Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Zusammenfassung

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Zusammenfassung

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) stellt Details der zellulären Organisation und Ultrastruktur. Jedoch TEM-Analyse von seltenen Zellpopulationen, insbesondere Zellen in Suspension, wie beispielsweise hämatopoetische Stammzellen (HSCs), begrenzt bleibt aufgrund des Erfordernisses einer hohen Zellzahl während der Probenvorbereitung. Es gibt ein paar Cytospin oder einschichtigen Ansätze für die TEM-Analyse von seltenen Proben, aber diese Ansätze nicht signifikante quantitative Daten von der begrenzten Anzahl von Zellen zu erhalten. Hier ist eine alternative und neuartige Ansatz für die Probenvorbereitung in TEM-Untersuchungen wird für seltene Zellpopulationen beschrieben, die quantitative Analyse ermöglicht.

Eine relativ niedrige Anzahl von Zellen, dh 10.000 HSCs wurde für die TEM - Analyse im Vergleich zu den Millionen von Zellen typischerweise für TEM - Untersuchungen erfolgreich eingesetzt. Insbesondere wurde Evans-Blau-Färbung nach paraformaldehyd Glutaraldehyd (PFA-GA) Fixierung ausgeführt, um die winzige Zelle pel zu visualisierenlassen, die in Agarose erleichtert das Einbetten. Cluster von zahlreichen Zellen wurden in ultradünnen Abschnitten beobachtet. Die Zellen hatten eine gut erhaltene Morphologie und die ultra-strukturellen Details der Golgi-Komplex und mehrere Mitochondrien waren sichtbar. Diese effiziente, einfache und reproduzierbare Protokoll ermöglicht die Probenvorbereitung von einer niedrigen Zellzahl und kann für die qualitative und quantitative TEM-Analyse auf seltenen Zellpopulationen aus begrenzten biologischen Proben verwendet werden.

Einleitung

Ultra-strukturellen und Unter Organell Details der Zellen wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) -Studien aus Geweben oder Zellpellets ^1,2 hauptsächlich offenbart. Feste Gewebeteile können leicht für die Elektronenmikroskopie-Studien genutzt werden. Allerdings analysiert TEM ^1,3 auf Zellen in Suspension bleiben herausfordernd und erfordern hohe Zellzahlen, dh Millionen von Zellen. Wegen dieses ultra-Strukturanalysen von seltenen Zellpopulationen in Suspension, beispielsweise hämatopoetische Stammzellen (HSCs), sind nicht leicht zu beurteilen. Mehrere Versuche für die TEM-Analyse von knapp Proben Cytospin oder einschichtigen Ansätze scheitern erhebliche quantitative Daten aus der begrenzten Anzahl von Zellen zu erhalten. Somit begrenzt das Erfordernis einer hohen Zellzahl die Verwendung dieses leistungsstarken Werkzeug, um die subzelluläre ultrastrukturelle Details von seltenen Zellpopulationen zu verstehen.

Eine Haupteinschränkung für die TEM-Untersuchungen mit einer begrenzten Anzahl von Zells in Suspension ist die Lokalisierung der Zellen für die Verarbeitung und damit TEM-Untersuchungen von begrenzten Zellen mit besonders kleinen Abmessungen bleiben schwierig. Mehrere alternative Ansätze gewählt wurden, um diese Beschränkung zu begegnen: die BSA / Bisacrylamid (BSA-BA) vermittelte Polymerisation von Zellsuspension, die Färbung der Zellen mit einem Farbstoff, um sie sichtbar auf einem dünnen Filmträger einschließlich Deckgläser, und TEM - Analysen von Cytospin Vorbereitungen ^4-6. Es wurde jedoch sehr begrenzten Erfolg erzielt, da nur sehr wenige Zellen in den Abschnitten nach der ultra-Schnitte gefunden wurden. Die zentrale Herausforderung spärliche Zellen zu identifizieren, bestehen bleibt, da die Zellschicht meist unsichtbar in dem erstarrten Gel bleibt für das Schneiden. Ferner können Cytospin Herstellung von Zellen, die zelluläre Organisation aufgrund Zellausbreitung und die Zerbrechlichkeit der Zellstruktur zu verändern. Daher rechtfertigen diese inhärenten Nachteile einen neuartigen Ansatz TEM-Untersuchungen von seltenen Zellpopulationen mit mehr ausführenKonsistenz. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine neue und alternative Probenvorbereitung für TEM - Untersuchungen von seltenen Zellpopulationen ⁷ beschrieben.

