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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Zusammenfassung

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Einleitung

Eine Einschränkung der derzeitigen HIV-1-Behandlungen ist, dass sie chronisch Fortschreiten der Krankheit zu verhindern, verabreicht werden müssen. Transplantation von HIV-1 resistent T - Lymphozyten oder hämatopoetischen Stammzellen, hat das Potenzial , Langzeitkontrolle der HIV-1 - Replikation in Abwesenheit von Arzneimitteltherapie 1,2 und kann auch ein wirksamer Ansatz sein , um eine HIV-1 Heilung zu erreichen 3. Ein Weg , um Zellen resistent gegen HIV-1 - Replikation rendern ist ein oder mehrere Gene einzuführen , kodierend für anti-HIV-1 RNAs oder Peptide in einem infizierten Individuum Zellen während einer autologe Transplantation 4. Mehrere Kandidaten anti-HIV-1 - Gene wurden mit einigen klinischen Studien Eingabe in Kombinationen von zwei oder drei 5 6, die die Entwicklung von HIV-1 Resistenz gegenüber einem einzelnen Gen zu verhindern.

Anti-HIV-1 RNAs sind unter den ersten Kandidaten für die Kombination Gentherapie aufgrund ihrer niedrigen Potential Immunantworten hervorzurufen, und weil siesind von sehr kurzen Gensequenzen transkribiert. Einige anti-HIV-1 RNAs wurden entwickelt Viruseintritt und Integration zu zielen. Allerdings sind die meisten anti-HIV-1 - RNA das Ziel nach der Integrationsschritte im viralen Lebenszyklus (Abbildung 1). Nachintegration Inhibitoren umfassen Decoy RNAs, die Targeting - HIV-1 - regulatorischen Proteine ​​Tat oder Rev 1 und Antisense-RNAs beruhen, verschiedene Standorte in HIV-1 - RNA - Targeting, wie Ribozyme 7, 8 und shRNAs U1i RNAs 9. Verfahren, die die Wirksamkeit von Anti-HIV-1 RNAs gehören die Überwachung der viralen Replikation in Zellen , transduziert mit Genen , kodierend für Kandidaten RNAs und Mess virale Produktion in Zellen , transient transfiziert mit Plasmiden exprimieren Kandidaten RNAs und eine HIV-1 - Expressionsplasmid 10 zum Vergleich verwendet wurden -13. Wir haben zuvor eine HIV-1 - Produktion zu screenen Assay HIV-1 RNA für neue Ribozym - Zielstellen 13-15 verwendet. Diese Verfahren sind seit verfeinert das Format einer RNA zu optimieren,Interferenz - Molekül von dem Plasmid DNA als shRNA oder geliefert als synthetisches siRNA 16 ausgedrückt. Der Assay misst die Produktion von reifen Viren aus menschlichen embryonalen Nieren (HEK) , 293T - Zellen, und kann verwendet werden , die Auswirkungen von Inhibitoren zu vergleichen , die nach der Integrationsschritte in der HIV-1 - Replikationszyklus Ziel (Abbildung 1). Für Inhibitoren , die Pre-Integrationsschritte Ziel, alternative Assays wie eine TZM-bl Zelle Infektiosität Assay 17 nötig sind , um antivirale Wirksamkeit zu bewerten.

Wichtige Sicherheitsbedenken für die Lieferung von Anti-HIV-1-RNA in der Klinik sind potenzielle Nebeneffekte auf die menschliche RNAs oder Proteine, und die Aktivierung der angeborenen Immunsensoren. Um die Toxizität von anti-HIV-1 siRNAs bewerten, haben wir einen Zelllebensfähigkeitstest in verschiedenen Zelllinien 16 verwendet. Wir maßen auch die Aktivierung der doppelsträngigen RNA-Immunsensoren, RNA aktivierte Proteinkinase R (PKR) und Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3), sowie expression des Interferon-stimulierte Gen, ADAR1 p150. Diese Assays können verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Wirksamkeit von Anti-HIV-1-RNA ist nicht auf indirekte Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen oder Immunsensoraktivierung. Sie sind auch nützlich in Ausnahme von Kandidaten RNAs mit potentiellen Toxizitäten von der weiteren Entwicklung.

In den folgenden Protokolle, Verfahren neue therapeutische RNAs zu identifizieren und zu optimieren das Format der bestehenden beschrieben werden. Die Verfahren sind nützlich für das Screening RNA basieren Nachintegration Inhibitoren der HIV-1 - Replikation und angepasst werden könnten andere post-Integration - Inhibitoren, wie kleine Moleküle Targeting Rev vermittelte Export von viraler RNA 18 oder CRISPR / CAS - Systeme entwickelt , um screenen integrierten Ziel HIV-1 DNA 19.

