Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zusammenfassung

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zusammenfassung

Zika-Virus (ZIKV) ist eine aufstrebende Erreger, die fetale Entwicklungsstörungen wie Mikrozephalie verbunden ist, Augenfehler und Wachstumsstörungen. ZIKV ist ein RNA - Virus der Familie Flaviviridae. ZIKV wird hauptsächlich durch Stechmücken übertragen, kann aber auch als auch sexuellen Kontakt durch mütterliche fetalen vertikale Übertragung verteilt werden. Bis heute gibt es keine zuverlässige Behandlung oder Impfung Optionen zur Verfügung, die mit dem Virus infiziert zu schützen. Die Entwicklung einer reproduzierbaren, effektive Zika Virus infektiös Zellkultursystem ist von entscheidender Bedeutung für die molekularen Mechanismen der ZIKV Replikation sowie Drogen-und Impfstoff-Entwicklung zu studieren. In dieser Hinsicht ist ein Protokoll einer Säugerzelle basierenden in vitro Zika Viruskultursystem für die virale Produktion und Wachstumsanalyse beschreibt , wird hier berichtet. Einzelheiten zur Bildung von Plaques durch Zika Virus auf einer Zellmonoschicht und Plaque-Assay für Virustiter Messung dargestellt. Viralen Genomreplikation kineticsund doppelsträngigen RNA-Genom replicatory Zwischenprodukte werden bestimmt. Diese Kultur Plattform zum Screenen gegen eine Bibliothek von einer kleinen Gruppe von Cytokinen, was zu der Identifizierung von Interferon-α (IFN-α), IFN-β und IFN-γ als potente Inhibitoren von Zika virales Wachstum genutzt wurde. Zusammengefasst ein in vitro - Infektions Zika Viruskultursystem und verschiedene virologische Tests sind in dieser Studie gezeigt, die das Potenzial hat, die Forschungsgemeinschaft bei der Aufklärung die Mechanismen der viralen Pathogenese und die Entwicklung der viralen Virulenz stark profitieren. Antivirale IFN-alpha kann weiter als Prophylaktikum, Post-Expositions-Prophylaxe zu bewerten und Behandlungsoption für Zika Virusinfektionen in Hochrisikogruppen, einschließlich der infizierten schwangeren Frauen.

Einleitung

Zika - Virus (ZIKV) ist eine wichtige menschliche Krankheitserreger im Zusammenhang mit Mikrozephalie und schlechte Schwangerschaft ^1,4 Ergebnisse. ZIKV gehört zur Gruppe von medizinisch relevanten Flaviviren, die neurologische Defekte wie das Dengue-Fieber, West-Nil, und St. Louis-Enzephalitis-Viren verursachen können. Der Hauptmodus der viralen Übertragung durch den Moskito - Vektor Aedes aegypti, und zusätzlich hat die sexuelle Übertragung auch ^5,6 berichtet. ZIKV hat ein großes globales Gesundheitsproblem geworden aufgrund der wachsenden geographischen Verteilung des Moskito-Vektor und seine starke Korrelation mit Geburtsfehler. ZIKV wurde isoliert zuerst ^7,8 im Jahr 1947 von einem Sentinel - Rhesusaffen im Zika Wald, Uganda und der erste Mensch Fall wurde im Jahr 1952 berichtet. Personen, die mit ZIKV mit milden Symptomen vorhanden infiziert werden, wie Fieber, Hautausschlag, Kopfschmerzen, Konjunktivitis und Muskel / Gelenkschmerzen. Infizierte schwangere Frauen können ZIKV auf den sich entwickelnden Fötus ¹ übertragen. ZIKV - Infektion hat sich auch Guillain-Barre - Syndrom in Verbindung gebracht worden, einer peripheren Nerven Auto-Immun - Erkrankung Demyelinisierung ^9.

