Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Zusammenfassung

Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.

Zusammenfassung

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

Einleitung

Efficient separation of a cell population of choice from other cells enables studies of the population that may not be possible otherwise. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a method to enrich an interesting cell population with high purity. ^1,2 Different cell types usually express unique molecules, or a unique combination of several molecules, on the plasma membrane that can distinguish one cell population from another. Upon binding of these cell surface molecules by specific fluorescence-conjugated antibodies, a detecting machine called flow cytometer/sorter is able to excite and detect the light signals of different fluorescent dyes that represent different molecule markers on the cells at the single cell level. The combined information consisting of either the presence of a light signal (representing positive expression of the corresponding surface molecule) or the absence of a light signal (representing negative expression of a molecule) defines the phenotype of the cell. After passing through the detector, cells with the same phenotype of interest are diverted towards a designated collecting tube based on electrical charge.

FACS is broadly applied in various studies as long as the population to be enriched is labeled with fluorescence.^3-7 It has been used to separate immunoglobulin (Ig)A-coated bacteria from non-IgA coated bacteria in the gut microbiota ⁸ and sort genetically engineered cell populations expressing fluorescent proteins. ⁹ Importantly, it has the capacity to separate more than one population simultaneously, which not only saves time and reagents but also allows for more sophisticated study designs. ¹⁰ However, FACS also has its limitations. If a population of interest is very rare (less than 1%), the sorting efficiency may be reduced, causing significant cell loss. In addition, some antibody binding may activate intracellular signal transduction that induces functional changes of the sorted cell population. ¹¹ Therefore, the phenotype used for sorting should be selected carefully.

Other methods exist besides FACS that are also based on cell surface markers for the enrichment of specific cell populations, such as magnetic-activated cell sorting (MCS). ¹² Similar to FACS, magnetic beads-conjugated antibodies can target specific cell surface molecules. Upon antibody-antigen interaction, magnetic beads-coated cells can be separated from non-coated cells after passing through a magnetic field. However, only a limited number of molecules can be targeted in MCS, as magnetic beads are, unlike various fluorescent colors in FACS, undistinguishable. It is thus difficult for MCS to define a cell phenotype with a complicated combination of surface markers. ^13,14 In addition, MCS is also able to cause unintended activation of target cells.

In our studies of a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE), ¹⁵ we intended to purify plasmacytoid dendritic cells (pDC) to investigate their functional changes with disease progression. We first used MCS to enrich pDC from the bone marrow by targeting PDCA-1, a molecule highly and uniquely expressed on murine pDC at steady state. ¹⁶ However, the cell purity was unexpectedly low, likely due to the upregulation of PDCA-1 on other cell populations in an inflammatory environment such as SLE.¹⁶ Ultimately, we have used FACS with a combination of four surface markers (CD11c, CD11b, B220 and PDCA-1) to separate high-purity pDC as CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ population. Murine pDC has another specific surface marker Siglec-H. We decided not to use Siglec-H, as antibody binding of this molecule represses the function of pDC to produce IFNα. ¹¹

Protokoll

HINWEIS: MRL / Mp-Fas ^lpr (MRL / lpr) Lupus anfällige Mäuse wurden in einem spezifischen Pathogen freien Anlage entsprechend den Anforderungen des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech (Animal Welfare Assurance Anzahl gezüchtet und gepflegt: A3208-01). Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tierversuche wurden unter IACUC Protokoll # 12-062 durchgeführt.

1. Zellkulturmedium und Sortierpuffer

1. Bereiten komplette Zellkulturmedium (C10) unter Verwendung von RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1% 100 MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 10 mM HEPES, 55 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin.
2. Bereiten Sortierpuffer (HBSS-full) unter Verwendung von 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), supplementiert mit 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml Rinderserumalbumin,0,05 mM MgCl ₂ und 0,2 U / ml DNase I.

