD.

Einleitung

Autismus - Spektrum - Störung (ASD) ist eine Erkrankung des Nervensystems , bestehend aus drei Kernsymptome: soziale Beeinträchtigung, Schwierigkeiten durch die Sprache zu kommunizieren, und sich wiederholende gemusterte Verhaltensweisen ^1. Seit 2000 ist die Anzahl der Personen , die mit ASD diagnostiziert wurde , wurde von 1 in 150 bis 1 in 68 in der Spanne von zehn Jahren ² erhöht. Obwohl die Prävalenz der Erkrankung weiter zu erhöhen, wird die Ursache der Erkrankung ist noch nicht bekannt. Es hat sich zu einem Anstieg der Bemühungen für den Kern und die damit verbundenen Symptome von ASD entsprechenden Mausmodelle zu identifizieren, da diese Modelle zu einem erhöhten Verständnis der zugrundeliegenden Symptome und Ursachen von ASD führen könnte. Es gibt mehrere Inzucht - Mausstämme , die ^drei Verhaltensweisen , die mit Augenscheinvalidität für die Kernsymptome von ASD, einschließlich repetitive Verhaltensweisen angezeigt erscheinen.

Beschränkt, sich wiederholende Verhaltensweisen (RRBs) sind ein Kernsymptom einigen psychiatrischen Störungen wie ASD.RRBs kann mit der Schwere der Erkrankung ^4, erhöhen und den Lebensstil der Betroffenen drastisch stören können. RRBs werden üblicherweise in zwei Kategorien eingeteilt, niedrigerer Ordnung repetitive Verhaltensweisen, die bei Menschen von Aktionen bestehen wie Schaukeln und Hand flattern; und höherer Ordnung repetitive Verhaltensweisen, die der strikten Einhaltung bestehen , um Routine und Widerstand gegen Veränderungen ^5-8.

Niedrigerer Ordnung repetitive Verhaltensweisen wurden bei Nagetieren umfassend untersucht , wo sie als Motor Stereotypien manifestieren, die sich leicht im Labor ⁹ beobachtet werden können. Diese Verhaltensweisen scheinen gute Augenscheinvalidität beim Menschen für RRBs haben und möglicherweise starke Konstruktvalidität sowie ^10. Die Prüfung auf das Vorhandensein von niedrigerer Ordnung RRBs kann durch Video - Überwachung der Mausaktivitäten abgeschlossen werden , um die Kämpfe und die Dauer dieser Motor Stereotypien ¹¹ zu studieren. Höherwertige repetitive Verhaltensweisen stellen eine Herausforderung für die grundlegende biomedizinische reSuche Nagetiere verwendet, da diese RRBs sind nicht so leicht durch einfache Beobachtung identifiziert. Aufgrund der Schwierigkeit, diese Verhaltensweisen zu identifizieren, gibt es weniger etablierte Assays für höherer Ordnung repetitive Verhaltensweisen. Traditionell wurden höherer Ordnung RRBs wurden bei Nagetieren mit einem Labyrinth Paradigma gemessen, wo das Versuchstier trainiert Kompetenz in Flucht zu erreichen. Die Escape - Standort wird dann eingeschaltet und die Anzahl der Versuche die Flucht Lage neu zu lernen erforderlich ist ¹² aufgezeichnet. Diese Tests sind nicht ideal, da sie eine längere Einarbeitungszeit erfordern, die oft Angst hervorrufen und kann in sehr unterschiedlichen Ergebnissen führen. Loch-Board - Exploration ist auch verwendet worden höherer Ordnung ^13,14 RRBs zu quantifizieren. Dieser Ansatz erfordert keine längere Trainingseinheiten, sondern verlässt sich auf die Lebensmittel Motivation und / oder olfaktorischen Diskriminierung. Assays für die höhere Ordnung RRBs, die nicht anxiogen sind oder erfordern Ausbildung eine schöne Ergänzung zum bestehenden Repertoire von Loch Bord explo wäre n und Labyrinth-basierte Assays derzeit im Einsatz.