Die Zika virale Genom besteht aus einer positiven Sinn, einsträngige RNA-Molekül, das etwa 10,8 Kilobasen lang ist. Die Struktur des Genoms ist als 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3'NCR organisiert, wobei nicht-kodierenden Regionen (NCR) flankieren eine Protein-codierende Region ^6. Ein einzelnes Polyprotein (3419 aa) übersetzt wird, dass ist Co- und post-translational in 10 kleinere Peptide gespalten. Sowohl die 5'NCR und 3'NCR RNA-Stem-Loop-Strukturen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufnahme des viralen Genoms Übersetzung und Replikation. Die strukturellen Komponenten des Genoms der Capsid, Membran besteht und Hüllproteine. Die nicht-strukturellen Proteine ​​sind entscheidend für die Genom-Replikation.

Derzeit sind Zika Virusstämme gruppiert in drei Haupt Genotypen: West African, Ost - Afrika, Asien und ^6,10-13. Es hat sich gezeigt , dass die East African Abstammung verbreiten nach Westafrika und Asien vorgeschlagen, wo es später weitere ¹² entwickelt. Der asiatische Genotyp ist verantwortlich für die aktuellen Ausbrüche in Nord- und Südamerika. Zika Virus kann sowohl kultiviert werden in Mücke und Säugerzellen. Primäre Hautfibroblasten, unreife dendritische Zellen, kortikalen neuronalen Vorläuferzellen und Vero - Zellen sind empfänglich für eine virale Infektion Zika ^10,14,15. Sowohl Typ I und Typ II - Interferonen wurden ZIKV Wachstum in Fibroblasten der Haut ¹⁵ gezeigt zu beschränken. Die Ziele dieser Studie sind eine stufenweise, detailliertes Protokoll für die Herstellung und das Testen des asiatischen Genotyp ZIKA Virusstamm PRVABC59 in einer Säugerzellkultursystem zur Verfügung zu stellen und den Nutzen dieser infektiösen Kultursystems als Medikamenten-Entwicklungsplattform zu demonstrieren. Diese Ressource hat das Potenzial, zu stark die Zika virale und neurologische Forschung profitieren weiter i erläuternts Mechanismen der viralen Pathogenese und Entwicklung von viralen Virulenz.

Protokoll

Hinweis: Eine schematische Darstellung der Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Zellen

1. Verwenden Sie Vero-Zellen für Zika Virusproduktion und Analyse von viralen Replikationszyklus.
2. Bereiten vollständige Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 Einheiten / ml) und 10 mM HEPES.
3. Kultur Vero - Zellen mit dem angegebenen vollständige Wachstumsmedium bei 37 ° C mit 5% CO _2.

2. Zika Virusproduktion

1. Ernten Sie die Vero-Zellen bei 80% Zelldichte unter Verwendung von 0,25% Trypsin in T-75-Kolben und die Zellen zu zählen.
   1. Aspirieren das Medium aus dem T-75 Kulturflasche und spülen Sie die Zellen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   2. 2 ml 0,25% Trypsin und Inkubation Der Kolben wird bei 37 ° C für 5 min.
   3. 8 ml des Serums Wachstumsmedium, das Trypsin zu inaktivieren. Pipettieren nach oben und unten zu suspend Zellen und übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube.
   4. Entfernen Sie 10 ul Zellen und mischen mit der gleichen Menge von 0,4% Trypanblau. Laden der vorbereiteten Mischung in die Zelle Zählkammer Dia- und erhalten Lebendzellanzahl eines automatisierten Zellzähler verwendet wird.
2. Seed insgesamt 7 Millionen Zellen in einem 30 ml Volumen in einem T-160-Kolben.
3. Am nächsten Tag vorzubereiten eine geeignete Multiplizität der Infektion (0,01 bis 0,1 MOI) von Zika Virus Inoculum in einem 10 ml serumfreies Kulturmedium pro Flasche.
4. Entfernen Sie die verbrauchte Medien aus dem T-160-Kolben und fügen Sie dann den frisch viralen Inokulum hergestellt (10 ml).
5. Inkubieren der inokulierten Kolben in 37 ° C mit 5% CO ₂ für 4-6 Std. Verbreiten Sie das Inokulum durch sanft die Kolben seitlich in jeder Stunde zu kippen.
6. Bei Beendigung der Inkubation ersetzt das Inokulum mit warmem Serum-ergänztem Wachstumsmedien (30 ml) für jeden Kolben. Dann weiter die Viruskultur für den nächsten 96 Stunden.
7. Stellen Sie sicher, das Fortschreiten der infection durch das Auftreten von viralen Plaques auf der Zellschicht Beobachtung eines Phasenkontrastmikroskop und nehmen Bilder (Abbildung 2) als bei 40 - facher und 200 - facher Vergrößerung erforderlich.

