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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Zusammenfassung

Die Inzidenz von entzündlicher Darmerkrankung, dh, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, hat in den letzten zehn Jahren erheblich zugenommen. Die Ätiologie von IBD unbekannt bleibt und aktuelle Therapiestrategien sind auf der unspezifischen Unterdrückung des Immunsystems beruhen. Die Entwicklung von Behandlungen, die speziell Darmentzündung und epitheliale Wundheilung Ziel deutlich Management von CED verbessern könnte, dies erfordert jedoch eine genaue Erfassung von entzündlichen Veränderungen. Derzeit werden Wirkstoffkandidaten in der Regel unter Verwendung von Tiermodellen in vivo ausgewertet oder mit Zellkultur - Techniken in vitro. Die histologische Untersuchung erfordert in der Regel die Zellen oder Gewebe von Interesse gefärbt werden, was die Probeneigenschaften verändern können und darüber hinaus die Interpretation der Ergebnisse kann durch Ermittler Expertise variieren. Digitale holografische Mikroskopie (DHM), basierend auf der Erfassung der optischen Weglänge Verzögerung ermöglichtfleckenfreie quantitative Phasenkontrast-Bildgebung. Dadurch können die Ergebnisse direkt mit absolute biophysikalischen Parametern korreliert. Wir zeigen, wie Messung von Veränderungen in der Gewebedichte mit DHM, bezogen auf Brechungsindex-Messung kann entzündlichen Veränderungen zu quantifizieren, ohne Färbung, in verschiedenen Schichten von Kolon-Gewebeproben von Mäusen und Menschen mit Colitis. Darüber hinaus zeigen wir eine kontinuierliche multimodalen markierungsfreie Überwachung von epithelialen Wundheilung in vitro möglich DHM durch die einfache automatische Bestimmung des verwundeten Bereich und gleichzeitige Bestimmung der morphologischen Parameter wie Trockenmasse und Schichtdicke von wandernden Zellen verwendet wird . Abschließend stellt DHM einen wertvollen, neuen und quantitative Werkzeug für die Beurteilung der Darmentzündung mit absoluten Werten für Parameter möglich, vereinfachte Quantifizierung von epithelialen Wundheilung in vitro und damit hohe Potential für eine Translationsdiagnose u hatse.

Einleitung

Entzündlicher Darmerkrankung (IBD), dh, ulzerative Kolitis (UC) und Morbus Crohn (CD) sind idiopathische entzündliche Erkrankungen des Magen - Darm - Trakt 1. Forschung in die darunter liegende Pathophysiologie von IBD und der Bewertung potentieller neuer Medikamente oder neuartige diagnostische Ansätze ist besonders von Bedeutung. Sowohl in der Grundlagenforschung und der klinischen Behandlung von IBD - Patienten hat sich die Darmschleimhaut ein Fokus der Aufmerksamkeit 2,3 geworden. Die Schleimhaut stellt eine anatomische Grenze, an der die Wechselwirkung zwischen kommensalen Bakterien, Epithelzellen und verschiedenen zellulären Komponenten des intestinalen Immunsystems gut orchestriert Homöostase 4,5. Jedoch bei CED - Patienten, unkontrollierte und persistent Darmentzündung führt Schäden, nachweisbar als Ulzerationen oder Stenose der Schleimhaut, die schließlich in Abbau der epithelialen Barrierefunktion gipfeln kann, die sich eine lokale Entzündung 6 verschlimmert.