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Protokoll

1. Zellen und Transfektionen

  1. Kultur HEK 293T Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt. Vorbereiten eines 2 x 10 5 Zellen / ml - Suspension in dem Zellkulturmedium. In 500, 100 und 1000 & mgr; l der Zellsuspension in jede Vertiefung von 24-Well, 96-Loch - und 12-Well - Platten, die für die virale Produktion, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays, bzw. (2A).
  2. Vorsichtig schwenken die Platten und inkubieren O / N bei 37 ° C mit 5% CO 2. Wachsen Zellen zu 50-70% Konfluenz.
  3. Nach einer Transfektion Plan, bereiten Verdünnungen von Test RNAs und ihre Kontrollen in 1,5 ml Mikroröhrchen (Beispiel 2B).
    1. Für die virale Produktion Assay, bereiten eine 10 ng / & mgr; l Verdünnung einer HIV-1-Expressionsplasmid und 10 & mgr; l zu jedem Röhrchen hinzufügen. Vorbereitung Die nächsten 5 uM Verdünnungen von Test RNAs und eine negative Kontrolle RNA. In 2,5 oder 10 & mgr; l jeder Test RNA und negative Kontrolle Verdünnung auf die entsprechenden Rohre für 25 oder 100 nM Endkonzentrationen.
    2. Für die Zelllebensfähigkeitstest vorbereiten 5 uM Verdünnungen von Test RNAs und eine 10 mg / ml Verdünnung der positiven Kontroll-RNA, niedermolekulare Poly I: C. Fügen Sie 2 ul Test RNA oder positive Kontroll-RNA-Verdünnungen zu den entsprechenden Röhrchen 100 nM oder 200 & mgr; g / ml Endkonzentration, respectively.
    3. Für die Immunaktivierung Test werden 20 ul Test RNA oder positive Kontroll-RNA Verdünnungen, hergestellt in Schritt 1.3.2. zu den entsprechenden Röhrchen 100 nM oder 200 & mgr; g / ml Endkonzentration, respectively.
      Hinweis: Für den Test-RNA-Expressionsplasmide Herstellung von 10 ng / ul-Verdünnungen anstelle der 5 & mgr; M Verdünnungen von Test RNAs, so dass endgültige Mengen von 25 und 100 ng für Schritt 1.3.1. und 100 ng für die Schritte 1.3.2. und 1.3.3.
  4. In 50, 25 oder 75 & mgr; l DMEM zu jeder Transfektion Rohr für die virale production, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays sind. Für die virale Produktion Assays bringen Zellen und bereit Transfektion Rohre zu einem Bio-Sicherheitsstufe 3 (BSL3) Labor vor dem nächsten Schritt.
  5. Fügen Sie 2 ul des Transfektionsreagenz sequentiell an die Transfektion Röhrchen und Inkubation 15 bis 20 min-Komplexen zu erlauben, zu bilden. Siehe Tabelle der Materialien für die spezifischen Transfektionsreagenz verwendet werden.
  6. Fügen Sie die gesamte Transfektionsgemischs aus jedes Mikroröhrchen tropfenweise auf die entsprechenden Positionen in den Zellkulturplatten. Leicht geschwenkt und die Platten für 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2 inkubieren.
  7. Messen Sie HIV-1 - Produktion (Abschnitt 2), die Lebensfähigkeit der Zellen (Abschnitt 3) und Immunaktivierung (Abschnitt 4) in den Zellkulturplatten (2C).

