Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Carolina Rodriguez-Tirado; Takanori Kitamura; Yu Kato; Jeffery W. Pollard; John S. Condeelis; David Entenberg

doi:10.3791/54603

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In diesem Artikel

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Einleitung
Protokoll
Ergebnisse
Diskussion
Offenlegungen
Danksagungen
Materialien
Referenzen
Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Zusammenfassung

Metastasierung zu sekundären Standorten wie der Lunge, Leber und Knochen ist ein traumatisches Ereignis mit einer Mortalitätsrate von etwa 90% ^1. Von diesen Standorten ist die Lunge der schwierigste im Körper, zarte Natur und entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung richtige Physiologie mit intravital optische Bildgebung aufgrund seiner geschlossenen Position zu beurteilen. Obwohl klinische Modalitäten (Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Kernspintomographie (MRI) und Computertomographie (CT)) vorzusehen noninvasive Bilder dieser Gewebe fähig sind, fehlt ihnen die Auflösung notwendig, um die frühesten seeding Ereignisse zu visualisieren, mit einem einzigen Pixel bestehend aus fast tausend Zellen. Aktuelle Modelle von metastasierendem Lungenkrebs Seeding Postulat, die Ereignisse kurz nach Ankunft eines Tumorzelle für das Überleben und das anschließende Wachstum deterministisch sind. Das bedeutet , dass in Echtzeit intravital Imaging - Tools mit Einzelzellenauflösung ² erforderlich sind , um die Phänotypen der Aussaat cel zu definierenls und diese Modelle zu testen. Während hochauflösende optische Bildgebung der Lunge hat verschiedene ex vivo Präparaten durchgeführt wurde unter Verwendung sind diese Experimente typischerweise Einzelzeitpunkt Assays und sind anfällig für Artefakte und mögliche falsche Schlüsse aufgrund der dramatisch veränderten Umfeld (Temperatur, Überfluss, Cytokine, usw. ) aus der Entnahme aus dem Brustraum und Kreislaufsystem ³ führt. Neuere Arbeiten haben , dass die Zeit-lapse intravital optische Bildgebung der intakten Lunge gezeigt ist möglich unter Verwendung einer Vakuumabbildungsfenster ^2,4,5 stabilisiert jedoch typische Aufnahmezeiten wurden auf etwa 6 Stunden begrenzt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige intravital Zeitraffer-Bildgebung der Lunge Durchführung eines solchen Fensters über einen Zeitraum von 12 Stunden verwendet wird. Die Zeitraffer-Bildsequenzen dieser Methode unter Verwendung ermöglichen die Visualisierung und Quantifizierung von Zell-Zell-Interaktionen, Membrandynamik und Gefäßperfusion in der Lunge. Wir weiter dEscribe eine Bildverarbeitungstechnik, die eine beispiellos klare Sicht auf die Lunge microvasculature gibt.

Einleitung

Hochauflösende optische Abbildungsintravital hat zum Verständnis vielen biologischen Prozessen entscheidend erwiesen, so dass Einzelzelle und subzellulären Parameter gemessen und quantifiziert. In der Krebsforschung hat intravital Bildgebung von Tumor- und Stromazellen führte zur Entdeckung vieler Mikroumgebungs Wechselwirkungen ^6-11 , die nur in dem intakten Tier sind.

Entdeckungen über im Zusammenhang mit Mikroumgebungen intravasation und Verbreitung von Tumorzellen bei Brustkrebs einzelne Zelle auflösende optische Bildgebung in vivo unter Verwendung von sogar ^{12 bis 16} neue Marker für die Prognose und das....