Epithelial Wundheilung zur Epithelregeneration folgende Entzündung daher von entscheidender Bedeutung ist , sondern auch eine zentrale Anforderung für die Heilung von Magen - Darm - Geschwüren oder Anastomoseninsuffizienz nach Magen - Darm - Chirurgie 7. Epithelialen Wundheilung kann in in vitro Wund simuliert werden Heilungs Assays und in murinen Modellen von Darmentzündung 8,9. In vitro und in vivo Ansätze haben Nachteile, die die Genauigkeit der experimentellen Beurteilung begrenzen. In - vitro - Assays, wie klassische Kratzassays erfordern langwierige Färbeverfahren oder Transfektion mit fluoreszierenden Chromophore. Sie werden häufig durch ihre diskontinuierlichen Überwachung der Zellproliferation und -migration beschränkt , die nicht mehr als 10 automatisiert werden kann. In - vivo - Modellen, wie Dextran Natriumsulfat (DSS) -induzierten Kolitis, fehlt häufig robust Auslesungen aufgrund der signifikanten Unterschiede in Teil gesehen in Labor-Marker, maKönig solche Marker ungeeignet ulcerosa Schwere 11,12 zu bewerten. Die histologische Analyse der entzündeten Schleimhaut ist derzeit noch die gültigste Ansatz ulcerosa Schwere zu bestimmen , sondern diese, wie in vitro epithelialen Wundheilungs Assays erfordert Färbung und ist abhängig von Prüfer Expertise 13.

Kürzlich digitale holografische Mikroskopie (DHM), eine Variante des quantitativen Phasenmikroskopie 14 als nützliches Werkzeug für die Bewertung der epithelialen Wundheilung in vitro und in vivo 15 identifiziert wurde. DHM ermöglicht Beurteilung der Gewebedichte durch optische Weglänge Verzögerungsmessung (OPD) , die Aussichten neuer Krebsdiagnose 16-18 und Quantifizierung von Entzündungen im Zusammenhang mit Veränderungen des Gewebes 19. Darüber hinaus ermöglicht DHM Überwachung der Dynamik der Zellmorphologie durch die Bestimmung der Zelldicke, Zell bedeckt Oberfläche und intrazellulären (Protein) Inhalt Menge 15,20. In in vitro - Assays, DHM ermöglicht auch die Analyse von physiologischen Prozessen, beispielsweise zellulare Wasserpermeabilität durch Veränderungen in Zellvolumen und Dicke 21,22 auswertet. Darüber hinaus können DHM Messungen automatisiert werden, die Bias-Ermittler-assoziierte Probe verhindert.

Hier zeigen wir die Verwendung von DHM in einem murinen Modell der Darmentzündung und auch DHM gelten für Analyse von menschlichen Geweben Proben für die quantitative Überwachung der Wundheilung als markierungsfreien in vitro - Assay. Zunächst bewerten wir entzündliche Veränderungen verschiedener Kolonwand-Schichten in colitic Mäusen und Gewebeschnitten von Menschen mit IBD. Nach der Beschreibung des DHM quantitative Phasenbildgebungsverfahren, bieten wir detaillierte Anweisungen für die Mikroskopkomponenten verwenden, die Herstellung von Gewebeschnitten und auch die Auswertung der gewonnenen quantitativen Phasenbilder beschreiben.

Als nächstes zeigen wir, dass DHM UTI sein kannlized für die kontinuierliche Überwachung multimodaler von epithelialen Wundheilung in vitro und beschreiben die Analyse von zellulären Eigenschaften wie Zellschichtdicke, Trockenmasse und Zellvolumen geben Einblick in die Droge induziert und physiologische Zellveränderungen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der regionalen Ethikkommission (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Deutschland) nach deutschem Tierschutzgesetz genehmigt. Die Ethikkommission der Universität Münster genehmigt die Verwendung von menschlichen Geweben für histologische und Mikroskop-Analyse.

1. Tiere und Materialien

  1. Verwenden weibliche oder männliche Mäuse des erforderlichen DSS-empfindlichen Stamm, der 20 bis 25 g wiegen, und Haus nach den örtlichen Tierpflegegesetzgebung. Bieten Sie spezielle Futter für Nager und autoklaviert Wasser ad libitum trinken.
  2. Akute Kolitis induzieren DSS durch die Verabreichung von 3% w / v Dextransulfat - Natrium (DSS, Molekulargewicht: 36,000-50,000 Da) in autoklavierten Leitungswasser für 5 Tage.
    HINWEIS: Die Wirksamkeit von DSS ist sehr variabel je nach Hersteller und Charge. Testen Sie Ihre Lieferanten bereitgestellten DSS zunächst für die Induktion der Aktivität der Erkrankung, für die daily Körpergewicht ist ein zuverlässiger und objektiver Indikator.
  3. Für die histologische Beurteilung von Kolon Gewebeproben, einschläfern Mäuse durch CO 2 Insufflation (oder wie von nationalen und institutionellen Richtlinien festgelegt) am Ende des Experiments.

