Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Zusammenfassung

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Einleitung

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape^1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast⁷.

The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli^7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles⁶. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.

Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts¹⁰. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic^9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana⁹.

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Protokoll

HINWEIS: Für dieses Protokoll haben wir auf Testen Stromulus Frequenz in der Epidermis von N. fokussiert benthamiana verlässt. Mehrere stabile transgene Linien erzeugt worden , die für diesen Zweck verwendet werden können, einschließlich 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ und NRIP1: Cerulean ^6. Beide Linien zeigen robuste Expression von Fluorophoren in den Chloroplasten Stroma der Blätter unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen. Alternativ Chloroplasten-bezogene Fluorophore transient in N. ausgedrückt werden kann benthamiana unter Verwendung von Agrobacterium - Transformationen ^13. Dies ist weniger ideal als die transgenen Linien, da einige basalen Abwehrreaktionen in N. induzieren Agrobacterium Infiltrationen benthamiana und Wechselwirkungen mit Agrobacterium kann Stromulus Frequenz in dem Blatt ^14, die möglicherweise zu verkomplizieren Interpretation der Ergebnisse zu ändern. Schließlich Stromulus Bildung in vitro zu visualisieren,Chloroplasten können aus jeder beliebigen Pflanzenspezies, entweder genetisch codierten Fluorophore oder einen fluoreszierenden Farbstoff extrahiert werden, wie in Kapitel 5 unten. ^9,15

HINWEIS:. Detaillierte Beschreibung der Methoden für Pflanzenanbau wurden bereits beschrieben ¹⁶ Kurz gesagt, wachsen N. benthamiana Pflanzen in 4 "Töpfe mit jeder professionellen Bodenmischung gefüllt , die eine gute Drainage zur Verfügung stellt. Decken Sie Sämlinge mit einem durchsichtigen Kunststoff - Kuppel in den ersten 10 bis 14 Tage , um eine feuchte Umgebung für die Keimung zur Verfügung zu stellen. In jedem Standard - Dünger - Mix Anweisungen folgen Herstellers zu 14- Tage alten Pflanzen. wachsen Pflanzen unter weißem Licht, mit ~ 100 & mgr; mol Photonen m ^-2 s ^-1 Lichtintensität. Wasserpflanzen regelmäßig.

1. Vorbereiten Blattproben für Visualisierung

HINWEIS: Stromulus Dynamik durch Verwundung ⁸ betroffen, so sollten Gewebepräparation sofort durchgeführt werden , bevor Stromulus Visualisierungs durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Idealerweise sollte eine Probe mit 15 min nach Entnahme aus der Anlage visualisiert werden.

1. Schneiden Sie einen kleinen Abschnitt des Blattes eine sehr scharfe Rasierklinge. Verwenden Sie immer den gleichen Bereich des Blattes für Konsistenz, und sicher sein, die gleiche Oberfläche (adaxial oder abaxial) in allen Versuchen zu visualisieren.
2. Unmittelbar nach dem Blattschneidabschnitt, die Blattabschnitt in einem 5 ml nadellose Spritze mit Wasser gefüllt unterzutauchen Entfernen von Luft aus der Spritze und ein Vakuum anzuwenden, indem die Spritzenöffnung mit einem Finger abdecken und den Kolben zu ziehen.
   1. Lassen Sie den Kolben sanft zu vermeiden, dass die Blattabschnitt zu beschädigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei- oder dreimal, oder bis die meisten der Luft entfernt worden ist und das Blatt erscheint tiefgrün sein.
      Hinweis: Dieser Schritt Luft in dem Blatt entfernt, die genaue Visualisierung von stromules stören können.
3. Fügen Sie einen Tropfen Wasser zu einer Folie und legen Sie den Blattabschnitt auf diesen Rückgang. Dann fügen Sie eine weitere drop Wasser an die Spitze des Blattes, und legen Sie eine Deckglas über das Blatt. Wenn es irgendwelche Luftblasen sind, vorsichtig das Deckglas klopfen, bis sie entfernt werden. Der Schlitten ist nun bereit für die Mikroskopie und sollten sofort sichtbar gemacht werden.