Die C58 / J (C58) Inzuchtmausstamm ein Beispiel für stark ein hohes Maß an Stereotypien mit ASD verbunden sind , nämlich sich wiederholend, zwecklos Motor Stereotypien und erhöhten Selbst Grooming ^3,11. Darüber hinaus zeigen die C58 Mäuse RRBs durch ein hohes Maß an Aufzucht, zurück Spiegeln und ^11,14,16 krabbelten. Dieser Stamm beginnt diese Verhaltensweisen früh in der Neugeborenenperiode zeigt und setzt sie im Erwachsenenalter angezeigt werden soll. Es wäre ideal, um auf das Vorhandensein von erhöhten höherer Ordnung RRBs zu testen, die gut dokumentierten niedrigerer Ordnung RRBs in diesem Stamm sowie andere Mausstämme zu ergänzen. Das neue Objekt Exploration beschriebene Test hier bietet die Möglichkeit für Forscher niedrigerer Ordnung und RRBs höherer Ordnung gleichzeitig zu beobachten, da es die Möglichkeit gibt, strukturierte Verhaltensweisen sowie repetitive motorische Stereotypien zu messen.

e_content "> Verwendung von neuartigen Objekt Exploration als ein Test für eine höhere Ordnung repetitive Verhaltensweisen wurde von Pearson et al. ^17. Diese neue Einschätzung ist eine Erweiterung der etablierten offenen Feldtest ^18-21 mit dem Zusatz von vier neuen Objekte die Arena. die Mäuse wurden diese unbekannten Objekten und die Anzahl und Reihenfolge der Objekt Untersuchungen aufgespürt wurde frei untersuchen erlaubt. die Objekt Untersuchungen dann auf das Vorhandensein von Mustern analysiert wurden, mit BTBR Mäuse unter den Objekten erhöhten Zahlen von gemusterten Untersuchungen angezeigt werden. mit dieser Assay, Mäuse können höherer Ordnung wiederholend und gemusterten Verhalten anzuzeigen, während die Notwendigkeit beseitigt Verhaltensweisen sowie die Beseitigung unnötiger Reize zu lernen. Neuartige Objekt Exploration induziert höherer Ordnung RRBs, wie es die Mäuse können Muster und Form Sequenzen durch ihre natürliche Exploration zu schaffen . Unter Verwendung dieses Tests die Ermittler ermöglicht das Vorhandensein dieser höherer Ordnung RRBs zu quantifizieren.

Pearson et al. dieses Assays entwickelt und verwendet es ¹⁷ für die Anwesenheit von potentiellen höherer Ordnung wiederholender Verhaltensweisen in der BTBR Inzuchtmausstamm mit interessanten Ergebnisse zu testen. Wir haben vor kurzem eine Follow-up-Studie Blick auf die Verhaltensweisen der C58, C57BL / 6J (C57) und FVB / NJ (FVB) Stämme, sowie eine detailliertere Untersuchung in potentielle Störvariablen in diesem Test und mögliche veröffentlicht statistische Ansätze , die Daten zu analysieren ²² erzeugt.

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Protokoll

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Redlands genehmigt. Die C58, C57 und FVB-Mäuse in diesen Studien verwendet wurden an der University of Redlands Vivarium gezüchtet ab Lager vom Jackson Laboratory ursprünglich (Bar Harbor, ME). Sentinels von diesem Vivarium wurden alle sechs Monate überprüft und gefunden Erreger frei zu sein.

1. Ausstattung und Rauminstallation

Hinweis: Wir haben zwei verschiedene Arenen für neuartige Objektprüfung: eine klare Kunststoff-rechteckigen Käfig (45 cm x 24 cm x 20 cm) oder ein undurchsichtiger Kreis Käfig mit einem Basisdurchmesser von 41 cm; Es kann jedoch jeder Käfig verwendet werden. Pearson et al. Verwendet , um einen kleineren rechteckigen Käfig (20 cm x 30 cm x 20 cm) in ihrer Assay. Einzelheiten von diesem spezifischen experimentellen Design sind unten aufgeführt, aber die Neuheit dieses Tests gegeben, gibt es keine anerkannten Standards im Bereich der Verhaltens Phänotypisierung für jede der beschriebenen Variablen.