Hier berichten wir über eine effiziente Probenvorbereitung Protokoll zur Durchführung TEM von knapp biologischen Proben mit konsistenten qualitative und quantitative Ergebnisse. Evans - Blau - Färbung wurde nach der Fixierung durchgeführt , eine winzige Zellpellet aus geringen Anzahl Zellen, dh 10.000 Knochenmark hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen zu lokalisieren , die ansonsten unsichtbar blieben würde, und das Pellet wurde in Agarose vor der Dehydratisierung und Harzeinbettungsverfahren eingebettet. Diese Methode Clustern Zellen zusammen und ermöglicht die effiziente Analyse der Ultrastruktur und subzellulären Organisation von hämatopoetischen Stammzellen (identifiziert als Lin ^- Sca-1 ⁺ c-Kit ⁺ Flt3 ^- CD34 ^-; HSC), einer seltenen 0,2 bis 0,5% Zellpopulation im Knochenmark. Diese experimentelle Prokoll kann nützlich sein, ultra-Strukturuntersuchungen durchführen und quantitative Ergebnisse auf viele seltene, aber sehr wichtige Populationen erhalten.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von der institutionellen Tierausschuss am Cincinnati Children Research Foundation genehmigt. 4 Monate - Für diese Studie wurden hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark von C57Bl / 6 Inzuchtmäusen im Alter von 2 isoliert. CD34 ^{- -} Gating - Strategie Zelle mittels FACS nach der Färbung von BM mit unterschiedlichen Oberflächenträgern einschließlich Lineage Sortierung, c-Kit, Sca-1, Flt3 und CD34 wurde für die Reinigung von HSC auf Lin- Sca-1 ⁺ c-Kit ⁺ Flt3 Basis verwendet als Standardprotokoll beschrieben vor ^8.

ACHTUNG: Mehrere hochgiftige Chemikalien werden bei diesem Verfahren verwendet. Diese sind giftig beim Einatmen und Hautkontakt möglich. Bitte tragen Sie Handschuhe und Schutzkleidung. Die Arbeit in Dunstabzug, während mit diesen Chemikalien arbeiten.

1. Zellen, Fixierung, Färbung und Pre-Einbettung

1. Sort 10.000 hämatopoetische Stammzellen (mit Lin ^- Sca-1 ^{+ c-Kit + Flt3 - CD34 - Gating - Strategie; LT-HSC Population) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 600 ul Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 10% fötalem Rinderserum FACS verwendet.}
2. Spin down sortierten HSZ bei 1.000 × g für 10 min in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen eine Zentrifuge mit ausklappbarem Eimer verwenden. Entfernen Sie Medium durch leichtes Ansaugen und lassen 200 & mgr; l Medium in den Rohren bei jedem Schritt. In diesem Stadium bleibt das Zellpellet in dem Röhrchen sichtbar.
3. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 0,2 ml 2x Fixierungslösung bei Raumtemperatur (RT) für 1 Stunde ^1,9.
   1. Machen Sie die Fixierungslösung vor dem Gebrauch frisch. Bei 1x wird die Lösung von 3% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer besteht.
4. Zentrifuge die Zellen bei 1.000 xg für 10 min bei 30 ° C eine Zentrifuge mit ausklappbaren buckets verwenden.
5. Wasche die Zellen mit 600 ul 0,1 M Cacodylatpufferunter Verwendung von Zentrifugation und 200 & mgr; l Puffer in der Röhre nach dem Zentrifugieren verlassen.
6. Beflecken die fixierten Zellen durch Zugabe von 200 ul 2 mg / ml Lösung von Evans Blue in Cacodylatpuffer und Inkubation für 20 min bei RT. Die Zellen werden blau gefärbt.
7. Waschen Zellen 3-mal mit 600 ul 0,1 M Cacodylatpuffer mittels Zentrifugation und sind 200 & mgr; l Puffer in dem Rohr jedesmal.
8. Wieder die Zellen in 200 & mgr; l Puffer und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 0,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 1000 × g für 10 min eine Tischzentrifuge verwenden. Entfernen Puffer sanft, ohne die nun sichtbare winzige Zellpellet zu stören, und lassen Sie 50 ul Puffer in die Röhre.
9. Mit 200 mg niedrigschmelzenden Agarose zu 5 ml von 0,1 M Cacodylatpuffer in der 15-ml-Röhrchen für eine 4% Agarose-Lösung. Schmelzen Sie die Agarose durch die Übertragung der Röhre zu kochendem Wasser in einem 100 ml-Glasflasche und halten lauwarm bis zur Verwendung.
10. Nach Zugabe von 200 ul 4% niedrig schmelzender Agarose in 0,1 M cacodyla gelöstTE-Puffer zu der Zellsuspension in 0,5 ml-Röhrchen und sofort bei 1.000 xg für 10 min bei 30 ° C zentrifugieren einer Tischzentrifuge verwendet wird.
11. Nach der Bestätigung, dass an Boden der 0,5 ml-Röhrchen pelletierten Zellen in das halbfeste Agarose nach der Zentrifugation übertragen sofort das Rohr auf 4 ° C oder Eis für 20 min, um die Agarose zu verfestigen. Dieser Schritt ist sehr kritisch, da eine kleine sichtbare Zellpellet in diesem Schritt resultiert in einem guten Cluster von Zellen, die unter dem Elektronenmikroskop.
12. Sorgfältig übertragen die verfestigte Agarose das Zellpellet aus dem Röhrchen auf einen 35 mm Kunststoff - Petrischale mit Puffer unter Verwendung einer 27 G - Nadel ^3,10 enthält.
13. Schneiden Sie die erstarrte Agarose enthält das Zellpellet in einem Stück von etwa 1 bis 2 mm mit einem Skalpell. Übertragen Sie die Agarose-Stück des Zellpellets in ein neues 1,5-ml-Röhrchen enthält.
14. Waschen Sie 2 - 3 mal 600 ul 0,1 M Cacodylatpuffer Verwendung durch Hinzufügen und Entfernen von Puffer Pipette ohne Zentrifugation. Verwenden Sie diese Agarose-Stück des Zellpellets für den nächsten Schritt enthält. Bei diesem Schritt kann die Probe über Nacht bei 4 ° C gelagert werden, bevor zum nächsten Schritt bewegt wird.

