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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Zusammenfassung

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten haben die Imaging-Technologien die Art und Weise revolutioniert, die Ärzte diagnostizieren und Überwachung von Krankheiten. Diese bildgebenden Verfahren, wurden jedoch weitgehend auf Ganzkörperbildgebungssysteme, wie Positronenemissionstomographie (PET), Single-Photon-Emissions-Computertomographie (SPECT), Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRI). Besondere Aufmerksamkeit wurde auf Krebs bezahlt und technologischen Durchbrüche haben Bildgebung stark die Art und Weise verbessert, dass diese Krankheit diagnostiziert und behandelt wird. Trotz dieser Fortschritte gibt es einen Ort, an dem diese Imaging-Technologien einfach nicht passen: der OP. Während Ganzkörperbildgebungstechniken in der chirurgischen Planung helfen können, fehlt ihnen typischerweise räumliche Auflösungen hoch genug Ärzte in Echtzeit , um festzustellen , ob alle Tumorgewebe entfernt wurde oder Gewebe Resttumor bleibt bei den operativen Margen 1 versteckt. Stellt sicher, dass keine infiltrativenTumorränder hinter ist links eine der wichtigsten operativen Ziele und Chirurgen müssen einen Drahtseilakt zwischen strengen und vorsichtigen Gewebsresektion gehen. Wenn zu viel entfernt wird, sind unerwünschte Nebenwirkungen für den Patienten verstärkt; wenn zu wenig entfernt wird, werden die Rezidivrate 2 erhöht, 3. Daher ist es entscheidend, eine genaue Tumorränder zu beschreiben, und wir glauben, dass chemolumineszierende intraoperative Bildgebung kann helfen, die Genauigkeit der Identifikation von Tumorgrenzen zu verbessern, indem Chirurgen sichtbar zu machen bösartigem Gewebe zu helfen, die sonst unentdeckt mit etablierten Techniken bleiben könnte.

Es gibt viele Imaging-Technologien derzeit für eine mögliche Verwendung als intraoperativen Bildgebungssysteme untersucht. Dazu gehören β- und γ-Strahlung emittierenden Sonden 4, optische Fluoreszenz 5, Raman - Spektroskopie 6 >, 7 und Cherenkov Lumineszenz 8, 9. Bis heute jedoch keine von diesen als klinische Standardtools etabliert geworden. Optische Fluoreszenz-Bildgebung hat sich bisher die vielversprechendsten dieser Techniken zu sein und ist deshalb die erforscht. Während es bereits ein wertvolles Werkzeug für viele Anwendungen gezeigt worden ist, ist es nicht ohne Einschränkungen. Tatsächlich ist ihr Hauptnachteil der Hintergrundfluoreszenz von Natur aus autofluoreszenten biologischem Gewebe erzeugt. Dieser Hintergrund autofluoreszierenden Signal ist ein Produkt der Anregung von dem umgebenden Gewebe, zusätzlich zu dem Fluorophor, von der externen Lichtquelle zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals erforderlich ist. Aus praktischer Sicht kann diese Autofluoreszenz führen möglicherweise zu niedrigen Signal-zu-Rausch-Verhältnisse, die die Nützlichkeit dieser Technologie im Operationsraum begrenzen.

Der DirektorVorteil der Chemilumineszenz-Bildgebung über Fluoreszenz-Bildgebung ist, dass kein Anregungslicht notwendig ist. Als Ergebnis gibt es keine Hintergrundautofluoreszenz. In Chemilumineszenz Bebilderung wird die Anregungsenergie chemisch statt erzeugt. Dieses Verfahren erzeugt keine unbeabsichtigte Signaluntergrund und somit zu höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis führen kann. Dies könnte dazu führen letztlich in die genauere und präzise Erkennung von operativen Margen. Etwas überraschend hat sich der Nutzen dieses Ansatzes als intraoperativen Bildgebungstechnik unerforscht 10 geblieben. Tatsächlich ist das nächste Beispiel dieser Technik die Oxidation von Luminol durch Myeloperoxidase in Mäusen , 11, 12, 13. Chemilumineszenter biomedizinischen Bildgebung ist daher ein ziemlich unerforschtes Gebiet der Forschung, die folgende Vorteile bieten könnte: (1) minimale Autofluoreszenz, was zu einem niedrigen Hintergrundsignal mit hallogher Signal-zu-Rausch-Verhältnisse; (2) abstimmbaren Wellenlängen des chemolumineszenten Emissionen im Bereich vom sichtbaren bis zum nahen Infrarot; und (3) funktionalisierbarer chemolumineszenten Komplexe , die, wenn sie mit Linker - Technologien kombiniert und Biomoleküle gezielt , die bereits existieren, 14 Zugriff auf ganze Bibliotheken von gezielten molekularen Bildgebung Sonden liefern.