2. Visualizing Stromules mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

1. Mit durchgehendem Licht, konzentrieren sich auf ein Sichtfeld in der Nähe der Mitte des Blattes Abschnitt (weg von den durch die Rasierklinge geschädigte Zellen). Verwenden Sie ein 20x-Objektiv, so dass viele Chloroplasten gleichzeitig sichtbar gemacht werden kann. Speichern eines Bildes mit Durchlicht, so dass Zelltypen später unterschieden werden kann, falls erforderlich.
2. Schalten Sie die Beleuchtungsquelle einen Laser mit geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltern für das Fluorophor verwendet wird. Beispielsweise GFP mit einem 488 nm Laser erregt und Emissionen zwischen 500 nm und 525 nm erhalten.
   1. Mit Hilfe der Software des Mikroskops, wählen Sie die GFP-Kanal und klicken Sie auf die Lochblende auf 1 Ai einzustellenry Einheit. Wählen Sie Laserscanning, starten die Probe zu visualisieren, und klicken Sie dann auf das GFP-Kanal, um die Laserintensität einzustellen und die Detektorverstärkung der Laserleistung zu minimieren, während immer noch deutlich stromules zu visualisieren. Sobald diese Einstellungen festgelegt worden sind, halten sie so konsequent wie möglich in allen Experimenten.
3. Bereiten Sie eine z -stack Experiment , das eine Reihe von Bildern durch die Blattepidermis im Sichtfeld sammeln.
   1. Für die z -stack, umfassen alle epidermalen Chloroplasten in dem Sichtfeld Verzerrungen zu vermeiden (zum Beispiel, wenn die Chloroplasten in der Nähe der Blattoberfläche mehr stromules unter Bedingungen getestet haben).
   2. Nehmen Bilder mit der maximalen Intervall möglich , dass alle stromules beinhalten wird , aber minimiert die Zeit für eine z -stack erforderlich. Wenn zum Beispiel 1 Airy Einheit entspricht einem fokussierten konfokalen Abschnitt, der 2 & mgr; m tief ist, um ein Bild nehmen alle 2 & mgr; m wahrscheinlich ideal ist.
      HINWEIS: Das Blatt epidermis ist eine unebene Oberfläche, so dass die Gesamttiefe der z -stack auf der Probe abhängig variieren; die meisten z -stacks werden 10-20 Bilder erfordern, kann aber mehr beinhalten.
   3. Passen Scangeschwindigkeit und Bildauflösung als notwendig , um sicherzustellen , dass die z -stack schnell gesammelt wird ( in der Regel innerhalb von 5-10 min, wenn möglich). Speichern Sie die z -stack für eine spätere Analyse.

3. Bildverarbeitung

1. Bestimmen Sie Stromulus Frequenz unter Verwendung eines beliebigen Bildanalyse-Software. Für dieses Protokoll, empfehlen wir die Verwendung ImageJ, die von der National Institutes of Health öffentlich zugänglich ist (http://imagej.nih.gov/ij/) oder dem beliebten Upgrade von ImageJ, Fidschi (http://fiji.sc / Fidschi).
2. Zusammenführen der z -stack in einem einzigen Bild die maximale Intensitätsprojektion in der Software.
3. Identifizieren und von Hand alle Chloroplasten im Bild zu zählen.
4. Für jede Chloroplasten bestimmen visuell, ob ein oder mehrere stromulessind zu sehen in der fusionierten z -stack Bild von den Chloroplasten erstreckt. Beispiele siehe Abbildung 1.
   Hinweis: Da die biologischen Funktionen von stromules nicht bekannt sind, jede dünne, Stroma gefüllten, röhrenförmige Verlängerung aus dem Chloroplast kann ein "Stromulus" angesehen werden, unabhängig von der Länge. Als allgemeine Regel wird ein Stroma gefüllte Verlängerung von der Chloroplast ist ein Stromulus wenn es weniger als etwa 1 um im Durchmesser über den grßten Teil seiner Länge ⁷ ist. Stellen Sie sicher, dass eine Person alle Bilder Analysen zur subjektiven Unterschiede zur Kontrolle bei der Bestimmung, ob ein Chloroplasten ein Stromulus hat. Ein zweiter Forscher sollten die Stromulus Frequenzen unabhängig überprüfen zu weiteren subjektive Vorurteile reduzieren.