1. Füllen Sie das Testfeld mit ca. ½ in der Maiskolben Bettwäsche.
2. Wählen Sie vier verschiedene neue Objekte. Wählen vier Objekte, die in etwa gleich groß sind, mit hoher Dichte Kunststoff aufgebaut Reinigung zu erleichtern und zu widerstehen Kau- und voneinander verschieden in Form und Farbe. Wichtig ist, sicherzustellen, dass die Testmäuse auf diese Objekte nicht ausgesetzt werden, bis in dem Test ausgeführt wird.
   Hinweis: Zum Beispiel, ein rosa Spielzeug Ziegel, ein roter Affe, eine weiße Fliese mit blauer Schrift und ein Standard-weißen Würfel wurden hier verwendet.
3. In der rechteckigen Arena, legen Sie diese Objekte in etwa 3 cm von den Ecken. In der Runde Arena, legen Sie die Objekte, so dass sie in gleichen Abständen zueinander und etwa 10 cm von den Seiten sind. Zeichnen Sie die Platzierung jedes Objekt als eine andere Zahl, 1-4 (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Gegenstände in einer zufälligen oder ausgeglichen, um während des Tests angeordnet sind.
4. Positionieren Sie eine Kamera direkt über dem TestArena die gesamte Arena während der Akklimatisierung und Testperioden aufzuzeichnen.
   Hinweis: Ermittler im selben Raum mit den Mäusen zu haben, kann potenziell Aktivitätsniveau beeinflussen und Exploration während des Tests.

2. Novel Object Exploration-Test

1. Test am Anfang des Lichtzyklus in einem Raum mit fluoreszierendem Licht bei etwa 100 lux beleuchtet. Stellen Sie sicher, dass die Beleuchtung über das Testfeld gleichmäßig ist Aussehen, während Videoaufzeichnung zu standardisieren.
2. Legen Sie eine Notecard mit bekannten Abmessungen in der Unterseite der Testarena und Videoaufzeichnung beginnen.
3. Übertragen Sie die Test Maus in eine leere Testfeld für 10 min als Eingewöhnungszeit zu dienen. Videoaufzeichnung der Eingewöhnungszeit.
4. Nach der Eingewöhnungszeit, lassen Sie die Maus in der Arena, die vier neue Objekte in die Test Arena schnell hinzufügen und das Mausverhalten für weitere 10 Minuten aufzeichnen.
5. Sobald die volle 20 Minuten Akklimatisierung / Prüfung peRIOD verstrichen ist, kehren Sie den Test Maus in seinen Käfig zu Hause und gründlich zu reinigen und zu trocknen, die die neuen Objekte und Testfeld mit unscented Spülmittel und Wasser.