2. Versuchsaufbau für DSS-Kolitis und In-vitro - Assays Wundheilung

  1. Zellkultur und Etablierung der Wundheilung Assays.
    1. Wachsen Caco-2 - Zellen in einem 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 -Umgebung bei 37 ° C. Verwenden RPMI-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin.
    2. Seed Caco-2 - Zellen in einer Dichte von 4 x 10 5 Zellen / cm 2 auf 35 mm Petrischalen mit hoher Kultureinsatz (siehe 4A).
      HINWEIS: Der Einsatz erzeugt zwei Zelle abgedeckten Bereiche, die den verwundeten Bereich freien Raum mit einer definierten Zelle getrennt repräsentieren analysiert werden.
    3. Ändern Medium zwei Tage nach seedinG. Führen durch erste Restmedium mit Zelltrümmer Ansaugen durch einen automatischen Pipette gründlich mit 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und fügen Sie frisches RPMI-Medium oder Serum-beraubt Medium.
    4. Kulturzellen für 24 h in serum entzogen Medium (0,1% FBS) ergänzt mit 20 ng EGF / ml Serum oder 2 ug Mitomycin c / ml Serum Veränderungen in Heilungsverhalten Wunde zu erkennen. Hinzufügen normalen RPMI Medium zu steuern Zellen für 24 Std.
    5. Nach 24 Stunden der Kultur, zu entfernen und Kultureinsätze zu verwerfen, wie in Schritt 3.4 und führen DHM beschrieben.
  2. Induktion von akuter DSS Kolitis
    1. Man löst 3 g DSS in 100 ml Wasser autoklaviert 3% zu erhalten (w / v) DSS-Lösung. Geben Sie diese Lösung anstelle von Wasser an Mäuse ad libitum für 7 Tage zu trinken. Berechnen 5 ml DSS-Lösung pro Maus / Tag. Geben Sie autoklavierten Wasser ohne DSS für Kontrollmäuse ad libitum.
  3. Herstellung von kryostatischen Abschnitte murinen und humanen Kolon
    1. Euthanize Mäuse durch CO 2 Insufflation am Ende des Experiments.
    2. Präparieren Sie den Bauch der Tiere durch Laparotomie 23. Entfernen Sie die gesamte Kolon vorsichtig mit einer Pinzette und schneiden Sie das Ileum und rektale Ende chirurgische Schere. Schneiden Sie den Doppelpunkt mit einer Schere in Längsrichtung vom Blinddarm zum rektalen Ende und öffnen Sie den Dickdarm. Entfernen Sie alle Kot von der Probe durch Waschen mit PBS 24 gefolgt mit einer Pinzette.
    3. Bereiten Sie Rouladen durch Walzen des gesamten Dickdarms mit einem Baumwoll oben in Längsrichtung von der Blinddarm zur rektalen Ende mit der Schleimhaut nach innen gebogen Knospe. Kolon-Proben in optimalen Schnitttemperatur (OAT) Verbindung Einbetten und halten bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
    4. menschlichen Dickdarmgewebe aus chirurgischen Probe in eine optimale Schnitttemperatur OCT-Verbindung Einbetten und halten bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
    5. Cut Abschnitte von 7 um Dicke des OCT-Verbindung eingebettete Proben mit Hilfe eines cryotomich kurz vor der Prüfung.
      HINWEIS: Die optimale Probendicke hängt von der Ausdauer und die Streueigenschaften des Gewebetyp untersucht. Für die beschriebenen Experimente Colongewebe mit, Schichtdicke> 10 um verursachen erhebliche Zunahme des Lärms durch Lichtstreuung in quantitativer DHM Phasenkontrastaufnahmen, während die Proben mit einer Dicke von <5 & mgr; m zeigen ein höheres Risiko für Schäden verursachte Artefakte aus dem Kryo Schneidprozess.
    6. Transferabschnitte auf einem Glasobjektträger-Schlitten.