Diese Proof-of-Principle-Studie zeigt die potentielle Nützlichkeit von Chemilumineszenz-Bildgebung in der biomedizinischen Einstellung eines Ruthenium-basierte Bildgebungsmittel verwendet wird. Die chemolumineszenten Eigenschaften dieser Verbindung sind gut untersucht, mit Untersuchungen aus der Zeit der Mitte der 1960er Jahre 15. Bei chemischer Aktivierung erzeugt das Mittel Licht bei etwa 600 nm 16, die für medizinische Abbildungszwecke gut geeignet ist. Die Aktivierungsenergie wird durch eine Redox - Reaktion zur Verfügung gestellt , die in einen angeregten Zustand-was dazu führt , eine Lebensdauer von 650 ns in Wasser 17 -foll hatdurch die Erzeugung von Photonen bei Entspannung der angeregten Zustand zu verdanken. Durch die Verwendung eines speziell gestalteten Fern Vernebler, konnten wir die Verbindung , die sowohl ex vivo und in vivo zu detektieren. Die Ergebnisse der anfänglichen Experimente sind sehr vielversprechend, was auf eine weitere Untersuchung dieser Technologie.

Protokoll

Ethik - Erklärung: Alle in vivo Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) ausgeführt beschrieben.

1. Aufbau eines Vernebelungsgerät

  1. Bringen Holzteil A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) aufrecht im Zentrum von Teil B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) mit zwei Schrauben (4 x 25 mm 2). Befestigen Holzteil C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) in der Mitte des Teils A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) mit einer Schraube, so dass ein Teil C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) noch bewegt werden. Siehe Abbildung 1.
  2. Bohren Sie zwei Löcher durch die untere Spitze der Sprühflasche Auslöser einer Kunststoff 3 Unzen Mini Sprayer (D), und drücken Sie eine Edelstahlstange (10 cm von 1/16 "Stahl) (E) durch zwei Schleifen zu bilden, eine auf entweder Seite des Auslösers.
  3. Wickeln Sie den unteren Teil der Sprühflasche mit Klebeband (F) die Kabelbinder ein Abrutschen zu verhindern. Bringen Sie die Sprühflasche Holzteil C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) unter Verwendung der beiden Kunststoff - Kabelbinder (28 cm) (G).
  4. Schneiden Sie das 011-Servomotor (I) aus, und schließen Sie sie mit den losen Kabel der Servosteuerung (H). Befestigen Sie dann den Servomotor an die Spitze der Holzteil A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) unter Verwendung von Klebeband.
  5. Bringen Sie einen Bleistift (J) an den Servomotorhebel mit der Büroklammer (K). Dicht verbinden mit Klebeband die äußersten Teile des Stiftes an den Stahlstab Schleifen Kunststoff abgedeckt Twist Drähte (L) und befestigen Sie die Enden auf dem Bleistift.
  6. Schneiden Sie die Servomotor-Steuereinheit des Magnetkabelstecker (M) und bringen Sie ihn an die Lautsprecherkabel (N) ab. Dann kleben Sie das Servomotor - Steuereinheit zu Holzteil B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Schneiden Sie ein w1 Kabel mit Magnet Anschlüsse in zwei Hälften und heften sich an das lose Ende des Kupfer s ein Teilpeaker Kabel (1 m). Schließen Sie den (magnetisch) i2 Kippschalter und p1 Leistung der zur Verfügung stehenden w1 Kabel und einer 9V-Batterie.

