Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Zusammenfassung

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Zusammenfassung

Der adoptive Transfer von ex vivo expandierte autologe Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) können dauerhafte und vollständige Antworten in signifikanten Untergruppen von Patienten mit metastasierendem Melanom vermitteln. Haupthindernisse dieses Ansatzes sind die reduzierte Lebensfähigkeit der übertragenen T-Zellen, durch Verkürzung der Telomere verursacht wird, und die begrenzte Anzahl von TILs von Patienten erhalten. Weniger differenzierte T-Zellen mit langen Telomeren wäre eine ideale T-Zell-Untergruppe für Adoptiv T-Zell-Therapie sein, aber die Erzeugung einer großen Anzahl von diesen weniger differenzierten T-Zellen problematisch ist. Diese Beschränkung der adoptiven T-Zelltherapie kann theoretisch durch Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), die selbst zu erneuern, halten Pluripotenz, haben verlängert die Telomere, und bieten eine unbegrenzte Quelle autologer T-Zellen für die Immuntherapie überwunden werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll iPSCs zu erzeugen unter Verwendung von Sendai-Virus-Vektoren für die Transduktion von Reprogrammierungsfaktoren in TIL. Dieses Protokoll generierens vollständig neu programmiert, vektorfreie Klone. Diese TIL stamm iPSCs könnte in der Lage sein, zu erzeugen weniger differenzierten Patienten- und tumorspezifische T-Zellen für die adoptive T-Zell-Therapie.

Einleitung

Reprogrammierung Technologie , die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS - Zellen) über die Überexpression eines definierten Satz von Transkriptionsfaktoren erlaubt ist sehr vielversprechend im Bereich der zellbasierten Therapien ^1,2. Diese iPS - Zellen zeigen Transkriptions und epigenetische Merkmale und haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Pluripotenz, ähnlich wie embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) ^3-5. Bemerkenswerte Fortschritte bei der Reprogrammierung Technologie im letzten Jahrzehnt gemacht hat uns menschliche iPS - Zellen auch aus ausdifferenzierten Zellen, wie T - Zellen ^6-8 zu erzeugen , erlaubt. T - Zellen abgeleiteten iPSCs (TiPSCs) die gleiche Konfiguration neu angeordnet T - Zell - Rezeptor (TCR) Kettengene wie die ursprünglichen T - Zellen behalten, die Regeneration von antigen-spezifischen T - Zellen aus TiPSCs ^9-11 ermöglicht.

Fast 80% der Melanom-infiltrierenden Lymphozyten (TILs), erhalten von einem Patienten Tumor speziell tumorassoziierten Antigenen erkennen and halten Zytotoxizität gegen den ursprünglichen Krebszellen ^12. Bemerkenswerterweise wurde die Expression des programmierten Zelltods protein-1 (PD-1) auf TILs fand die autologe Tumor-reaktiven Repertoire, einschließlich mutierter Neoantigen-spezifischen CD8 ⁺ Lymphozyten identifiziert ^13. Der adoptive Transfer von Ex-vivo expandierte autologe TIL in Kombination mit präparativen lymphodepleting Regimen und systemische Verabreichung von Interleukin-2 (IL-2) kann in Untergruppen von Patienten ¹⁴ erhebliche Regression von metastatischem Melanom verursachen. Trotz Ergebnisse in präklinischen Modellen zu fördern und bei Patienten, schlechte Überleben infundiert T-Zellen und die Existenz von immunsuppressiven Wege erscheinen, das volle Potenzial von Adoptiv T-Zell-Therapie nicht zu gefährden. Aktuelle klinische Protokolle erfordern umfangreiche ex vivo Manipulation von autologe T - Zellen, um eine große Zahl zu erhalten. Dies resultiert in der Erzeugung von terminal differenzierten T-Zellen, die eine schlechte Überleben haben, reduziert proliferative Kapazität und ein hohes Maß an PD-1 ^15.