3. Technische Ausrüstung, Software und Verfahren zur Erfassung und Auswertung der digitalen Hologramme

  1. Digitalen holografischen Mikroskops für quantitative Zell- und Gewebebildgebungs
    1. Verwenden Sie ein Off-Axis - Mach-Zehnder digitalen holografischen Mikroskopiesystem für Live - Cell - Imaging 25, wie in Abbildung 1 dargestellt. Stellen Sie sicher , dass das Mikroskop mit einem ausgestattet ist10X Mikroskopobjektiv, einem Mikroskoptisch mit einer Halterung für die Glasobjektträger gleitet und Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm, eine Heizkammer für quantitative Phasenabbildungs ​​25 physiologischer Temperatur bei 37 ° C und Software zu erhalten.
      HINWEIS: Zum Beispiel, wie in Kemper et al 26 und Langehanenberg et al 27...
      HINWEIS: Alternativ können Sie ein ähnliches System verwenden , die von der Durchführung Hellfeldmikroskopie und quantitative Phasen Abbildung von lebenden Zellen und seziert Gewebe gleitet fähig ist.
    2. Saubere Mikroskopobjektiv und Kühler mit Linsenreinigungspapier und Reinigungsmittel (zB Ethanol) , wie vom Hersteller des Mikroskops empfohlen Staub oder andere Verunreinigungen zu entfernen.
    3. Starten Sie die Bildaufnahme-Software des DHM Mikroskop, wählen Sie "Hellfeld" Abbildungsmodus und Schalter "auf" Weißlichtbeleuchtung. Stellen Sie sicher, Köhler-Buchmalation der Probe durch das Mikroskophersteller empfohlenen wie während die Probe in dem Live-Abbildungsfenster der Bildaufnahme-Software Beobachten (alternativ ein Standardbild-Erfassungssoftware in diesem Schritt verwendet werden kann).
      HINWEIS: Die Bildintensität im Sichtfeld und die Probenposition sollte nicht während der optischen Neuausrichtung mit dem Fokus Antrieb des Mikroskops werden sollte homogen verteilt bewegen.
    4. Wählen Sie "DHM" Imaging-Modus schalten "off" Weißlicht-Beleuchtung und Schalter "auf" das Laserlicht. Prüfen, ob die Beleuchtung mit Laserlicht homogen ist (dh , dass die Lichtintensität wird in dem Live - Abbildungsfenster des Abbildungserfassungssoftware des DHM Mikroskop homogen verteilt) und zu beobachten , dass die off-axis Trägerinterferenzstreifenmuster erscheint mit ausreichendem Kontrast in der aufgenommenen Bilder (digital Hologramme).
  2. Herstellung von Gefrierschnitten für die Bildgebungmit DHM
    1. Nehmen Sie die Probe (Kryostatschnitt auf einem Glasobjektträger, Stärke: 7 um, wie in 2.3 beschrieben) aus dem Gefrierfach. Tauen Sie die Probe für etwa 5 Minuten bei RT und Normalatmosphäre.
    2. Hinzufügen von 50 bis 100 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) als Medium, auf dem Gewebeschnitt Einbettung unter Verwendung einer Pipette, bis es vollständig mit Puffer bedeckt ist. Decken Sie die Probe mit einem sauberen Deckglas (Glasdicke 170 & mgr; m).
      HINWEIS: Übertrocknung können wesentliche Veränderungen des Brechungsindex und Streueigenschaften der Probe zu induzieren.
    3. Stellen Sie sicher, dass der Boden des Glasträger und Deckglas sind von Staub und anderen Verunreinigungen, die Lichtstreuung hervorrufen kann. Die Probe ist bereit für die Untersuchung mit Hellfeldmikroskopie und DHM.
  3. Quantitative Phase Abbildung von Gewebeschnitten mit DHM
    1. Schalten Sie das digitale holografische Mikroskop, wählen Sie die 10X Mikroskop-Objektiv für die Bildgebung. Starten Sie das image Erfassungs-Software des Mikroskops DHM und helle Datei-Bildgebungsmodus wählen.
    2. Legen Sie das Gewebe Träger nach 2) in dem Objektträger Halter beschrieben, mit dem Deckglas des Mikroskop-Objektivs gegenüber.
    3. Switch "auf" der Hellfeldbeleuchtung des DHM Mikroskop. Positionieren Sie die Probe mit dem Mikroskoptisch und sicherzustellen, dass die Gewebebereich von Interesse in der Live-Monitoring-Fenster sichtbar ist. Verbessern Sie die Schärfe des Bildes mit der Fokustrieb des Mikroskops.
      HINWEIS: Neben der Bereich von Interesse ein Bereich des Schiebers ohne Gewebe sollte ebenfalls in dem Sichtfeld vorhanden sein.
    4. Nehmen Sie ein Hellfeldbild der scharf fokussiert Probe mit der Bildaufnahme-Software.