2. Empfindlichkeit Bestimmung der Methode

  1. In einem 1,5 - Mikrozentrifugenröhrchen ml, werden die Lösungen von [Ru (bpy) 3] Cl 2 bei der Umkehrosmose Wasser (100 & mgr; l) in Mengen von 260 & mgr; g (347 nmol), 52 & mgr; g (69 nmol), 26 & mgr; g (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 & mgr; g (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), und 3 ng (3,5 pmol).
  2. Mischungs 100 ul jeder [Ru (bpy) 3] Cl 2 Lösung mit 100 ul einer wässrigen Lösung von Ammonium - Cernitrat ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) in Wasser (25 mM) auf einem Mikroskop - Objektträger.
  3. Stellen Sie den Erwerb in der Biolumineszenz Leser, indem Sie die Imaging - Software zu initialisieren.
    1. Melden Sie sich in das Benutzerprofil in und suchen die acquisition Bedienfeld. Klicken Sie auf "Initialisieren" und warten, bis das Gerät bereit ist.
    2. Suchen Sie nach "Imaging-Modus" und stellen Sie sicher, "Luminescent" und "Photograph" werden überprüft und, dass "Fluorescent" nicht markiert ist.
    3. Ändern "Belichtungszeit" Einstellung für "Luminescent" bis 20 s. Legen Sie die übrigen Einstellungen für "Luminescent" wie folgt: "Binning": Medium; "F / Stop": 1; und "Emission Filter": Open.
      HINWEIS: Die Belichtungszeiten benötigen nach der Instrumentierung und experimentellen Einstellung angepasst werden, verwendet werden, falls abweichend von der dargestellten Einrichtung.
    4. Für "Photograph", verwenden Sie die folgenden Einstellungen: "Belichtungszeit": Auto; "Binning": Medium; und "F / Stop": 8. Stellen Sie den "Betreff Höhe" gemäß Abbildung target.Look für das "Field of View" Dropdown-Menü. Die Grundeinstellung ist "C" Wechseln Sie zu "B" (14 cm Abstand zwischen der cAmera und Probentisch).
  4. Stellen Sie den Vernebler, indem Sie einen Objektträger auf einem Blatt aus schwarzem Tonpapier auf dem Boden der Imaging - Kammer platziert es aus dem Oxidationsmittel zu schützen. Mischen Sie einen 100 μLdroplet von [Ru (bpy) 3] Cl 2 -Lösung mit 100 & mgr; l einer wässrigen Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Beobachten Sie das grüne Feld Fadenkreuz.
    1. Legen Sie die abzubildenden Objekt auf dem schwarzen Tonpapier, so dass der Bereich von Interesse ist in der Mitte des grünen Fadenkreuz-Licht-Box angezeigt auf der Probenbühne. Bereiten Sie den Vernebler durch die Kunststoff-Sprühflasche aus dem Holzbock lösen. Füllen Sie eine Lösung von Triethylamin (1: 3 in Wasser / Ethanol) in seine Kunststoffbehälter und bringen es auf den Holzbock.
    2. Setzen Sie den Vernebler in der Biolumineszenz Leser und stellen Sie sicher, dass das Netzkabel aus dem Vernebler Kabel ist nicht angeschlossen. Stellen Sie sicher, dass der Netzschaltereingeschaltet ist, ist der Kippschalter ausgeschaltet und die rote LED leuchtet Setzen Sie den Vernebler, so dass der Spritzstrom wird auf den Bereich von Interesse auf dem Imaging-Objekt gerichtet, während die Sicht nach Behinderung von der Kamera auf das Motiv Bildgebung zu minimieren durch die Sprühdüse Kopf.
    3. Legen Sie kleine, schwarze Stücke Tonpapier über eventuelle Hot - Spots (zB weiße Flecken auf mikroskopische Dias oder Injektionsstellen) , um sie vor Spritzwasser zu schützen. Legen Sie mindestens 40 cm des Zerstäubers Remote-Kabel innerhalb der Imaging-Kammer, so dass es nicht mit dem abzubildenden Objekt, dem Vernebler oder die magnetische Türverriegelung nicht stört. Schließen Sie das Abbildungssystem Tür.
      HINWEIS: Das Fadenkreuz wird Größe ändern auf der Grundlage der "Field of View" Einstellung in "Bild Wohnen"; stellen Sie sicher, dass diese auf "B" gesetzt.
  5. ein Bild erwerben, indem Sie die Bildsequenz zu initiieren. Klicken Sie auf "Erwerben" im "Acquisition Systemsteuerung". Auf der ersten Bildgebungs sequrenz, ermöglichen automatisches Speichern, wenn ein Datenordner gewünscht (empfohlen) und wählen. Ignorieren Sie die "Edit Imaging Labels" Dialog bis zum Ende der Sequenz.
    HINWEIS: Die Steuerungssoftware zeigt das Gerät die Aktionen Schritt-für-Schritt in Echtzeit. Nach der Messung der Vorbereitung und der Probentisch in die rechte Position bewegt, öffnet er den Kameraverschluß und zählt die Messzeit. Die Verschlussöffnung kann auch durch ein Klickgeräusch von der Maschine erzeugten hören.
  6. Da der Verschluss öffnet, Spray drei Ausbrüche von einer Lösung von Triethylamin (1: 3 in Wasser / Ethanol, 0,24 ± 0,04 ml pro Burst-Spray) durch den Kippschalter dreimal Schalt Chemilumineszenz zu erzeugen.
    HINWEIS: Die Probenbühne während der Messung bewegt. Lassen Sie genug (mindestens 40 cm) Kabel im Inneren des Gerätes, dies zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung durch den Vernebler versprüht werden kann durch das Steigrohr angestrebt werden, und dass es keine Luftblasen in das Rohr. Haben mehrere Ersatz batteries für den Zerstäuber bereit, falls erforderlich.

