Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie zu Mikro- / Nanopartikel manipulierten Zellen mit einer effizienten Abbau von nicht gebundenen Partikel zu reinigen.

Zusammenfassung

Engineering-Zellen, die mit wirkstoffbeladenen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist ein zunehmend beliebte Methode nativen therapeutischen Eigenschaften zu verbessern, Bio-Bildgebung ermöglichen und Zell-Phänotyp steuern. Eine kritische noch unzureichend angesprochen Problem ist die beträchtliche Anzahl von Teilchen, die nach der Zellmarkierungs ungebunden bleiben, die nicht leicht durch herkömmliche Zentrifugation entfernt werden kann. Dies führt zu einer Erhöhung der bio Abbildungshintergrundrauschen und transformierende Wirkung auf benachbarte Nicht-Zielzellen vermitteln. In diesem Protokoll präsentieren wir ein Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie bezeichnet als Dean Flow Fractionation (DFF), um effizient markierten Zellen von freien Nanopartikeln in einem hohen Durchsatz Weise trennen. Die entwickelte Spiralmikrovorrichtung ermöglicht eine kontinuierliche Sammlung (> 90% Zell recovery) von gereinigten Zellen (THP-1 und MSCs) in neue Pufferlösung suspendiert, während> 95% Abreicherung von ungebundenen Fluoreszenzfarbstoff zu erreichen oder farbstoffbeladenen NPs (silica oder PLGA). Dieses einstufige, größenbasierte Zellreinigungsstrategie ermöglicht hohe Zellverarbeitungsdurchsatz (10 ⁶ Zellen / min) und ist sehr nützlich für die großvolumige Zelle Reinigung von Mikro- / Nanopartikel - Zellen entwickelt , störungsfreie klinische Anwendung zu erzielen.

Einleitung

Zellen , die durch agenten geladen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist eine einfache, genomische Integration frei und vielseitige Methode zur Bioimaging - Fähigkeit zu verbessern und zu erweitern / Ergänzung seiner nativen therapeutischen Eigenschaften in der regenerativen Medizin - Engineering. ^1-3 Cellular Modifikationen erreicht werden durch die Kennzeichnung Plasmamembran oder Zytoplasma mit einem Überschuss Konzentration des Mittels belasteten NPs die Bindungsstellen zu sättigen. Jedoch ist ein Hauptnachteil dieses Verfahrens , die signifikante Mengen an ungebundenen Partikel in Lösung verbleibt nach dem Zellmarkierungsverfahren, die möglicherweise eine genaue Identifizierung von partikel manipulierten Zellen vermengen können oder therapeutische Ergebnisse erschweren. ^4,5 Zusätzlich Exposition gegen NPs enthält transformierende Mittel (Wachstumsfaktoren, Kortikosteroide, etc.) bei zu hoher Konzentration kann Zytotoxizität und misdirected Exposition verursachen unerwünschte Folgen auf nicht-Zielzellen induzieren kann. partikuläre Träger Selbst umfassend of "biokompatibel" Materialien [zB Poly (milch co-Glykolsäure), PLGA] kann auch potente Immunzell - Reaktionen unter bestimmten Bedingungen anstiften. ⁶ Dieses bei Personen mit eingeschränkter Immunität besonders riskant ist (zB rheumatoide Arthritis) , die möglicherweise Verzögerungen systemische Clearance Nanopartikels. ⁷ somit effiziente Entfernung von freien Teilchen vor der Einführung des partikel manipulierten Zellen ist von großer Bedeutung Toxizitätsprofil zu minimieren und misdirected Exposition gegenSubstanz beladenen Partikel in vivo reduzieren.