4. Experimentelles Design und Sampling

HINWEIS: Stromulus Frequenz ist sehr variabel zwischen Blättern, aber mehrere Berichte deuten darauf hin, daß es wenig Variation in Stromulus Frequenz innerhalb eines indiviDoppelblatt ^9,17.

1. Berechne die Blatt Stromulus Frequenz von einem einzigen Sichtfeld eines Blattes. Nehmen Sie das Blatt, und betrachten dies eine unabhängige Probe. Achten Sie nicht auf separaten Sichtfelder von einem Blatt als unabhängige Stichproben.
   HINWEIS: Es gibt keinen Konsens darüber, wie man am besten messen Veränderungen in Stromulus Aktivität, und bis die Funktion von stromules mehr klar definiert, Forscher sollten weiterhin bei der Quantifizierung Stromulus Dynamik, kreativ zu sein. Zum Vergleich: in der Literatur sollten jedoch gemeinsame Standards für die Berichterstattung zusätzlich zu mehr kreative Ansätze verwendet werden. Bei einem Minimum, können immer die Frequenz von Chloroplasten, die eine oder mehrere stromules haben.
2. Bestimmen Sie die Häufigkeit der Chloroplasten, die stromules in einem Sichtfeld haben. Verwenden ImageJ um alle Chloroplasten identifizieren, in einem Sichtfeld. Dann wird für jede Chloroplasten, bestimmen, ob die Chloroplasten mindestens eine Stromulus gebildet hat. Bericht Stromulus Frequenz wie die Percentage von Chloroplasten mit einem Stromulus.
   ANMERKUNG: Manche Forscher Transformations den Prozentsatz, beispielsweise mit dem Arcussinus-Transformation vor Stromulus Frequenzen Berichterstattung; Während dies eine Option für die statistische Analyse, ist die Arkussinus Stromulus Frequenz nicht ein intuitives Wert und muss nicht im Haupttext oder Zahlen einer Studie berichtet werden.
   1. Als alternativer Ansatz, die Gesamtzahl der stromules zählen und teilen sie durch die Gesamtzahl der Chloroplasten.
      HINWEIS: In den meisten Fällen diese ähnliche Ergebnisse liefern wird 4.2 zu nähern; es kann die Stromulus Frequenz, aber überschätzen, wenn ein einzelner Chloroplasten viele stromules gebildet hat. Im Beispiel unter repräsentativen Ergebnisse gezeigt, haben beispielsweise mehrere Chloroplasten zwei oder mehr stromules, die Anzahl der pro stromules Chloroplasten zu 40/87 Anhebung (im Vergleich zu einer Stromulus Frequenz von 33/87).
   2. Alternativ bestimmen die Stromulus Länge anstelle von Stromulus Frequenz. Länge gemessen werdenin ImageJ durch die Stromulus mit dem freihändig Zeilen-Tool zu verfolgen.
      HINWEIS: Da die biologische Rolle von stromules unbekannt bleibt, ist es nicht klar, dass Stromulus Länge ihrer Funktion beeinträchtigt. Bericht erhebliche Unterschiede in Stromulus Länge, wenn sie beobachtet werden, sondern auch die Stromulus Frequenzen aus (wie in 4.2 beschrieben).