3. In - vivo - Bildgebung nach systemischer intravenöser Injektion

  1. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Herstellung von 100 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Lösung zwischen 8 und 33 nmol [Ru (bpy) 3] Cl 2 enthält. Bereiten einer wäßrigen Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in Wasser (25 mM) zur gleichen Zeit.
  2. Intravenös injizieren 100 ul [Ru (bpy) 3] Cl 2 in die Schwanzvene von gesunden Mäusen (n = 5).
  3. Euthanize die Mäuse 10 min nach der Injektion über CO 2 Erstickung.
    1. Entfernen Sie die Haut mit einem Y-Schnitt aus dem Rumpf, entfernen Sie dann den Rippenbogen in einer U-Form das Herz und die Lungen zu belichten. Perfundieren die Mäuse durch einen Auslass in dem rechten Vorhof Schneiden und Injizieren 20 ml PBS durch eine 24 Gauge - Nadel in den linken Ventrikel 18. Vorsichtig durch den Bauch geschnittenHaut und der Niere und der Leber aus. Schneiden in Längsrichtung durch die Organe einen sichtbaren Schnitt zu erstellen.
  4. Stellen Sie den Erwerb wie in Schritten von 2,3 bis 2,6, mit den folgenden Änderungen beschrieben.
    1. Nach gründlichem den Vernebler Kunststoffbehälter Waschen, füllen Sie es mit einer Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in Wasser (25 mM) anstelle von Triethylamin.
      HINWEIS: Es ist wichtig , um gründlich die Verneblerdüse nach jedem Gebrauch gründlich, da kristallisieren (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 kann die Sprühdüse nach mehreren Verwendungen zerstören.
  5. Verwenden Sie die ganze Tier oder Organproben für die Bildgebung.
    1. Für ganze Bauch Bildgebung, positionieren Sie die Maus Karkasse mit dem offenen Bauch die Kamera und den Kopf nach auf der Rückseite des Geräts zeigt. Das Organ Center abgebildet (zB Leber oder Niere) im grünen Licht - Box Fadenkreuz werden.
    2. Foder einzelne Organ Bildgebung und Quantifizierung, entfernen Sie die Maus aus dem Abbildungsinstrument und stecken Sie es nach unten. Ausgehend von dem bereits geöffneten Körperhöhle, auszuschneiden die inneren Organe (zB Niere, Leber, Lunge, Muskel, Milz, Gehirn und Herz). Schnitt durch das Hinterbein Haut Muskelgewebe auszuschneiden. Öffnen Sie vorsichtig den Schädel mit einem Skalpell das Gehirn auszuschneiden.
      1. Wenn das interessierende Organ Leber, Niere oder Milz, schneiden alle Organe in der Hälfte der Länge nach, legen jedes Organ auf einer Petrischale oder ein Stück schwarzes Tonpapier.
    3. Befolgen Sie die Anweisungen in den Schritten 2,3-2,6 um die relative Emission des chemolumineszenten Tracer für die einzelnen Organe herzustellen.