Herkömmliche Gradientenzentrifugation wird oft zu trennen manipulierten Zellen von freien Teilchen verwendet, ist aber umständlich und im Batch-Modus betrieben werden. Darüber hinaus kann durch Zellen erfahrenen Scherspannungen während des hochtourigen Zentrifugation und die Bestandteile des Dichtegradientenmedium kompromittieren Integrität Zelle und / oder Beeinflussung des Zellverhaltens. ⁸ Microfluidics ist eine attraktive Alternative mit sevrere Trenntechnologien einschließlich deterministische seitliche Verschiebung (DLD) ^9, dieletrophoresis ^10,11 und acoustophoresis ¹² kleine Partikel Trennung und Pufferaustausch - Anwendungen entwickelt wurde. Jedoch leiden diese Methoden von geringem Durchsatz (1-10 & mgr; l · min ^{- 1)} und sind anfällig für Probleme zu verstopfen. Aktive Trennungen wie Dielektrophorese-basierten Verfahren benötigen auch Unterschiede in der intrinsischen dielektrophoretischen Zellphänotypen oder zusätzliche Zellmarkierungsschritte zur Trennung erzielen. Ein vielversprechender Ansatz beinhaltet Trägheits Mikrofluidik - die seitliche Wanderung der Partikel oder Zellen über rationalisiert an bestimmten Positionen durch dominante Auftriebskräfte (F _L) bei hohen Reynolds - Zahl (Re) ¹³ Aufgrund der hohen Strömungsverhältnisse und überlegene Größe Auflösung zu konzentrieren. ist es oft für größenbasierte Zellseparation ^14,15 und Pufferaustausch - Anwendungen genutzt werden . ^16-18 However, Pufferaustauschleistung bleibt mit ~10-30% Verunreinigung Lösung schlecht wie die getrennten Zellen in der Regel zwischen ursprünglichen und neuen Pufferlösungen an die Grenze dicht bleiben. ^16-18 Noch wichtiger ist , hat auf die Größenverteilung von Zielzellen ähnlich sein zu erreichen , präzise Trägheits Fokussierung und Trennung von der ursprünglichen Pufferlösung , die ein Problem insbesondere bei der Verarbeitung von heterogenen großen Zelltypen wie mesenchymalen Stammzellen (MSCs) darstellt. ¹⁹

Wir haben bereits eine neue Trägheits Mikrofluidik Zellsortierung Technik bezeichnet Dean Flow Fractionation (DFF) zur Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) ²⁰ und Bakterien ²¹ aus Vollblut unter Verwendung eines 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanalgerät entwickelt. In diesem Video-Protokoll, werden wir den Prozess der Etikettierung THP-1 (humane akute monozytäre Leukämie-Zelllinie) Suspension monozytären Zellen (~ 15 & mgr; m) und MSCs (10-30 & mgr; m) mit Calcein-l beschreibenoaded NPs, gefolgt von der Herstellung und dem Betrieb der DFF Spiralmikrovorrichtung zur effizienten Rückgewinnung von markierten Zellen und das Entfernen von ungebundenem NPs. ²² Diese einstufigen Reinigungsstrategie ermöglicht eine kontinuierliche Rückgewinnung von markiertem Suspension und haft in frische Pufferlösung ohne Zentrifugation suspendierten Zellen. Darüber hinaus kann es bis zu 10 Millionen Zellen verarbeiten · ml ^-1, eine Zelldichte zugänglich für die regenerative Medizin - Anwendungen.

Protokoll

1. Nanopartikel (NPs) Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen und Monozyten

1. Kultur von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) vor der Markierung mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika zu ≥80% Konfluenz ergänzt. Ähnlich Kultur THP-1 - Zellen (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 - Medium mit 10% FBS auf eine Dichte von ~ 10 ⁶ Zellen / ml ergänzt.
2. Last Silica-Nanopartikel (~ 500 & mgr; m) mit Calceinfarbstoff-Lösung (200 & mgr; M) über Nacht Rühren mit. Fabrizieren PLGA-Calcein AM (CAM) mit einem Protokoll zuvor beschrieben. ²²
   1. Man löst 250 ug CAM und 100 mg PLGA (50:50) in Chloroform bei 4 ° C.
   2. Generieren Sie einzelne NPs Emulsion, die eine High-Speed-Homogenisator (13.600 · g, 60 sec) bei Raumtemperatur. Man dampft das Chloroform in einer chemischen Haube (≥3 hr) vor Sammlung mit Zentrifugation (3.400 × g für 5 min), Waschen (Doppel distiWasser gefüllt), Gefriertrocknung und Lagerung bei -20 ° C.
3. CAM-PLGA NPs (1 mg) oder Calcein Siliciumdioxid NPs (150 ug) in 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) Lösung bei Raumtemperatur inkubieren 15 - 20 min.
4. Zentrifuge bei 3.400 xg für 5 min überschüssige PLL Überstand vor NPs Resuspension in 1 ml der jeweiligen Kulturmedium zu entfernen.
5. Inkubieren der NPs mit Zellen (MSCs oder THP-1, ~ 1 - 2 mal 10 ⁶ Zellen insgesamt) für etwa 24 Stunden (0,1 mg · ml ^-1 Markierungskonzentration).
6. Dissoziieren und Ernte der markierten anhaftende MSCs unter Verwendung von 2 ml von 0,25% Trypsin (5 min, 37 ° C) und Abschrecken mit 6 ml DMEM. Drehen , um die Zellen bei (1000 xg, 4 min) und resuspendieren zu einer Konzentration von 10 ⁵ - 10 ⁶ Zellen / ml für mikrofluidische Verarbeitung. Verwenden Sie markierten THP-1 - Zellen ^{(10. Mai - 10. JUNI} Zellen / ml) direkt für die Mikrofluidik Reinigung.