2. Osmification, Dehydration, Embedding

1. Entfernen Sie den Cacodylatpuffer aus dem 1,5-ml-Röhrchen mit dem Zellpellet Agarose enthält, mit einer Pipette. 1,0 ml 1% Osmiumtetroxid (OsO ₄₎ Lösung in einem Abzug, und Inkubation für 1 Stunde bei 4 ° C.
2. Waschen dreimal mit 600 ul 0,1 M Cacodylatpuffer und übertragen Sie die Probe auf eine 20-ml-Glas Szintillationsphiole mit einer Kappe.
3. Verarbeiten Sie die Probe für die Entwässerung, Infiltration und Einbettung in Harz (zB LX-112) mit serieller Veränderungen der folgenden Lösungen in einer 6 - Well - Platte. Bewegen Sie die Zell-Pellet Agarose Stück mit einer Pinzette.
   1. Eintauchen der Probe in 25% Ethanol bei RT für 15 min.
   2. Eintauchen der Probe in 50% Ethanol bei RT für 15 min.
   3. Tauchen Sie die Probe in 75%Ethanol bei RT für 15 min.
   4. Eintauchen der Probe in 95% Ethanol bei RT für 15 min.
   5. Tauchen Sie die Probe in 100% Ethanol bei RT für 15 min, zweimal.
   6. Tauchen Sie die Probe in Ethanol: Harz (3: 1) bei RT für 30 min.
   7. Tauchen Sie die Probe in Ethanol: Harz (1: 1) bei RT für 30 min.
   8. Tauchen Sie die Probe in Ethanol: Harz (1: 3) bei RT für 30 min.
   9. Tauchen Sie die Probe in Reinharz bei RT für 60 min, zweimal.
4. Übertragen Sie die Probe auf den Boden des Pyramidenspitze förmigen Gummiformzange vorsichtig und fügen Sie mehr reines Harz auf der Oberseite der Probe unter Verwendung der Form zu füllen. Inkubieren der Probe bei 60 ° C für 72 Stunden für die Harz Polymerisation.
5. Entfernen Sie die polymerisierte Harz Pyramide aus den Formen durch die Gummiform verdrehen. Eine kleine schwarze Cluster von Zellen sollten in dem polymerisierten Harz Pyramide sichtbar sein, wie zuvor beschrieben ^7. Bringen Sie das polymerisierte Harz Pyramide auf dem Montagezylinder mit Cyanacrylat.