2. Viral Produktion Assay

  1. Entfernen Sie die 24-Well-Zellkulturplatten aus dem Inkubator und vorsichtig schwenken die Platten im Inneren der BSL3 ZellkulturHaube. Übertragung von 150 & mgr; l Überstand aus jeder Vertiefung auf eine gut entspricht, in einer 96-Well-Flachbodenplatte, die verwendet werden, HIV-1-Produktion zu quantifizieren.
    Hinweis: Common viral Quantifizierungsassays umfassen die Expression des HIV-1 - Kapsidprotein Messung (p24) durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 20, viraler RNA durch reverse Transkriptase - Polymerase - Kettenreaktion quantifiziert (RT-PCR) 21 und Messen der Aktivität der HIV-1 RT-Enzym. Die Schritte 2.2 bis 2.5 erklären Methoden HIV-1 - RT - Aktivität 13,15,16 zu quantifizieren.
  2. Transfer 5 & mgr; l Überstand zu entsprechenden Vertiefungen in einer 96-Well - Platte, enthaltend 25 & mgr; l einer viralen Störung Cocktail 15 (Tabelle 1). Inkubieren der Mischung für 5 min bei RT und übertragen die Platte auf eine Radioaktivität Workstation.
    Hinweis: Schritt 2.2. Wenn ein Radioaktivität Workstation ist nur notwendig, nicht im BSL3 Labor ist. Wenn die Platten müssen nicht aus der entfernt werdenBSL3 Labor, gehen 2.3 zu treten. und fügen Sie 50 ul radioaktivem / viralen Störung Cocktail (Tabelle 1) anstelle der 25 ul radioaktiver Cocktail.
  3. Bereiten Sie eine radioaktive Cocktail 15 (Tabelle 1), und fügen Sie 25 ul in jede Vertiefung der viralen Überstand und Störungen Cocktail. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 2 Stunden.
  4. Spot 5 ul der Reaktionsmischung auf entsprechenden Plätzen in einer Glasfaser Di Ethyl Aminoethyl (DEAE) Filtermat Papier und ermöglichen die Flecken für 10 min trocknen. Spot der Reaktionsmischung auf jedem anderen Platz, so dass keine zwei Proben unmittelbar aneinander Grenze. Dies hilft, cross-over zwischen den Proben zu vermeiden, wenn in Counts pro Minute (cpm) Schritt 2.6 bestimmt wird.
  5. Waschen Sie die Papiere für 5 min 5x mit 2x Salz Natriumcitrat (SSC) Puffer (Tabelle 1), gefolgt von zwei 1 minütiges Waschen mit 95% Ethanol. Lassen Sie die Papiere, um zu trocknen und zu versiegeln sie in einen Probenbeutel verpackt.
  6. Clip Probenbeutel containing die Filtermatte Papier in eine Kassette und legen Sie die Kassette in einem Mikrotiterplatten-Szintillationszähler. Stellen Sie den Zähler cpm für 32 P mit dem Referenzdatum für die Partie von [32 P] dTTP in dem Experiment verwendet zur Verfügung gestellt zu lesen. Wählen Sie die Proben zu lesen, die Platte Karte unterhalten und den Zähler zu starten.
  7. Für jede viral Quantifizierungsmethode, teilen die Werte für jede Test RNA durch die benachbarte negative Kontrolle erhalten und multiplizieren diesen Wert mit 100 für jede Wiederholung der Test RNAs die prozentuale Hemmung der HIV-1-Produktion zu erhalten. Ein Beispiel der Ergebnisse verschiedener Test RNAs in unterschiedlichen Konzentrationen zu vergleichen ist in 3 bereitgestellt.

3. Zell Viability Assay

  1. Entfernen Sie die Platten mit 96 Vertiefungen aus dem Inkubator und füge 20 & mgr; l von 5 mg / ml MTT (3- [4,5-Dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-bromid), verdünnt in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ( DPBS) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten foder 3 Stunden bei 37 ° C.
  2. Zugabe von 150 ul angesäuertes Isopropanol mit einem Detergens (1% NP-40, 4 mM HCl in Isopropanol) in jede Vertiefung und Inkubieren der Platten für 2 h bei RT.
  3. Bestimmen Sie die Absorption bei 570 nm in einem Mikroplatten-Spektralphotometer.
  4. Berechnen der relativen MTT-Metabolismus für jede positive Kontrolle und Test-RNA durch den Wert für jede Probe durch seinen benachbarten Transfektionskontrolle erhalten dividiert wird. Ein Beispiel der Ergebnisse verschiedener Test RNAs und eine positive Kontrolle Vergleich ist in Figur 4 vorgesehen.