2. Mikrofluidik-Vorrichtung Vorbereitung

1. Vorrichtung Fabrication
   1. Fabrizieren die mikrofluidische Spiraleinrichtung (500 & mgr; m (w) × 115 & mgr; m (h)) mit Polydimethylsiloxan (PDMS) von einem kommerziellen Kit unter Verwendung von Standard weichen Lithographieschritte. ²³
   2. Mischen Sie 30 g Base Prepolymers und 3 g Mittel gründlich in einem Wägeschiffchen aushärtet. De-Gas das Gemisch in einem Exsikkator für 60 Minuten alle Luftblasen zu entfernen.
   3. Gießen Sie die PDMS-Mischung auf den Siliziumwafer Masterform mit dem spiralförmigen Kanal Design strukturiert sorgfältig zu einer Höhe von ~ von 5 bis 10 mm.
   4. De-Gas das Gemisch in einem Exsikkator Vakuum erneut 60 min alle Luftblasen zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Blasen beseitigt werden.
   5. Härten des PDMS-Mischung in einem Ofen bei 80ºC für 2 Stunden, bis das PDMS eingestellt ist. Sicherstellen, dass der Wafer nicht während der Aushärtung haben eine konstante Bauhöhe gekippt wird.
   6. Schneiden Sie die PDMS-Spirale Gerät mit einem Skalpell und vorsichtig schälen die PDMS-Platte aus der Urform.
   7. Trim, die Kanten der Vorrichtung mit einem Skalpell zum Bonden glatte Oberfläche zu gewährleisten.
   8. Stanzen zwei Löcher (1,5 mm) für die Einlässe und zwei Löcher (1,5 mm) für die Auslässe auf der PDMS-Gerät mit einem 1,5 mm-Biopsie Tanze verwendet wird.
   9. Waschen Sie das Gerät mit Isopropanol (IPA) alle Ablagerungen zu entfernen und das Gerät in einem 80 ° C Ofen für 5 Minuten trocknen lassen.
   10. Reinigen Sie die Bodenfläche der PDMS-Gerät (mit Kanalfunktionen) unter Verwendung von Klebeband.
   11. Sauber einer Seite eines Glasobjektträger (2 "von 3") unter Verwendung von Klebeband.
   12. Vorsichtig legen und die gereinigten Oberflächen der PDMS-Gerät und Glasträger in der Kammer eines Plasmareiniger aussetzen und unterziehen sie für 60 Sekunden Vakuum. Als nächstes schalten Sie die Plasmaleistung auf Maximum und den Kammerdruck zu senken, bis die Kammer rosa Farbe dreht.
       1. Expose die Oberflächen Luftplasma für 60 Sekunden. Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf den freiliegenden Oberflächen der PDMS und Glas, die feste Bindung ermöglicht, wenn sie in Physic gebrachtal Kontakt. Schalten Sie den Plasma-Gerät aus und lassen Sie den Druck aus dem Plasma-Reiniger das Gerät und Glasträger abzurufen.
   13. Bond, die PDMS-Gerät und Glasobjektträger zusammen mit dem Plasma ausgesetzten Oberflächen fest gedrückt und sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen den beiden Oberflächen gefangen sind.
   14. Erhitzen Sie das gebundene Gerät eine Heizplatte eingestellt bei 80 ° C für 2 Stunden mit der Bindung zu stärken.
2. Gerätebetrieb
   1. Geschnitten, um zwei Schlauchstücke (1,52 mm OD) von ca. 15 bis 20 cm für die Einlass- Spritzen und Befestigen einer Spritzenspitze (Gauge 23) an einem Ende jedes Schlauch.
   2. Geschnitten, um zwei Schlauchstücke (1,52 mm OD) von ca. 5 - 10 cm für die Auslässe und heften sich an den Austrittsöffnungen des PDMS-Gerät.
   3. Vor Laufen zu probieren, das Gerät manuell prime mit einer Spritze 70% Ethanol enthält, bis sie aus dem Ablaufschlauch fließt. Ermöglichen das Ethanol sit für 30 sec bis 1 min, das Gerät zu sterilisieren.
   4. Last 30 ml gefilterter(0,2 um Poren) Mantel-Puffer (Phosphat-gepufferte Saline (PBS) mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)) in die 60 ml-Spritze und sichern die Spritze auf Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe auf die richtigen Einstellungen (Spritzengröße: 60 ml, Volumen: 60.000 ul).
      Anmerkung: Die Zugabe von BSA zu PBS ist Zell-Zell-Bindung und unspezifischer zwischen Zellen und der PDMS-Gerät Bindung zu minimieren.
   5. Last 3 ml der markierten Zellen in die 3-ml-Spritze und sichern Sie die Spritze auf einem separaten Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe auf die richtigen Einstellungen (Spritzengröße: 3 ml, Volumen: 3000 ul).
   6. Überprüfen Sie, dass keine Luftblasen in den Spritzen gefangen sind, eine stabile Strömung zu gewährleisten. Entfernen Sie alle Luftblasen durch vorsichtiges paar Tropfen Flüssigkeit Ausstoßen aus der Düse.
   7. Schließen Sie die Einlass Spritze Spitzen und Schläuche an die Spritzen und fügen Sie sie in die jeweiligen Einlässe der Vorrichtung (Hülle und Probeneingang). Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen entlang dem Schlauch sind.
   8. Montieren Sie die Geräte auf einen Inverted Phasenkontrastmikroskop für die Echtzeitbildgebung während der Zellsortierprozess.
   9. Sichern Sie sich einen kleinen Abfallbecher und zwei 15-ml-Röhrchen bei dem Gerät auf dem Mikroskoptisch unter Verwendung von Klebstoffen.
   10. Die Austrittsschläuche in den Abfallbecher.
   11. Stellen Sie den Stromverhältnis für die Probe zu Hülle Puffer bis 1:10 und starten die beiden Spritzenpumpen den Sortierprozess zu initiieren (Beispiel: 120 ml / min für die Probenspritze und 1200 ml / min für die Hülle Spritze; Kanalströmungsgeschwindigkeit ~ 0,38 m / sec ).
   12. Führen Sie das Gerät für 1,5 min für die Strömungsgeschwindigkeit zu stabilisieren. Dies kann durch die Anwesenheit von inertially fokussierten Zellen in der Nähe der Kanalinnenwand unter Hellfeld mit Phasenkontrast mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (-: 10-50 us 10.000 Frames pro Sekunde (fps), Belichtungszeit ~ 5000) bestätigt werden.
   13. Positionieren Sie die Austrittsschläuche in verschiedene Röhrchen, die die Eluenten aus der Zelle Auslass und Abfallausgang zu sammeln.