    5. Wählen Sie "DHM" Imaging-Modus schalten "off" der Weißlicht-Beleuchtung und schalten "auf" der Laserlicht-Beleuchtung. Wählen Sie die "Belichtungszeit" zur Hologrammaufzeichnung unter 3 ms, verweisen darauf, dass hologrAFIK off-axis Interferenzstreifen erscheinen mit ausreichendem Kontrast in der Live-Imaging-Fenster der Imaging-Erfassungssoftware und erfassen ein digitales Hologramm.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3 - 3.3.5, bis eine ausreichende Anzahl von hellen Feldbilder und digitale Hologramme unterschiedlicher Probenbereiche aufgezeichnet wurden. Hologram Akquisition ist nun abgeschlossen.
  4. Herstellung der Wundheilung Assays für DHM Bildgebungs
    1. Einschalten der Petrischale Heizkammer des DHM Mikroskop etwa von 1 bis 3 h vor dem Beginn des Experiments zu stabilen Temperaturbedingungen während der DHM Messungen gewährleisten.
    2. Bereiten Werkbank mit der erforderlichen Ausrüstung (Petrischale für Wundheilungsassay in 2,3 beschrieben wird): Pipetten, Pinzette, Glasdeckel für Petrischale, 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) gepufferten Zellkulturmedium mit physiologischer Temperatur (37 ° C) für die Probenvorbereitung in steriler Umgebung.
      HINWEIS: Dulbeccos modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) besteht aus 10% fötalem Kälberserum (FCS) zusammensetzt, 20 mM HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure) und 850 mg / L NaHCO 3.
    3. Entfernen Sie den Kunststoffdeckel aus der Petrischale und entfernen Sie die Zellkulturmedium mit einer Pipette. Entfernen Sie den Einsatz aus der Petrischale Boden mit einer Pinzette.
    4. Waschen Sie die Probe 1 - 2 mal mit 1 ml HEPES - gepufferter Zellkulturmedium , um tote Zellen und restliche Zellbestandteilen ( zum Beispiel Serum) in den Wundbereich zu entfernen. 2 ml HEPES-gepufferte Zellkulturmedium und die Kappe der Petrischale mit dem Glasdeckel.
    5. Stellen Sie sicher, dass der Glasdeckel und die Petrischale Boden von Staub und anderen Verunreinigungen gereinigt wurden. Probe ist für Zeitraffer Beobachtung mit DHM bereit.
  5. Kontinuierliche multimodal Überwachung der Wundheilung in vitro mit DHM
    1. Schalten Sie die Petrischale Heizraum des DHM Mikroskop etwa 1-3 Stunden vorzu Beginn des Experiments in den DHM Messungen stabile Temperaturbedingungen sicherzustellen.
    2. Switch "auf" der digitalen holografischen Mikroskops, wählen Sie die 10X Mikroskop-Objektiv für die Bildgebung. Starten Sie die Bildaufnahme-Software des DHM Mikroskop und wählen Sie "Hellfeld" Abbildungsmodus. Stellen Sie sicher, dass der Heizraum für die Petrischale wird eine physiologische Temperatur (37 ° C) betrieben wird.
    3. Legen Sie die Petrischale mit dem Wundheilungs Assay, hergestellt wie in 4) beschrieben, in den Heizraum des DHM Mikroskop.
    4. Wählen Sie die Hellfeldabbildung Modus und die Position der Probe mit dem Mikroskoptisch, während sie in der Live-Überwachungsfenster des Bildaufnahme-Software des Mikroskops DHM zu beobachten. Beachten Sie, dass der gewünschte Bereich der Probe scharf unter Weißlichtbeleuchtung scharf erscheint.
    5. Erfassen Hellfeldbilder verschiedener Bereiche der Probe (Wundbereich und die umliegenden Gebiete mit konfluenten Zellen) unter weißemLichtbeleuchtung mit der Bildaufnahme-Software und Dokumenten Aussehen, Zelldichte und Homogenität.
    6. Wählen Sie "Hellfeld" Abbildungsmodus des Mikroskops DHM. Wählen Sie eine geeignete Wundbereich unter Beleuchtung mit weißem Licht im Live-Monitoring-Fenster mit der Bildaufnahme-Software des DHM Mikroskop. Sicherstellen, dass die Wundfläche von toten Zellen frei ist und kein Serum bleibt, und stellen Sie sicher, dass beide Seiten eine einzige homogene Zellschicht, vorzugsweise mit geraden Grenzen.
    7. Nehmen Sie ein Weißlichtbild des ursprünglichen Wundbereich in Hellfeld-Bildaufnahmemodus mit der Bildaufnahme-Software des DHM Mikroskop.