3. Video-Scoring

1. Füllen Sie alle Verhaltensscoring mit Video-Zuverlässigkeit zu erleichtern.
   Hinweis: Die Verhaltenserfassungssoftware Noldus Der Observer verwendet wurde , um die Schritte auszuführen , ²² , wie hier beschrieben, aber ein spezielles Programm ist nicht erforderlich:
   1. Vor dem ersten Video-Scoring, stellen Sie das Projekt Codierungsschema in der Verhaltens-Logging-Software, indem Sie ein neues Projekt erstellen oder eine vorhandene, ähnliches Projekt bearbeiten.
      1. Im Setup-Box-Projekt festgelegt Datenerfassung auf 'Offline Beobachtung. " Innerhalb des Verhaltens Codierung, Programm "Scrabble", "Graben", "Aufzucht", "Grooming" und "Sniff Objekt 1, 2, 3 und 4" als "staatliche Events". Programm "Springen" als "Punkt-Ereignis". Hinweis: Definitions für diese Verhaltensweisen sind im Detail an anderer Stelle ¹¹ beschrieben.
         Hinweis: State Events einen Start haben und die Zeit stoppen, während Point Events einfach Zähldaten sammeln. Die Tastenanschläge für jede diskrete Verhalten werden von der Software erzeugt und diese entsprechenden Tastenanschläge werden in einen Sekundär Tastatur (Schritt 3.1.2) programmiert.
      2. Um die Sekundär Tastatur programmieren, die Tastatur-Software öffnen, klicken Sie auf die entsprechende Sekundär Tastatur-Taste auf dem Bildschirm, geben Sie in der entsprechenden Tastenkombination angezeigt wird, und klicken Sie auf OK. Sobald die sekundäre Tastatur programmiert ist, schließen Sie die Software als das Programm im Hintergrund des Computers ausgeführt werden.
   2. Sobald das Projekt und wurde eingerichtet, die Verhaltens-Logging-Software verwenden, um die Anzahl und Dauer der bäumt punkten (definiert als beide Vorderpfoten auf einer Wand der Arena platziert wird), gräbt (definiert als zwei Vorderpfoten der Maus Wühlen in die Betten der Arena), selbst Bräutigame (als m definiertOuse jede Region ihren eigenen Körper zu lecken und / oder mit der Maus einen beliebigen Teil des Gesichts mit den Vorderpfoten) zu berühren, und springt (wie eine Maus Haltung definiert und springt dann so, dass alle vier Meter über dem Boden sind gleichzeitig).
      1. Um ein Video zu erzielen, gehen Sie zu Datei> Projekt öffnen und dann Beobachten> Beobachtung> Neu. Das Programm fragt nach einem Dateinamen. Sobald benannt, wählen Sie die entsprechende Videomediendatei.
      2. Beginnen Sie den Torreigen auf die Schaltfläche Start Beobachtung durch einen Klick.
         Hinweis: Wenn die Maus sich wiederholende Verhalten Scoring, alle staatlichen Ereignisse erfordern zwei Tastenanschläge, die erste auf die Einleitung des Verhaltens entspricht, und die zweite bis zum Ende des Verhaltens entspricht. Point Events nur einem Tastendruck erfordern.
   3. Ergebnis die Anzahl der Male der Maus jedes Objekt schnupperte. Sniffs werden als jederzeit definiert eine Maus die Nase bewegt sich innerhalb von 0,5 cm eines Objekts. Messen Sie schnüffeln Dauer Verhaltens-Logging-Software auf die gleiche Weise verwenden, die Repetitive Verhalten Dauern wurden gemessen (Schritt 3.1.2).
      1. Jedes Mal , wenn eine Maus ein Objekt schnüffelt, notieren Sie die entsprechenden Positionsnummer, die zu einer Reihe von Zahlen , die durch das Ende der 10 Minuten Testzeit (zB 1243421 ...) führen wird. Aufzeichnung manuell diese Daten.
         Hinweis: Zur Erleichterung der Effizienz und Konsistenz während Scoring-Videos, die Zahlen immer zu einer bestimmten Position entsprechen, nicht widersprechen.
      2. Wenn eine Maus ein Objekt schnüffelt, schaut weg, dann wieder das Objekt schnüffelt, doppelt so viele zählen.
      3. Sobald die volle 10 min Video erzielt wurde, zu visualisieren, die Daten mit einem Klick auf Analysieren> Behavior Analysis> Neu. Einmal werden die Daten auf dem Bildschirm, Export oder Kopieren und Einfügen in eine separate Tabelle.
   4. Notieren Sie die Gesamtstrecke der Maus in der Arena während des Tests gereist.
      Hinweis: Die Video-Tracking-Software, kalibriert, um die Test-Maus zu verfolgen und die Gesamtdistanz in Zentimeter bewegt aufzunehmen, wurde verwendet,um diesen Schritt auszuführen. Alle von der Video-Tracking-Software erzielte Videos hatte eine Notecard mit bekannten Dimensionen in der Arena zu Beginn des Videos platziert.
      1. Verwenden Sie die Notiz ein Video innerhalb der Software zu kalibrieren, indem eine Kalibrierungslinie entlang jedem Ende der Notecard Einstellung und Eingabe der entsprechenden Länge innerhalb der Kalibrierungsbildschirm der Software. Sobald die Linien gezogen sind, geben die bekannte Länge und Breite der die Notiz, die jeder Zeile entsprechen.
      2. Im Arena-Einstellungen, die gesamte Arena wählen.
         Hinweis: Getrennte Bereiche der Arena können in der Software differenziert werden , wenn zum Beispiel die Mausbewegung entlang der Wände gegen die durch den Mittelpunkt des Interesses stand.
      3. Im Teststeuerungseinstellungen, wählen Sie eine von zehn Minuten Dauer. In Erkennungseinstellungen, ein dunkles Objekt auf einem hellen Hintergrund wählen.
         Anmerkung: Diese müsste geändert werden, wenn Albino-Mäuse wurden verwendet oder wenn der Hintergrund war ein dunkler Schatten.
      4. Sobald die Einstellungenprogrammiert wurden, um die Videos punkten. Klicken Sie auf Acquisition> Öffnen Acquisition. Im Feld Acquisition Control auf Neuer Versuch und dann Test starten. Nach zehn Minuten vergangen sind, kann das Programm stoppt und die Daten visualisiert werden.
      5. Klicken Sie auf Analysieren> Statistik berechnen. Einmal werden die Daten auf dem Bildschirm, Export oder Kopieren und Einfügen in eine separate Tabelle.