      HINWEIS: Stromulus Frequenz kann zwischen verschiedenen Blättern unter den gleichen Wachstumsbedingungen stark variieren. Daher wird, obwohl Stromulus frequenzbestimmendes kann sollten sorgfältig große Probengrößen enthalten ausgelegt werden zeitraubend, Experimente sein. Mit Datensätze aus unserem Labor haben wir festgestellt, dass eine Stichprobengröße von mindestens 16 Pflanzen für jede Behandlung in der Regel stark genug ist, um zu bestimmen, ob es einen statistisch signifikanten Unterschied von mindestens einem 1,5-fache Veränderung der Stromulus Frequenz zwischen zwei Zuständen ist (mit Standard α = 0,05 und β = 0,80).
3. Die statistische Analyse der Ergebnisse.
   1. Zum Vergleich der mirein Stromulus Frequenzen von zwei Behandlungen, verwenden Sie die t - Test Welch (auch als heteroscedastic t - Test oder t - Test unter der Annahme , ungleiche Varianz bekannt).
      HINWEIS: Dieser Test ist nicht so mächtig wie die t - Test herkömmlichen Student, aber Welch t - Test ist vorteilhaft , da sie nicht davon ausgehen , dass die Varianz in Stromulus Häufigkeitsverteilung zwischen den Behandlungen ähnlich ist.
      HINWEIS: Da Stromulus Frequenz ein "Verhältnis", wird seine Stichprobenverteilung vorhergesagt binomischen zu sein, anstatt normal, die Skew statistische Analyse theoretisch könnte, wenn Probengrößen sehr niedrig sind oder wenn Stromulus Frequenz ist sehr gering (nahe 0%) oder sehr hoch (nahezu 100%). Einige Berichte haben verwendet Arkussinus Transformationen vor der statistischen Analyse, die dazu bestimmt ist binomialverteilt zu einer Normalverteilung zu transformieren und damit die Standardanforderungen eines Studenten-t - Test oder ANOVA erfüllen. In der Praxis wird jedoch einrcsine Transformationen haben wenig oder keine Wirkung auf die statistische Analyse, und werden daher nicht empfohlen. Stattdessen wiederholen Experimente Probengröße zu erhöhen, was die statistische Aussagekraft zu erhöhen und reduzieren Fehler bei der Interpretation der Daten.
   2. Was auch immer statistischer Ansatz verwendet wird, sollten Sie sorgfältig zu berichten über die Strategie der Probenahme, Probengröße, statistischen Test, und p - Wert für jedes Experiment.
      Hinweis: Wie bei anderen Bereichen der Biologie, einen p - Wert von weniger als 0,05 betrachtet werden kann "statistisch signifikant", obwohl Forscher sicherlich die genaue p - Wert erhalten berichten. Wenn p etwas über 0,05 ist, kann die Stichprobengröße mit zwei oder drei Versuchen zu erhöhen helfen , zu klären , ob der beobachtete Unterschied ist reproduzierbar und statistisch signifikant.