3. Sectioning und Transmissionselektronenmikroskopie

1. Schneiden Sie die Pyramide Block mit einer Rasierklinge und einem Diamantmesser nach den Block auf einem ultra-Mikrotom Montage. Machen Sie einen kurzen, breiten Trapezform mit der Oberseite und der Unterseite des Blocks parallel zueinander und mit gleichmäßig angewinkelt Seiten. Diese Form der Pyramide hilft für Serienschnitt.
2. Ferner schneiden Sie den Block um das Zellpellet mit dem Diamantmesser und die Kunststoff-Teile um das Zellpellet Agarose-Stück zu entfernen.
3. Cut 1 & mgr; m Abschnitte ein ultra-Mikrotom. Verschieben Sie die 1 & mgr; m Abschnitte aus dem Wasser Boot auf einem Glasobjektträger mit der Wimper Werkzeug und eine Metallschlaufe Werkzeug wie zuvor ⁷ berichtet. Transferabschnitte auf Objektträger und Transfer Folien der Heizplatte (37 ° C) zum Trocknen.
4. Fügen Sie einen Tropfen Toluidinblau-Lösung zu den Abschnitten eine Spritze mit 0,22 um-Filter ausgestattet ist und für 3 min inkubiert. Spülen Sie die Folien mit destilliertem Wasser und let die Abschnitte trocknen. Überprüfung mit einem Lichtmikroskop die Position der Zellen zu identifizieren.
5. Schneiden Sie ultra-dünne Schnitte (70-100 nm) mit einem Diamantmesser. Bewegen Sie 2 - 3 Abschnitte auf 200-Maschengitter aus dem Wasser Boot auf eine Glaspetrischale mit einem Wimpern Werkzeug.
6. Übertragen Sie die Glaspetrischale Gitter mit Abschnitten auf einer heißen Platte bei 30 ° C enthält Abschnitte zum Trocknen für 30 min.
7. Stain die Gitter mit Tropfen von 1% Uranylacetat bei RT für 10 min und dann spülen in destilliertem Wasser 6 - 8 mal. Stain mit Reynolds Bleizitrat bei RT für 5 min und spülen Sie in destilliertem Wasser 6 - 8 mal. Übertragung der Glaspetrischale die Gitter auf einer heißen Platte bei 37 ° C enthält Abschnitte zu trocknen.
8. Analysieren die Abschnitte mit einem Elektronenmikroskop bei 80 kV ^7.

Ergebnisse

Eine effiziente und konsistente Protokoll für die Probenvorbereitung TEM-Analyse durchzuführen, von geringen Anzahl von Zellen beschrieben. Post-Fixierung Färbung mit Evans - Blau und die Übertragung von Zellen auf einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen dazu beigetragen , die winzigen Zellpellet ⁷ visualisieren. Osmification mit Osmiumtetroxid in Agarose führte zu einer leichten Nachweis der dunklen Zellpellet während der Entwässerung und Einbettung.

Diskussion

Dieses Verfahren ermöglicht die TEM-Analyse auf niedrigen Zellzahlen, die von Evans-Blau-Färbung mit und Einbetten von Agarose eine winzige Zellpellet während der Entwässerung, Harz Einbetten und Schneiden Prozesse zu lokalisieren. Wichtig ist, behält er Zellcluster zusammen und bewahrt die Zellultrastruktur, die mehrere Zellen für die Quantifizierung der Daten zu prüfen, wünschenswert ist.

In TEM-Untersuchungen wird ein Zellpellet Millionen von Zellen enthalten, oft für eine effizi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	15713	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln	Electron microscopy Sciences	16350	CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.
Cacodyladate buffer	Electron microscopy Sciences	12300	Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.
Evans Blue	Sigma	E-2129
Low melting agarose	Sigma Aldrich	A-5030
Osmium tetraoxide	Electron microscopy Sciences	19130	1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.
LX-112 Embedding Kits (LADD®)
DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)	LADD	21340	Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30
NMA (Nadic methyl anhydride)	LADD	21350
Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)	LADD	21310	CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)	LADD	21370
Reynolds lead citrate (EM Stain II)	Leica		CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Uranyl acetate (EM Stain I)	Leica	8072820	CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	ATCC	30-2005	composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
Pyramid tip mold	Ted Pella	10585
mounting cylinders	Ted Pella	10580
Ultra-microtome	(Leica EM UC7)
200 mesh grids (nikil)	Electron microscopy Sciences	G-200 Ni
Electron Microscope	Hitachi model H-7650
Image capture engine software	AMT-600
35 mm plastic Petri dishes	Fisher scientific
Quick Bond Super glue Cyanoacrylate	Electron microscopy Sciences	72588
Razor blades
Glass scintillation vials	Fisher scientific	03-337-14
Glass slides
Eyelash tool
Metal Loop tool