Diese Beschränkung der adoptiven T-Zelltherapie kann theoretisch durch Verwendung von iPS-Zellen überwunden werden, die eine unbegrenzte Quelle autologer T-Zellen für die Immuntherapie zur Verfügung stellen kann. Wir haben vor kurzem berichtet , die Umprogrammierung von Melanomen TIL, die hohe Niveaus von PD-1 von Sendai - Virus (SeV) vermittelter Transduktion der vier Transkriptionsfaktoren, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC ^16. Während Retrovirusvektoren Integration in Wirtschromosomen erfordern Umprogrammierung Gene, SeV Vektoren sind zum Ausdruck bringen nicht-integrierenden und werden schließlich aus dem Zytoplasma eliminiert. Umprogrammieren Effizienz ist viel höher mit einem SeV - System im Vergleich mit Lentiviren oder Retrovirusvektoren ^6-8. Weiterhin kann SeV spezifisch T - Zellen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) umprogrammieren, während einige iPSC Klone durch Lentivirus oder Retrovirus - Vektoren erzeugt aus nichtlymphoiden Linien ^6-8 sein kann. Hier stellen wir Detaildie Verfahren zur Isolierung und Aktivierung von menschlichen Melanom TILs und zur Erzeugung von TIL stamm iPSCs unter Verwendung eines SeV Umprogrammierung System implementiert.

Protokoll

HINWEIS: Die Patienten sollten informierte Zustimmung geben in den pluripotenten Institutional Review Board und Menschliche Zelle Ausschuss Stem Studie genehmigt teilzunehmen.

1. Isolierung und Kultur von TIL

1. Erhalten Tumormaterial, das für die histopathologische Diagnose aus der Pathologie Service / Gewebebeschaffung Kern nicht erforderlich ist. Platzieren 20-100 g Tumorproben in einer 50-ml - Röhrchen mit 30 ml Tumorsammelmedium (Tabelle 1).
2. Präparieren Sie fest, fest, normales Gewebe der Tumorprobe von zerbrechlichen und / oder blutiger Nekrosen mit einer Schere. Nach dem nekrotischen Gewebes zu entfernen, verwenden Sie die Schere, um die Probe so klein wie möglich zu Hackfleisch.
3. Dissoziieren Das zerkleinerte Probe in eine Einzelzellsuspension ein Dissociator und Tumor Dissoziation Kit (human) nach den Anweisungen des Herstellers. Filtern Sie die Suspension mit einer 70 & mgr; m Zellsieb, die auf einem 50-ml-Röhrchen gesetzt und waschen Sie das Sieb 2 mal mit2 ml RPMI 1640.
4. Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml T - Zell - Medium (Tabelle 1).
5. Vorbereiten eines zweistufigen Gradienten Lösung wie Ficoll (Gradient Lösung) in einem 50-ml-Röhrchen, mit einer unteren Stufe von 10 ml 100% -Gradienten-Lösung und einer mittleren Stufe aus 30 ml 75% Gradienten-Lösung mit Dulbeccos phosphatgepufferter verdünnt gepufferte Salzlösung, kein Kalzium, kein Magnesium (D-PBS (-)).
6. Schicht, die die Zellsuspension (aus Schritt 1.4) auf dem Gradienten-Lösung (aus Schritt 1.5). Zentrifuge bei 400 × g bei 20 ° C für 45 min.
7. Sammeln Sie die Schicht der angereicherten TILs an der Grenzfläche zwischen dem 100% Gradienten-Lösung und 75% Gradienten-Lösung in einem 50 ml Röhrchen mit. Verdünne die Schicht der Lösung mit den angereicherten TILs durch Zugabe von 20-30 ml D-PBS (-).
8. Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Überstand verwerfen und resuspendieren TIL angereicherte Fraktion in 10 mlder T-Zellmedium.
9. Kultur die Fraktion (aus Schritt 1.8) mit 2 ml der T - Zellmedien und 6000 IU / ml rekombinantes menschliches (rh) IL-2 in einer 6-Well - Platte bei 37 ° C, 5% CO _2.
10. Ändern Sie die Hälfte der Medien am Tag 5 nach Kulturbeginn und alle 2-3 Tage danach.
11. Aufgeteilt, die Zellen in einem Verhältnis von 1: 2 ohne Trypsinisierung nach sanft Suspendieren Verdoppelung der Anzahl der Vertiefungen, wenn 80-90% Konfluenz erreichen. Fügen Sie eine halbe Volumen (1 ml) von frischen T-Zell-Medien und rhIL-2 bei 6.000 IU / ml.