2. Maus Dissection

1. Bereiten Sie zwei 6-cm Durchmesser Schalen mit 4 ml C10. Die Schalen werden auf Eis.
2. Euthanize die Maus durch CO ₂ Inhalation.
3. Ernten Sie die Milz und halten Sie sie in eine Schüssel mit C10 auf dem Eis.
   1. Pin der Maus mit dem Bauch nach unten nach oben auf der Dissektion Platte. Sterilisieren Sie den Körper 70% Ethanol durch Sprühen.
   2. Schneiden Sie die Haut und trennen Sie die Haut von der Muskelwand unterhalb entlang der ventralen Mittellinie von der Symphyse bis zum Hals.
   3. Schneiden Sie die Haut an der hinteren Gliedmaßen vom ersten Schnitt bis zum Knöchel.
   4. Pin der Haut zurück an den Seiten und schneiden Sie die Muskelwand entlang der Seiten von der ersten Einschnitt statt abblendet.
   5. Pin der Muskelwand auf der rechten Seite des Kopfes zurück.
   6. Lokalisieren der Milz auf der rechten Seite der Maus unter dem Dünndarm und neben dem Magen. Pick-up ein Ende the Milz und es aus dem Magen zu trennen.
4. Schneiden Sie die beiden hinteren Extremitäten, einschließlich Femur und Tibia, und entfernen Sie alle Muskeln so viel wie möglich.
   1. Schneiden Sie die Muskeln entlang der hinteren Gliedmaßen aus dem Becken / Hüftgelenk bis zum Knöchel mit einer scharfen Schere, versuchen, die Blutgefäße zu vermeiden.
   2. Trennen Sie die hinteren Gliedmaßen, indem du den Becken / Hüftgelenk Schneiden und Knöchel / Fußgelenk ohne die Exposition von Knochenmark Inhalte.
   3. Saubere verbleibenden Muskeln an den Knochen durch wiederholt mit einer Rasierklinge Kratzen und die Muskeln an den Verbindungspunkten schneiden.
5. Halten Sie die Knochen in einer 6 cm Schale mit 4 ml C10 auf dem Eis. Fahren Sie die nächste Maus zu sezieren.

3. Splenozyten- Isolation

1. Homogenisieren der Milz vorsichtig mit einem Spritzenkolben gegen eine 70 & mgr; m Zellsieb auf der Oberseite der Schale mit 4 ml C10 bis keine roten Stück sichtbar sind.
2. Fügen Sie weitere 6 ml C10 in die Schale durch das Sieb einnd dann übertragen die insgesamt 10 ml Zellsuspension auf eine 15 ml konischen Röhrchen.
3. Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
4. Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und Zellpellet in 2 ml 1 x roter Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer. 5 min bei RT inkubiert.
5. zentrifugieren der konischen Röhrchen bei 800 xg Nach der Inkubation für 5 min, 4 ° C.
6. Nach dem Zentrifugieren der Überstand absaugen und das Zellpellet in 1 ml C10 resuspendieren. Entsorgen Sie alle großen Klumpen (tote Zellen) und halten Sie die Röhrchen auf Eis für später.
   HINWEIS: Wenn es viele kleine Klumpen sind, verwenden Sie eine 70-um-Zelle Sieb einmal die Zellsuspension zu filtern.
7. Zählen Sie die Zellzahl mit Trypanblau unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler.

4. Knochenmarkzellisolierung

1. Übertragen Sie die Knochen mit 4 ml C10 in einen Mörser und 6 ml C10 auf ein Volumen von 10 ml C10 insgesamt machen.
2. Knacken Sie die Knochen sanft in den Mörtel von ap mitestle.
3. Rühren Sie vorsichtig mit dem Stößel des Knochenmarks in C10 zu lösen.
4. Übertragen Sie die 10 ml C10 enthält Knochenmark in einem 50 ml konischen Röhrchen auf Eis durch einen 70-um-Zelle Sieb. 10 ml frisch C10 in den Mörtel noch die Knochen enthält.
   HINWEIS: Pipettieren Sie die Lösung, die auf Knochenmark und nach unten mehrmals, bevor sie durch das Sieb vorbei, wenn roten Klumpen sichtbar sind.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.4 zweimal. Nach der letzten Waschung sollten die Knochen weiß erscheinen.
6. Zentrifugation der 50 ml konischen Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C. Inzwischen bereiten 5 ml ready-to-use-Dichtegradienten-Medium in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen bei RT.
7. Nach dem Zentrifugieren der Überstand absaugen und das Zellpellet in 10 ml C10 resuspendieren.
8. die 10 ml Zellsuspension auf dem 5 ml Dichtegradientenmedium, die Aufrechterhaltung klare Schnittstelle zwischen den beiden Phasen langsam die Schicht. zentrifugieren dann den 15 ml konischen Röhrchen bei 1.363 g für 30 min beiRT (20 ° C) mit einer Beschleunigung Satz als 9 und Verzögerung eingestellt als 0 (oder Bremse AUS).
9. die Top 8 ml Lösung sorgfältig und sammeln Sie die 2 ml Leukozytenmanschette an der Schnittstelle (eine Schicht aus einkernigen Zellen) in eine neue 15 ml konischen Röhrchen Nach der Zentrifugation zu entfernen.
10. In 12 ml eiskaltem C10 zu den 15 ml konischen Röhrchen mit einkernigen Zellen des Knochenmarks, Kappe und mehrmals umdrehen gut zu mischen, dann zentrifugiert werden die Röhrchen bei 800 g für 10 min, 4 ° C.