    8. Schalten Sie "Aus" Weißlichtbeleuchtung, wählen Sie "DHM" -Modus und Schalter "auf" Laserbeleuchtung. Wählen Sie eine Belichtungszeit von weniger als 3 msec zur Hologrammaufzeichnung (beachte, dass die holographische außeraxialen Interferenzstreifen mit ausreichender Kontrast erscheinen in dem Live-Abbildungsfenster der Bildaufnahme-Software von ter DHM Mikroskop) und ein digitales Hologramm zu erfassen.
    9. Nehmen Sie ein Probe-Hologramm in DHM-Modus mit der Bildaufnahme-Software und zu rekonstruieren, eine quantitative Phasenbild mit der Rekonstruktionssoftware des DHM Mikroskop, um die Bildqualität zu überprüfen.
    10. Wählen Sie eine geeignete Zeitverzögerung (zB 3 bis 5 min) für Zeitraffer-Hologramm Erfassung mit dem Bildaufnahme - Software des Mikroskops DHM.
    11. Wählen Sie die Zeitraffer-Aufnahmemodus der Bildaufnahme-Software, in dem die Probe nur mit Laserlicht während Hologramm Erwerb beleuchtet wird.
    12. Starten Sie den Zeitraffer-DHM Beobachtung der Wundheilung Assays.
    13. Stoppen Sie die Zeitrafferaufnahme nach der vorgesehenen Zeit, wählen Sie Hellfeldabbildungsmodus und dokumentieren das endgültige Aussehen der Probe unter Weißlicht-Bildgebung.
  6. Rekonstruieren digitaler Hologramme von sezierten Gewebe und bestimmen den mittleren Brechungsindex als Parameter zu quantifizierenGewebedichte
    1. Rekonstruieren quantitative Phasenbildern aus den digitalen Hologramme sezierten Gewebe mit der Software des DHM Mikroskop, beispielsweise wie in Kemper et al. 26 und Langehanenberg et al. 27.
    2. Bestimmen Sie die mittlere Phasenkontrast Δφ in verschiedenen Gewebeschichten (Epithel, Submukosa, Stroma) in entsprechend ausgewählten Regionen von Interesse (ROIs) 19.
    3. Bestimmen, um den Brechungsindex des Einbettungsmediums durch ein Refraktometer oder alternativ durch einen entsprechenden Wert aus der Literatur verwendet wird. (Brechungsindexwerte für typische Einbettung Medien: n Wasser = 1,334 28, n Phosphat - gepufferte Salzlösung (PBS) = 1,337 29, n Zellkulturmedium = 1,337-1,339 29,30).
    4. Berechnen der Brechungsindizes der verschiedenen Gewebeschichten von der mittleren Phasenkontrastwerte 19
      figure-protocol-15611 (1)
      HINWEIS: In Gl. Λ 1 die Wellenlänge des Laserlichts (hier: λ = 532 nm), d die Dicke der sezierten Gewebe (hier: 7 & mgr; m) und n Medium ist der Brechungsindex des Einbettungsmediums (hier: n Medium = n PBS = 1,337, mit einem Abbe-Refraktometer bestimmt).
  7. Rekonstruieren und bewerten digitale Hologramme aus dem Zeitraffer-Wundheilungs Serie Beobachtung
    1. Rekonstruieren quantitative Phasenbilder aus der Zeitreihe Verstreichen Hologramm während der Wundheilung Beobachtung mit dem DHM Mikroskop - Software 26,27 erhalten.
    2. Normalisieren jeder Reihe von quantitativen Phasenbilder zu dem Bild mit maximaler Phasenkontrast.
    3. Die Fläche S c, die von den Zellen in den quantitativen DHM Phasenbilder durch Bildsegmentierung abgedeckt ist, die je sein kannmit der kostenlosen Software - Zelle Profiler gebildet (www.cellprofiler.org 31).
    4. Berechnen Sie die mittlere Phasenkontrast der Zellen Δφ Zelle im Bereich S c.
    5. Rufen Sie die Zelltrockenmasse DM von der durchschnittlichen Phasenkontrast Δφ Zelle im Bereich S c 15
      figure-protocol-16986 (2)
      HINWEIS: In der Gleichung 2 DM die Zelltrockenmasse bezeichnet, präsentiert S c die Fläche, die von den Zellen und α = 0,002 m 2 / kg besetzt ist.
    6. Bestimmung der integralen Zellbrechungsindex n Zelle und der Brechungsindex des Zellkulturmediums n Medium. Bestimmen Sie n Zelle separat experimentell aus suspendierten Zellen , wie in 30 und messen n Medium mit einem Refraktometer beschrieben. Alternativ Literaturwerte für n - Zelle 30 und n Medium 29,30 verwenden.
    7. Berechnen Sie die mittlere Zelldicke d Zelle von λ, Δφ Zelle, n - Zelle und n Medium 26,32
      figure-protocol-17943 (3)
      HINWEIS: In Gl. 3 der Parameter d Zelle ist die durchschnittliche Zelldicke, λ bezeichnet die Lichtwellenlänge des Laserlichts bezeichnet Δφ Zelle die durchschnittliche Phasenkontrast, und n - Zelle und n Medium sind die integrale zellulären Brechungsindex und der Brechungsindex des umgebenden Mediums.