2. Herstellung von Mitomycin-C-behandelten SNL Feeder Zellen-Platte

1. Kultur SNL feeder - Zellen in 10 ml von SNL feeder Zellmedien (Tabelle 1) auf einem 0,1% Gelatine beschichteten 10 - cm - Schale , bis 80-90% Konfluenz (3-4 x 10 ⁶ Zellen) erreicht ist .
2. In 310 ul von 0,4 mg / ml Mitomycin C - Lösung direkt in die SNL Feeder - Zellkulturschale und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 2 Stunden und 15 Minuten. Saugen Sie das Medium einnd die Zellen werden zweimal mit 5 ml D-PBS (-).
3. 0,5 ml von 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur, um die Zellen dissoziiert. In 4,5 ml SNL Feeder-Zellmedien zu neutralisieren und resuspendieren die Zellen in einer einzigen Suspension.
4. Übertragen Sie die Zellen in eine 15-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 200 g für 5 min. Aspirieren die Medien und Zählen der Zellen mit einem Hämozytometer nach Resuspendieren in 10 ml SNL Feeder-Zellmedien.
5. Platte 1,5 x 10 ⁶ Zellen pro Vertiefung der SNL - Feeder - Zellen auf einer 10 cm Schüssel und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO _2. Verwenden Sie die SNL-Feeder-Zellen innerhalb von 3 Tagen.