5. Zeiloberflächenfärbung für FACS

1. Probenfärbung
   1. Bereiten anti-Maus-CD16 / 32-Antikörperlösung (1 bis 100 Verdünnung in HBSS-voll, 5 ug / ml Endkonzentration).
   2. Nach der Zentrifugation in Schritt 4.10, der Überstand absaugen und das Zellpellet in 100 ul anti-Maus-CD16 / 32-Antikörperlösung resuspendieren Fc-Rezeptor auf den mononukleären Zellen zu blockieren. Inkubieren auf Eis für 10 min.
   3. Bereiten Fluoreszenz-konjugiertes Antikörpermischung (anti-Maus CD11c-PE Verdünnung von 1:40, Anti-Maus-CD11b-APC-CY7 1:80 Verdünnung, anti-Maus PDCA-1-FITC Verdünnung von 1:40 und anti-Maus-B220-V500 Verdünnung von 1:40 in HBSS- voll, wie bei 100 & mgr; l Endvolumen pro Probe vom Hersteller empfohlen).
      HINWEIS: Es ist wichtig, Antikörper vor dem Gebrauch zu titrieren.
   4. Nach 10 min Inkubation in Schritt 5.1.2, 4 ml eiskaltem HBSS voll und Zentrifuge bei 800 xg für 5 min, 4 ° C ungebundenen Anti-Maus-CD16 / 32 zu entfernen.
   5. Nach Zentrifugation absaugen Überstand und Zellpellet in 100 ul fluoreszenz konjugierten Antikörpermischung. Inkubieren auf Eis für 15 min im Dunkeln.
   6. Nach 15 min Inkubation, 4 ml eiskaltem HBSS voll und Zentrifuge bei 800 xg für 5 min, 4 ° C ungebundene Fluoreszenz-konjugierte Antikörper zu entfernen.
   7. Bereiten Sie FACS Ladelösung (500 ng / ml DAPI in HBSS-voll).
   8. Nach der Zentrifugation in Schritt 5.1.6, der Überstand absaugen und das Zellpellet in 500 μ resuspendieren; L FACS Beladungslösung. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 12 x 75 mm Rundbodenrohr (FACS-Röhrchen) und halten Sie das Rohr auf Eis im Dunkeln innerhalb von 1 Stunde bis zu sortieren.
2. Das Anfärben zur Kompensation
   1. Label-6 FACS-Röhrchen wie PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI oder ungefärbt. Aliquotieren Splenozyten bei 1 x 10 ⁶ Zellen / Röhrchen in die FACS - Röhrchen und waschen mit 4 ml HBSS-Voll bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
      HINWEIS: Die Verwendung DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoff, DAPI, lebende Zellen von toten Zellen zu unterscheiden. DAPI kann die Plasmamembran von toten Zellen durchlaufen (aber nicht von lebenden Zellen) und binden Chromosom DNA.
   2. Den Überstand aspirieren und Zellpellet in 100 ul HBSS-voll.
   3. In jedes Röhrchen FACS entspricht, fügen Sie eine der folgenden Antikörper: anti-Maus-CD19-PE Verdünnung von 1:40, anti-Maus-CD11b-APC-CY7 1:80 Verdünnung, anti-Maus-PDCA-1-FITC Verdünnung von 1:40 oder Anti-Maus-B220-V500 Verdünnung von 1:40, wie durch die manufa empfohlencturer. Lassen Sie das ^5. (DAPI) und ^6. (ungefärbten) FACS - Röhrchen , wie sie sind. Gut mischen durch Schütteln und Inkubation alle FACS-Röhrchen auf Eis im Dunkeln für 15 min.
   4. Nach der Inkubation 4 ml eiskaltem HBSS voll in jedes Rohr und Zentrifuge die FACS-Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
   5. Nach Zentrifugation absaugen Überstand und Zellpellet in 500 ul eiskaltem HBSS-full Ausnahme des Pellets in dem Rohr DAPI markiert, die in 500 & mgr; l FACS Beladungslösung resuspendiert. Halten Sie alle 6 Röhrchen auf Eis im Dunkeln bis zu sortieren.