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Ergebnisse

Typisches Setup für DHM Imaging für digitale holografische Mikroskopie (DHM)

Zur Durchführung Hellfeld - Bildgebung und quantitative DHM Phasenkontrast - Bildgebung angewendet wir ein inverses Mikroskop wie in Abbildung 1 B dargestellt. Das System wurde modifiziert , indem ein Modul DHM Anbringen, wie bereits 25 beschrieben. YAG - Laser λ = 532 ...

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Diskussion

Wir zeigen , dass DHM genaue Beurteilung der histologischen Schäden in murinen Colitis - Modellen und menschlichen Kolon - Gewebeproben ex vivo zur Verfügung stellt. Darüber hinaus haben wir DHM kontinuierlich epithelialen überwachen heilenden Wunde gezeigt , während gleichzeitig multimodale Informationen zu zellulären Veränderungen bereitstellt. In DHM, ist die Rekonstruktion von digital aufgenommenen Hologrammen numerisch 32 durchgeführt. Daher kann im Vergleich zu Hellfeldmikrosko...

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Azoxymethane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyA5486
Cell Culture FlaskGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, USA4488
Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - AustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanySPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070
Isopentane (2-Methylbutane)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM32631-1L
Methylene blueMerck, Darmstadt, Germany1159430025
Mitomycin CSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM4287
Microscope SlidesG. Menzel, Braunschweig, GermanyJ1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583
Pen/Strep/Amphotericin BLonza, Verviers, Belgium1558
Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgium3626
Sodium Chloride 0.9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
Trypsin EDTALonza, Verviers, Belgium7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, Teningen, Germany04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, highibidi GmbH, Munich, Germany81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insertibidi GmbH, Munich, Germany80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Digital holographic microscope
ComponentModelCompany
Inverted MicroscopeiMICTill Photonics, Graefelfing, Germany
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lensZeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Goettingen, Germany
CCD cameraDMK 41BF02The Imaging Source, Bremen, Germany

Referenzen

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