3. Erzeugung von iPS-Zellen Verwendung des Sendai-Virus (SeV) Vector

1. Ernten Sie die TIL (aus Schritt 1.11) und aktivieren 5 x 10 ⁵ Zellen von TIL mit plattengebundenen Maus anti-human CD3 (1 ug / ml) und löslichen Maus - Anti-Human - CD28 (5 ug / ml), mit rhIL-2 (6000 IU / ml) in 2 ml T-Zell-Medium in einer Platte mit 6 Vertiefungen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 5 Tage.
2. Ernten Sie die TIL (aus Schritt 3.1) in einem 15-ml-Röhrchen mit einer Pipette und die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen.
3. Reaktivieren 1 x 10 ⁵ Zellen von TILs mit Platte-gebundenen Maus - anti-human CD3 (1 & mgr; g / ml) und löslichem Maus anti-human CD28 (5 & mgr; g / ml), mit rhIL-2 (60 IU / ml) in 500 ul der Reprogrammierung Medien (Tabelle 1) pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 24 Std. Bereiten Sie 3 Brunnen für SeV Infektion: OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC (1 gut); SeV-Infektion (GFP: grün fluoreszierendes Protein) (1 gut); und Zellzahl (1 gut).
4. Nach 24 Stunden (aus Schritt 3.3), die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen und das Volumen jedes Virus für verschiedene (3-20) Multiplizitäten der Infektion (MOI) bestimmen. Entfernen Sie eine Reihe von Vektor-Rohre Sendai-Virus von -80 ° C-Lagerung. Auftauen SeV Vektoren schnell in einem Wasserbad (37 ° C) und legen Sie sie auf Eis.
   Volumen-Virus (ul)= MOI (CIU / Zelle) x Anzahl der Zellen / Titer des Virus (CIU / ml) × 10-3 (ul / ml)
5. Die berechnete Volumina jeder der vier Sendai-Virus-Vektor Rohre, die einzeln durch OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC, indem eine Mischung von SeV Vektoren bei 10-20 MOI in die Medien Zugabe einschließlich aktivierten TILs.
6. Um die Transduktionseffizienz zu bestimmen müssen die berechneten Volumina von SeV-GFP in eine Vertiefung aktiviert TIL.
7. Die Schale (aus Schritt 3.5 und Schritt 3.6) im Inkubator bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 24 Stunden. Nach 24 Stunden Schätzung mit TIL infiziert mit SeV-GFP unter Fluoreszenzmikroskopie die Infektionseffizienz.
8. Sammeln Sie die Zellen (aus Schritt 3.5) in einem 15-ml-Tube. Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 min.
9. Überstand verwerfen und das Pellet in 0,5 ml hESC Medien mit Primas ES Zellmedium und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng / ml).
10. Übertragen Sie die Suspension in eine 10 cm-Schale, die ContaIns SNL feeder-Zellen in 10 ml HES Medien Mitomycin-C-behandelten. Ändern Sie die hESC Medien jeden zweiten Tag, bis die Kolonien angebaut werden.
11. Um Tag 18 bis 21, entfernen Sie die Feeder-Zellen SNL um die Kolonien unter dem Mikroskop eine 10-ul Spitze in der Sterilbank verwenden.
12. Schaben die Kolonien eine 10-ul Spitze mit und übertragen sie mit Hilfe eines 200-ul Spitze in 100 ul iPSCs Medien pro Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Pipettieren nach oben und unten auf 2-3 mal mit einer durchschnittlichen Größe von 50 bis 100 & mgr; m, die Kolonien in kleine Klumpen zu brechen.
13. Übertragen, um die kleinen Klumpen in 6-Well-Gewebekulturplatten mit Mitomycin-C-behandelten SNL feeder-Zellen (aus Schritt 2) in 2 ml pro Vertiefung iPSCs Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng / ml). Ändern Sie jeden Tag iPSCs Medien.
14. Übertragen Sie die iPS-Zellen zu 6-Well-Gewebekulturplatten mit frischem Mitomycin-C-behandelten SNL-Feeder-Zellen mit 1 mg / ml Kollagenase IV alle 5-6 Tage. Bereiten Sie zwei Vertiefungen pro Platten jeder Klon für Immunostaining.
15. Bestimmen Sie die vollständige Neuprogrammierung jedes Klons durch immunhistochemische Färbung von Pluripotenz Marker (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 und OCT3 / 4) ^1.
    HINWEIS: Für die weitere Auswertung der Pluripotenz Potenzial, bestätigen , dass komplett neu programmiert iPSC Linien in drei Keimblätter durch eine Embryoidkörperbildung Bildung ¹⁶ und Differenzierungstest oder ein Teratom Bildungstest unterscheiden kann.
16. Bestätigen Sie, dass komplett neu programmiert iPSC Linien einen normalen Karyotyp durch zytogenetische Analyse zeigen.
17. Für Teratom Bildung eine undifferenzierte TIL stamm iPSC (1 x 10 ⁶⁾ Suspension in 100 ul DMEM , enthaltend 10% FCS in das subkutane Gewebe von 6-8 Wochen alten weiblichen NOD / SCID - Mäuse injiziert. Stain teratoma Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin.