5. Extrahieren von Intact Chloroplasten Stromulus Dynamics zu visualisieren

HINWEIS: Mehrere Methodeneinem etwas anderes Protokoll zu isolieren Chloroplasten von Blättern verwendet werden, einschließlich in einer aktuellen Studie über Stromulus Bildung in vitro ¹⁵ wurden. Das Protokoll detailliert unten verwendet eine relativ einfache Methode , die nicht biochemisch reinen Chloroplasten Proben nicht fließt, sondern hat stattdessen eine große Menge an intakten, gesunden Chloroplasten ^9,18 isolieren.

1. Bereiten kalten Extraktionspuffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM Sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MgCl ₂ und 1,0 mM MnCl _2. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,9 mit NaOH und HCl, und im Kühlschrank lagern vor dem Gebrauch.
   HINWEIS: Obwohl es nicht notwendig, kalte Puffern und Proben auf Eis zu halten, wenn möglich, einen höheren Anteil an intakten Chloroplasten ergibt.
2. Bereiten Sie Isolationspuffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM Sorbit, 2 mM EDTA, 1,0 mM MnCl _2, 1,0 mM MgCl _2, 10 mM KCl und 1,0 mM NaCl. Der pH-Wert auf 7,6 mit NaOH und HCl und im Kühlschrank lagern vor dem Gebrauch.
3. Wenn die Blätter sind nichteine genetisch kodierte Stromatumoren Fluorophore, bereiten Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) Lösung zum Ausdruck: 50 mM CFDA-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) (2,3 mg CFDA pro 1,0 ml DMSO).
   HINWEIS: Die genaue Konzentration ist nicht kritisch. Halten Sie CFDA Lager im Dunkeln zu allen Zeiten. Speichern von kleinen Aliquots von 50 mM CFDA bei -20 ° C.
4. Zur Isolierung Chloroplasten, entfernen ~ 5-10 g Blätter von verschiedenen Pflanzen und spülen Sie kurz in kaltem Wasser. Ab sofort übertragen zu 50 ml kaltem Extraktionspuffer. Grind Blätter einen Mixer mit mehreren kurzen Impulsen. Man filtriert durch zwei oder drei Schichten Seihtuch Blattreste zu entfernen, unterteilen die extrahierte Chloroplasten in zwei 50 ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren für 1 min bei 750 x g.
5. Überstand verwerfen und resuspendieren die grünen Chloroplasten in 10 ml Isolationspuffer. Zentrifuge erneut für 1 min bei 750 xg, Überstand verwerfen und Resuspension Chloroplasten in Isolationspuffer Endvolumen auf 5 ml zu bringen.
6. Transfer 201; l der Chloroplasten zu einer Folie, Deckel mit einem Deckglas und beginnen Mikroskopie.
   HINWEIS: Chloroplasten aus transgenen Pflanzen plastidenspezifische gezielte fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, sind nun bereit für die Visualisierung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie.
7. Stain Chloroplasten von Pflanzen, die nicht plastidenspezifische gezielte fluoreszierende Proteine ​​exprimieren stromules zu visualisieren.
   1. In 5 ul 50 mM CFDA Lager zu den 5 ml in Isolationspuffer-Chloroplasten suspendiert. Bringen Sie die Endkonzentration auf 50 & mgr; M.
   2. Lassen Sie Chloroplasten für 5 min inkubiert und dann übertragen Sie eine kleine Teilmenge (~ 50 & mgr; l) zu einer Folie, Deckel mit einem Deckglas und beginnen Mikroskopie.
   3. Verwenden Sie ein FITC oder GFP-Filtersatz. Verwenden Sie ein 20X Ziel vieler Chloroplasten gleichzeitig sichtbar zu machen, oder ein höheres Ziel, einen einzelnen isolierten Chloroplasten zu visualisieren.
      HINWEIS: CFDA innerhalb des Stroma von intakten Chloroplasten fluoresziert.
   4. Wenn es eine starke Hintergrundfluoreszenz, waschen Sie die chloroplasts wieder in 10 ml Isolationspuffer nach der 5 min Inkubation mit CFDA, Zentrifuge für 1 min bei 750 · g, Überstand verwerfen und Resuspension in 5 ml Isolationspuffer.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde verwendet , Stromulus Frequenz am Tag sichtbar zu machen und in der Nacht in den Kotyledonen der jungen N. benthamiana Sämlinge. Scheiben von einem z- Stapel wurden in einem einzigen Bild (Abbildung 1A) verschmolzen. Zur visuellen Zwecken wurde das Bild dann entsättigt und invertiert , so daß Stroma erscheint schwarz (1B). Die Chloroplasten wurden beschriftet entweder als keine stromules mit (grüner Stern) ode...

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Diskussion

Wenn stromules untersuchen, drei wichtige Faktoren müssen in allen in Betracht gezogen werden: (i) Manipulation des Pflanzengewebes muss auf ein absolutes Minimum beschränkt werden, (ii) das experimentelle System muss konsistent gehalten werden, und (iii) Probenahmestrategien sorgfältig geplant werden müssen, um sicherzustellen, robust, sind reproduzierbare Daten analysiert.

Stromules sind bemerkenswert dynamisch: sie, bevor ein Beobachter die Augen unter dem Mikroskop schnell ein- und a...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software for analyzing biological images