4. In - vivo - Imaging von Lymphknoten

  1. Herstellung von 10 & mgr; l einer PBS - Lösung , enthaltend 80 nMol [Ru (bpy) 3] Cl 2. Bereiten einer wäßrigen Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in water (25 mM) zur gleichen Zeit.
  2. Injizieren Sie 10 ul der Lösung subdermally in die Hinterpfote von gesunden Mäusen (n = 5). Als Negativkontrolle, injizieren die kontralaterale Pfote mit 10 & mgr; l reinem PBS. Opfern , um die Mäuse über CO 2 Ersticken 15 Minuten nach der Injektion. Entfernen Sie die Haut an beiden Hinterbeinen, die Lymphe Kanäle zu belichten bis in die Kniekehlen-Lymphknoten.
  3. Stellen Sie den Erwerb wie in Schritt 3.4 beschrieben.
  4. Entfernen Sie die poplitealen Lymphknoten von beiden Hinterbeinen, schneiden sie in zwei Hälften, und sprühen sie mit Oxidationsmittel auf einer Petrischale, wie zuvor beschrieben (Schritt 3.5.3), zum Zwecke der Quantifizierung.

Ergebnisse

Der Vernebler in Protokoll Abschnitt 1 kann aus leicht erhältlichen Materialien zu geringen Kosten konstruiert werden. Es ist beabsichtigt , der Reduktions- / Oxidationsmittel in einem Biolumineszenz - Lesegerät (1) ein Einsatz für Fern ausgelöst werden Aufsprühen. Unser Design ermöglicht den sicheren Betrieb des Zerstäubers innerhalb des Biolumineszenz-Lesegerät bei einem 14 cm Abstand von der Linse. Kein Beschlagen oder Verschwimmen der Linse wurde während der...

Diskussion

Hier haben wir eine Technik vorgestellt, die optisch der Lage ist, durch einen chemolumineszierenden Reporter erstellt Gewebe über die Emission von Photonen abzugrenzen. Im Gegensatz zu anderen, etabliert, Technologien 4, 5, 6, 7, 8, 9, dieses chemilumineszierende Reportersystem verwendet eine Abbildungssonde , die nicht-ra...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm)Screwfix79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayerBed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel)Metals Depot Int. Inc.2192
Pencil Classic HBPapermate58592
Paper clipOffice Depot221720
speaker cableRCA Inc.AH1650SN
Energizer 9V alkaline batteryEnergizer Holdings Inc.EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6VHitech RCD USA Inc.32082S
NameCompanyCatalog NumberComments
28 cm plastic cable tiesGeneral Electric Inc.50725
Duct tape3M Inc.3939
littleBits w1 wirelittleBits Inc.w1 wire
littleBits p1 powerlittleBits Inc.p1 power
littleBits i2 toggle switchlittleBits Inc.i2 toggle switch
littleBits 011 servolittleBits Inc.011 servo
20 cm plastic covered wire twist tiesFour Star Plastics71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrateSigma-Aldrich Inc.224758
Ammonium cerium(IV) nitrateSigma-Aldrich Inc.22249
IsofluoraneBaxter Healthcare1001936060
PBSSigma-AldrichPBS1
EthanolSigma-Aldrich2854
TriethylamineSigma-Aldrich Inc.T0886
WaterWater was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) miceJackson Laboratories1929age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at Jackson Laboratories2019age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence readerCaliper Live Science
Live Image 4.2 softwarePerkin-Elmer128165
Microscope slidesThermoScientific4951PLUS4

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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