4. Immunaktivierung Assay

  1. Entfernen Sie die 12-Well-Platten aus dem Inkubator und absaugen Kulturmedien. Die Zellen vorsichtig waschen zweimal mit DPBS und 70 ul Puffer kalt Lyse in jede Vertiefung 22 (einschließlich Protease und Phosphatase - Inhibitoren, Tabelle 1) hinzuzufügen. Inkubieren Sie die Platten für 10 Minuten auf Eis.
  2. Übertragen Sie Zelllysate auf Mikroröhrchen und sie schnell frieren durch das EintauchenRöhrchen in flüssigem Stickstoff. Lassen Sie die Proben für 2 weitere Gefrier-Auftau-Zyklen für insgesamt 3 aufzutauen und zu wiederholen.
  3. Zentrifugation der Lysate 15 min bei 4 ° C, 15.700 xg, um Zelltrümmer zu pelletieren. Den Überstand auf neue Mikroröhrchen und bestimmen die Proteinkonzentration unter Verwendung des Coomassie - Blau (Bradford) Methode 23,24.
  4. Auflösen 75 ug Protein aus jeder Probe in einem 10% igen denaturierenden Polyacrylamid - Gel und Transfer auf eine Nitrocellulosemembran , wie zuvor beschrieben 25,26.
  5. (Tabelle 1) für 1 min , gefolgt von Waschen in doppelt destilliertem Wasser nach der Elektrophorese und Transfer auf eine Membran, offenbaren Proteinbanden durch die Membran in Ponceau S inkubiert. Verwenden Sie die Bänder und Proteinleiter als Führung der Membran bei 80 und 55 kDa zu schneiden.
    Hinweis: In Schritt 4.4 kann mit Hilfe von 16 x 18 cm 2 Gelen ausgeführt werden , bis zu 34 kDa, so dass es einfach ist , die Membran an den angegebenen Positionen zu schneiden und nicht durch den ausgeschnittenenBands von Interesse. Alternativ können mehrere Gele mit den gleichen Proben durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass die Membran zu schneiden.
  6. Auswaschen der Ponceau S Färbung mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung , enthaltend 0,05% Tween 20 (TBST, Tabelle 1). In TBST mit 5% fettfreie Milch, um vollständig die Membranen abdecken. Inkubieren der Membranen bei RT unter Rühren für 1 Stunde.
  7. Inkubieren der Membranen O / N in TBST mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 in 1000 gegen ADAR1 verdünnten Antikörper (110 und 150 kDa), phospho-PKR (62 kDa) und phospho-IRF3 (47 kDa), für die oberen, mittleren und unteren Teile der Membran sind.
  8. Waschen Sie die Membranen für 5 min mit TBST 5x und in TBST mit 5% fettfreie Milch und Peroxidase-markierten Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (verdünnt auf 1 in 5000) für 1 Stunde inkubiert.
  9. Waschen Sie die Membranen 5x 5 min mit TBST und gelten Elektrochemilumineszenz (ECL) Lösung, die Bänder auf Filme zu visualisieren den Anweisungen des Herstellers entsprechend.
  10. Nach Visualisierung auf Filme, die die Proteinbanden, wasche die mittleren und unteren Stücke der Membran für 10 min mit einem Antikörper Ausstreiflösung. Inkubieren der Membranen O / N in TBST mit 3% BSA und Antikörper gegen Gesamt PKR (bei 1 in 500) und IRF3 (bei 1 in 1000), für die mittleren und unteren Teile, respectively. Wiederholen Sie die Schritte 4.8. und 4.9. unter Verwendung von Peroxidase-markiertem Ziege-anti-Maus anstelle des anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers für die PKR-Membran (mittel).
  11. Waschen Sie das Unterteil der Membran 5x für 5 min mit TBST und die Membran in TBST mit 3% BSA für 1 h inkubiert mit einem Antikörper gegen Actin (verdünnt auf 1 in 5000). Wiederholen Sie die Schritte 4.8. und 4.9. unter Verwendung von Peroxidase-markiertem Ziege-anti-Maus anstelle des anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers. Ein Beispiel der Ergebnisse verschiedener Test RNAs und eine positive Kontrolle zu vergleichen ist in 5 vorgesehen. Siehe Tabelle der Materialien für die spezifischen Antikörpern verwendet werden.

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Ergebnisse

Eine allgemeine schematische Darstellung der Verfahren ist in Figur 2 mit einem Beispiel der Transfektion Plan für drei Test RNAs und einer Steuer RNA bereitgestellt in 2B gezeigt. Für die virale Produktion und Zelllebensfähigkeitstests, die Auslese für jedes Testkonstrukt wird auf eine negative Kontrolle normalisiert. Replikate werden in Sätzen transfiziert, so daß jeder Test RNA an seinen benachbarten negativen Kontrolle normiert. Dies geschieht,...

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Diskussion

Die HIV-1 - Produktion beschriebenen Assay wurde unter Verwendung von HEK293T - Zellen (Figur 2) durchgeführt und ist ähnlich Assays verwendet HIV-1 - RNA für eine effektive Ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30 und U1i RNA 11,31 Zielstellen zu screenen. Mit Hilfe verschiedener Methoden HIV-1-Produktion zu quantifizieren, wurden die meisten Studien virale Produktion 48 Stunden nach der Co-Transfektion eines HIV-1-Expressionsplasmid mit Kandidaten RNAs gemessen....

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

Die vorgestellten Arbeiten wurden von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt (gewährt DCB-120266, PPP-133377 und HBF-348967 zu AG).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin/Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
Low molecular weight Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1MirusMIR 2300transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA template Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper Perkin Elmer1450-522
Microplate scintillation counterPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Microplate spectrophotometerBio-rad1706930
Lysis buffer tabletsRoche4693159001, 4906837001protease and phosphatase inhibitors
MicrocentrifugeEppendorf5415R
Bradford reagentBio-rad500-0006
Gel running chamberHoeferSE600
Semi-dry transfer cellBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Nitrocellulose membraneBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Antibody stripping solutionMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher PI32106
ADAR1 antibodyfrom Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibodyAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antibodyCell Signaling4947
PKR antibodyfrom Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibodyCell Signaling11904
Actin antibodyMilliporeMAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbitKPL474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouseKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5

Referenzen

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