4. Statistische Analysen, Sequencing

1. Innerhalb der Reihe von Zahlen entsprechenden Untersuchungen jeder Maus erzeugt Objekt, identifizieren die Gesamtzahl aller möglichen Ziffernkombinationen 3 ohne Wiederholungszahl (zB 121, 123, 124 , aber nicht 112 oder 122).
   Hinweis: Ein Programm, geschrieben in Python Programmiersprache verwendet wurde, die Anzahl der jeweils mögliche Sequenz in der Zahlenfolge angezeigt zu identifizieren. Es ist nicht notwendig , eine externe Programm zu verwenden, und dieser Schritt viele verschiedene Weisen durchgeführt werden könnte (beispielsweise unter Verwendung voneine Suche-Funktion in Microsoft Word oder Excel).
2. Aufzeichnen der Anzahl der Male jede Sequenz auftritt und zu identifizieren, die drei am häufigsten wiederholten Sequenzen für jede Maus.
   Anmerkung: Einzelsequenzen variiert , indem die Maus und die tatsächliche Sequenz von geringerem Interesse als die Anzahl , wie oft eine Sequenz wiederholt (dh Einhaltung eines Muster wichtiger als das Muster selbst).
3. Da die Gesamtzahl der Sequenzen, die eine Maus wiederholt positiv Aktivitätsniveau korreliert wird, diese Werte zu korrigieren, indem die Menge der am häufigsten Muster durch die Gesamtanzahl von Mustern für jede einzelne Maus, geteilt wird. Dies wird eine Sequenz wiederholen Index ergeben, die unabhängig von Gesamtaktivität ist.
4. Vergleichen Sie die Anzahl , wie oft jede Maus ihrer häufigsten Sequenzen wiederholt (für Aktivitätsniveau korrigiert) zwischen den Gruppen eine entsprechende ANOVA, multiple Vergleichsverfahren (Dunnett-Test, für zB) und Post-hoc - Tests.

5. Statistische Analysen, Objekt Bevorzugt

1. Unter Verwendung der gleichen Reihe von Zahlen über (Schritt 3.1.3.1) erzeugt wird, identifizieren die neue Objekt bevorzugt jeder Maus durch die Gesamtzahl der Male zählt jedes Objekt untersucht wurde, oder in anderen Worten, die Gesamtzahl von 1 sec Zählen, 2 sec 3 s und 4 s in der Zeichenkette der Daten. Richtige für Aktivität und vergleichen über ANOVA, wie oben beschrieben (Schritte 4,3-4,4).
   Hinweis: Diese Methoden veröffentlicht von unserem Labor ²² und hier beschrieben basieren stark auf Pearson et al ^17.

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Ergebnisse

Die repräsentative Daten ²² zeigen , dass weibliche C58 / J - Mäuse eine höhere Anzahl an sequenzierten Muster als die anderen Stämme in der runden Arena angezeigt (Abbildung 2, Feld A), aber nicht in der rechteckigen Arena (Abbildung 2, Panel C). Keine der drei männlichen voneinander unterschieden Stämme (2, Platten B und D). Die repräsentativen Daten zeigen , dass sowohl männliche als auch weibliche C58 / J - Mäuse ...

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Diskussion

Hier präsentieren wir eine kürzlich entwickelte Test, der für höhere Ordnung repetitive Verhaltensweisen beim Menschen für die Quantifizierung von Auslösern mit Augenscheinvalidität nützlich sein kann. Im Gegensatz zu etablierten Assays wie die Barnes oder T-Labyrinth, das neue Objekt Exploration Assay benötigt keine Maus Ausbildung noch ist es besonders zu provozieren Angst. Darüber hinaus erfordern neue Objekt Exploration keine Nahrung oder soziale Reize, auf das Verhalten von Interesse, RRBs für mehr Fokus...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Polycarbonate Rodent Cage (45 cm x 24 cm x 20 cm)			Multiple cages are desirable to facilitate testing of multiple mice
Plastic Opaque Circular Testing Arena (41 cm base diameter)	United States Plastic Corp.	13931	Multiple arenas are desirable to facilitate testing of multiple mice
Standard Corn-Cob Rodent Bedding
Novel Object - red monkey	Hasbro, Pawtucket RI		from Barrel of Monkeys
Novel Object - rectangular 2 x 4 LEGO
Novel Object - tile	Thinkfun Inc., Alexandria VA		from Toot and Otto
Novel Object - standard white die
Video Camera
Behavioral Logging Software - The Observer	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
Video Tracking Software - EthoVision	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
X-Keys input keyboard	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown MI