6. Sortierung auf dem Cell Sorter

HINWEIS: Der Betrieb auf dem Zytometer Verfahren Sortieren und Software wird mit einer ausführlichen Belehrung durch die Firma standardisiert. Kurz gesagt, verwenden wir bei 20 psi 100 Mikron Düse, Konzentration eingestellt Zielzelle zwischen 5-10000000 pro ml, und die Effizienz auf 70% einstellen oder höher (dh gehalten Konflikte unter 30%).

1. Bereiten Sammlung FACS-Röhrchen mit 500 & mgr; l FBS / Röhrchen, die 100 U / ml Penicillin-Streptomycin.
2. Stellen Sie Kompensationsparameter des Zellsortierer Einzelfleckenkompensations Rohre aus Schritt 5.2 verwendet wird.
   1. Nehmen 10.000 Zellen in ungefärbten Röhre für jede Fluoreszenzintensität negative Gate einzustellen.
   2. Nehmen 10.000 Zellen in anderen Single-Fleckenkompensations Röhrchen für jede Fluoreszenzintensität positive Gate einzustellen.
      HINWEIS: Die Software berechnet automatisch die Kompensationsparameter.
3. Verwenden Sie eine Probe aus Schritt 5.1 die Tore der sortierten Zellpopulationen zu setzen, indem 3.000 Zellen aufnehmen. Verwendung von Fluoreszenzintensität als Parameter X und Y-Achsen-Diagramm, Gate- Zielzellpopulation manuell als Gruppe von Punkten offenbar von anderen Punkten getrennt werden.
   HINWEIS: Diese Gating-Set ist flexibel und willkürlich basierend auf den Anforderungen der Forscher. Wenn Forscher eine höhere Reinheit erwarten basierend auf einem oder mehreren Markern, bewegen Sie das Torbasierend höher auf der entsprechenden Fluoreszenzintensität.
4. Laden Sie ein Sammelrohr und starten Sie die Zielzellpopulation zu sortieren.
5. Halten Sie das Sammelröhrchen auf Eis nach dem Sortieren, bis alle Probenröhrchen fertig sind.
6. In eiskalter C10 zum Sammelrohr bis zu 4 ml, Kappe und umkehren zu mischen.
7. Zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C, und dann den Überstand aspirieren, so dass etwa 200 & mgr; l mit Zellpellet unberührt.
8. 1 ml eiskaltem C10, um das Zellpellet zu resuspendieren und übertragen alle Zellsuspension in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
9. Zentrifugieren Sie die 1,5-ml-Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C und den Überstand aspirieren, so dass 100 & mgr; l mit dem Zellpellet unberührt.
10. Speichern Sie die sortierten Zellpopulationen auf Eis bis zum Gebrauch.

Ergebnisse

Wir wollten Knochenmark pDC- mit hoher Reinheit und ohne den Einfluss von anderen Zelltypen, von MRL / lpr Lupus anfällige Mäuse von jung und alt Alter zu bereichern die funktionelle Veränderungen der pDC- in Bezug auf ihre Fähigkeit zu untersuchen IFN alpha zu produzieren. Die erste Reinigungsstrategie verwendete MCS, die, wie Figur 1 zeigt, um nach der Anreicherung nur 7,75% Reinheit führte. Im Vergleich zu MCS, angereichert FACS pDC- mit Reinheit so hoch wie 96,4...

Diskussion

The protocol described in this manuscript is for high purity enrichment of live pDC that retain the ability to produce IFNα. The applications of this protocol include, but are not limited to, purification of pDC and/or any other mononuclear cells from the bone marrow of MRL/lpr and any other mouse strains for studies of cellular and molecular functions. Several critical steps in this protocol are to ensure high viability and purity of the sorted pDC. The first key step is the release of bone marrow from bones. To mi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	HyClone	SH30396.03
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penicillin-Streptomycin	gibco by life technologies	15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution	gibco by life technologies	14175-079
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer	eBioscience	00-4300-54
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
anti-mouse CD19-PE	BD Pharmingen	553786
anti-mouse CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
anti-mouse PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
anti-mouse B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva version 6	BD Biosciences