Abbildung 2:. Plaketten von Zika Virus auf einer Monoschicht von Vero - Zellen gebildet Hellfeldbilder von verschiedenen Vergrößerungen zeigen Zika viralen Plaques bei 48 hpi. Beachten Sie die Anwesenheit von gerundeten Zellfoci auf der Monoschicht. (Maßstabsbalken = 50 & mgr; m) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

8. Erntezellkulturüberständen an der 96 Stunden Zeitpunkt und zentrifugieren der Überstand bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen.
9. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne störende pelle Schutt und Transfer to 15-ml-Röhrchen. Ultrazentrifugation bei 24.000 xg durchgeführt werden, um die Viruspartikel (optional) zu konzentrieren.
10. Lagern Sie die viralen Kulturüberständen in mehreren Aliquots bei -80 ° C.

3. Mess Titer Zika Virus durch Plaque-Assay

1. Seed naive Vero - Zellen bei 1 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung in 2 ml Volumen einer 12-Well - Platte verwendet wird .
2. Am nächsten Tag vorbereiten serielle Verdünnungen von Virus-Kulturüberständen 10-fach von den T-160-Kolben gesammelt Serum-freien Medien. Entfernen Sie die verbrauchten Medien aus jeder Vertiefung und fügen 400 ul vorbereitet Inokulum auf Vero-Zellen in dreifacher Ausfertigung.
3. Inkubieren der inokulierten Kolben in 37 ° C mit 5% CO ₂ für 4-6 Std. Verbreiten Sie das Inokulum durch sanft die Platte seitlich an jedem eine Stunde zu kippen.
4. Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie das Inokulum mit Serum ergänzten Medium (2 ml pro Vertiefung).
5. Bei 48 Stunden nach der Impfung, zählen die Virusherde eine Phase contr mitast Mikroskop. Berechne die Virustiter als Plaque bildende Einheiten (PFU) pro ml. Siehe Abbildung 3 für Plaque - Test.
6. Fix und färben die Zellen in 4% Formaldehyd und 0,1% Kristallviolett-Lösung in 20% Ethanol für eine klare Darstellung von Plaques.