4. Immunfluoreszenzanfärbung von iPS-Zellen für SSEA3, SSEA4, TRA1-60 und TRA1-81

1. Wash iPSCs mit 1 ml PBS und fixieren die iPS-Zellen mit 1 ml von 4% paraformaldehyde Lösung für 10 min. Entfernen Sie die 4% Paraformaldehydlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml 3 mal PBS.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Paraformaldehyd zu verwenden, da es giftig ist.
2. Vorzubehandeln die iPSCs mit Blocking - Puffer (Tabelle 1) für 30 min. Inzwischen verdünnen die primären Antikörper (Ratte anti-human SSEA3, Maus anti-human SSEA4, Maus anti-human TRA1-60 und Maus anti-human TRA1-81) 01.50 in 1,5% Ziegenserum-Lösung verdünnt mit PBS und Triton X -100 (Gesamtvolumen: 1 ml).
3. Entfernen des Blockierungspuffers (Tabelle 1). Fügen Sie den verdünnten primären Antikörperlösung und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Inzwischen verdünnen dem sekundären Antikörper (anti-Maus IgG und IgM oder anti-Ratte-IgM) 01.50 in 1,5% Ziegenserum-Lösung.
4. Entfernen Sie die verdünnten primären Antikörperlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. In der verdünnten sekundären Antikörper-Lösung und Inkubation für 45 Minuten bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum.
5. Entfernen Sie die verdünnten sekundären Antikörper-Lösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. Beachten Sie die iPS-Zellen mit Immunfluoreszenzmikroskopie.

5. Immunfluoreszenzanfärbung von iPS-Zellen für Oct3 / 4

1. Wash iPSCs mit 1 ml PBS und fixieren die iPS-Zellen mit 1 ml 4% Paraformaldehydlösung für 10 min. Entfernen Sie die 4% Paraformaldehydlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit PBS 3 mal.
2. Hinzufügen Permeabilisierung Puffer (Tabelle 1) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Permeabilisierung Puffer und fügen Blocking - Puffer (Tabelle 1).
3. für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Inzwischen verdünnen den primären Antikörper (Maus anti-human Oct3 / 4) 01.50 in Blocking-Puffer.
4. Fügen Sie den verdünnten primären Antikörperlösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
5. Entfernen Sie die verdünnten primären Antikörperlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. Inzwischen diLaute der sekundäre Antikörper (Ziege-anti-Maus-IgG / IgM) 1: 100 in Blockierungspuffer.
6. In der verdünnten sekundären Antikörper-Lösung und Inkubation bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum für 45 min.
7. Entfernen Sie die verdünnten sekundären Lösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. Beachten Sie die iPS-Zellen unter Immunfluoreszenzmikroskopie.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Übersicht über das Verfahren , das die anfängliche Expansion des Melanoms TILs mit rhIL-2, die durch Aktivierung mit anti-CD3 / CD28 und Gentransfer OCT3 / 4, KLF4, SOX2, und c-MYC zu TILs folgt beinhaltet zur Erzeugung von iPSCs. Normalerweise TIL auf Kultur mit rhIL-2 Start zu bilden Kugeln 21-28 Tage nach Beginn der Kultur. An diesem Punkt TIL bereit sind , mit anti-CD3 aktiviert werden / CD28. 2A zeigt TIL, auf Kultur mit rhI...

Diskussion

Hier haben wir gezeigt, ein Protokoll für die Umprogrammierung Melanom TIL zu iPS-Zellen von SeV-vermittelte Transduktion der vier Transkriptionsfaktoren OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC. Dieser Ansatz, der eine SeV - System unter Verwendung von T - Zellen umprogrammieren, bietet den Vorteil einer nicht-integrierenden Verfahren ^7.

Eine frühere Studie zeigte , dass ein SeV Umprogrammierung System war sehr effizient und zuverlässig nicht nur Fibroblasten neu zu programmieren , sond...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentle MACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentle MACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929
RPMI 1640	Life technologies	11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer	BD	352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes	BD	352070
IMDM	Life technologies	12440053
human AB serum	Life technologies	34005100
L-glutamine (200mM)	Life technologies	25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)	Life technologies	21985-023
Penicillin-Streptomycin	Life technologies	15140-122
gentamicin	Life technologies	15750-060
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-02
D-PBS (-)	Life technologies	14040-133
recombinant human (rh) IL-2	Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
FBS	Gibco	26140-079
HEPES	Life technologies	15630-080
N-Acetylcysteine	Cumberland Pharmaceuticals Inc.	NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well)	Corning	353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well)	Corning	353047
Sendai virus vector	DNAVEC
SNL feeder cells	Cell Biolabs, Inc	CBA-316
mitomycin C	SIGMA	M4287	soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin	SIGMA	G1890
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life technologies	PHG0264