Ergebnisse

Nach der Markierung NPs die Zellen mit Bio - Bildgebungsmittel beladene über Nacht, die markierten Zellen (die freie Teilchen) werden geerntet und gereinigt durch DFF Spirale Mikroeinrichtung zum freien NPs in einem einstufigen Verfahren (1A) zu entfernen. Der 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanal wird durch Engineering-Software entwickelt und mikro Su-8 verwenden. Die strukturierte Silizium - Wafer wird dann als Vorlage für die PDMS Replik Formen mit weichen Lithograp...

Diskussion

Das DFF Zellreinigung hier beschriebene Technologie ermöglicht eine schnelle und kontinuierliche Trennung der markierten Zellen in einem Hochdurchsatz Weise. Diese Trennung Ansatz ist ideal für große Probenvolumen oder hohe Zellkonzentration Probenverarbeitung und ist besser als herkömmliche Membranbasis Filtration, die zu einer Verstopfung nach längerem Gebrauch anfällig ist. In ähnlicher Weise Affinität basierende magnetische Trennung erfordert eine zusätzliche Markierung von Zellen Schritte, die aufwendig un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Lonza	PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
3 ml Syringe	BD	302113	Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe	BD	309653	Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calcein, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Plain Microscope Slides	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
Scotch tape	3M	21200702044	18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm)	Sigma-Aldrich	748161	Pore size 4 nm
Syringe Tip	JEC Technology	7018302	23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Biopsy punch	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessicator	Scienceware	111/4 IN OD
High-speed Camera	Phantom	V9.1
Inverted phase-contrast microscope	Nikon	Eclipse Ti
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Syringe Pump	Chemyx	CX Fusion 200