4. Zika virale Genom-Replikation Assay

1. Seed naiver Vero - Zellen bei 1 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung in 2 ml Volumina einer 12-Well - Platte verwendet wird . Am nächsten Tag vorbereiten virale Inokula (MOI von 0,01 und 0,1; 400 & mgr; l / Vertiefung) mit niedrigem und hohem Titer Serum freie Medien in dreifacher Ausfertigung mit. Für Mock-Infektion verwenden Serum freie Medien (400 & mgr; l / Vertiefung) nur.
2. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.4.
3. Bei den 48 und 96 h Zeitpunkte, sammeln die Proben für die RNA und Immunzytochemie (ICC).
   1. Für die Ernte RNA-Proben, die Medien zu entfernen und dann 400 ul Lyselösung hinzufügen direkt in jede Vertiefung und sammeln die Lysaten.
   2. Für ICC, entfernen Sie die Medien und tHenne fixieren die Zellen durch Zugabe von 1 ml Methanol in jede Vertiefung und die Platte für 30 Minuten bei 4 ° C inkubiert.
   3. Aus dem Zelllysat, isolieren die Gesamt-RNA eine RNA-Extraktions-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Quantifizieren der RNA mit einem Spektralphotometer.
4. Durchführen eines Zweischritt reverse Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) das Genom ZIKV Gehalt von geernteten RNA zu bestimmen.
   1. Zur Umkehr der RNA transkribieren, zunächst eine 13 & mgr; l-Reaktionsmischung aufgebaut, bestehend aus 5 ug isolierte RNA, 1 ul dNTPs (10 mM) und 1 ul zufälligen Hexamer (250 ng) in einer 0,2-ml-Röhrchen. Inkubieren der Röhrchen bei 65ºC für 5 min und dann für eine Minute auf Eis stellen. Anschließend fügen 1 ul reverse Transkriptase, 4 & mgr; l Synthesepuffer 5fach Strang, 1 ul 0,1 M Dithiothreitol und 1 & mgr; l RNase-Inhibitor zu dem Reaktionsgemisch. Inkubiere das Rohr für weitere 5 min bei 25 ° C, gefolgt von 60 min bei 50 ° C und inactivaß die Reaktion durch Erhitzen auf 70 ° C für 15 min.
   2. Führen Sie qPCR unter Verwendung von 1 & mgr; l der resultierenden cDNA mit 12,5 ul 2x grünen Farbstoff Supermischung, die DNA-Polymerase und 1 ul 10 mM einzelnen Primer, die spezifisch für Zika Virus [Zika Virus pan-Genotyp-Primer (für: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' Rev;: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika Virus asiatischen Genotyp PRVABC59 Stamm-Primer (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], oder Hepatitis-C-Virus (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), oder zelluläre Housekeeping-Gen GAPDH (für: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') in einem 25 ul Reaktionsvolumen.
   3. Führen PCR unter Verwendung der Ausführungsbedingung 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 30 Sekunden (40 Zyklen) in einem Echtzeit-PCR-System.
   4. Verwenden Sie GAPDH Expressionsniveau basierend auf cycle threshold (Ct) Wert der Z zu normalisierenika viralen Genoms Messung. Berechnen Sie die Delta - Ct (ACt) -Wert von Zika Genoms im Vergleich zu derjenigen von GAPDH und erhalten die 2 ^ACt Wert. Dann berechnen die Falte Änderung, indem das Verhältnis der normalisierten Zika Genom Inhalte zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten nehmen. Siehe Abbildung 4 für ZIKV Genomreplikation Ergebnisse.
5. Führen ICC das Methanol fixierten Zellen.
   1. Waschen der fixierten Zellen dreimal mit 1x PBS und Blockieren mit ICC Blockierungspuffer (3% Ziegenserum, 3% BSA, 0,1% Triton-X 100 in PBS).
   2. Mit der Maus monoklonaler anti-dsRNA Antikörper J2 (1 ug / ml) in einer Verdünnung von 1: 100 in Blocking-Puffer und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
   3. Waschen der Zellen mit 1x PBS und fügen sekundären Antikörper Ziege-anti-Maus-IgG-594 (1 ug / ml) in einer 1: 1000 Verdünnung in Blockierungspuffer und Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur.
   4. Wash-Zellen mit 1x PBS und Färbung für Kerne mit Hoechst-Farbstoff undbeachten Sie die Zellen , die ein Fluoreszenzmikroskop bei 100 - facher Vergrßerung (Abbildung 4) verwendet wird .

5. Screening Zytokin-Bibliothek gegen eine Infektion Zika Virus

1. Seed naive Vero - Zellen bei 1 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung einer 12-Well - Platte verwendet wird . Sobald die Zellen gebunden sind (6 Stunden nach der Aussaat), für jede Zytokin in den angegebenen Konzentrationen in biologischen Duplikaten (2 ml Volumen / Well). Enthalten Fahrzeug (PBS) allein Kontrolle.
2. Bei 12 Stunden nach der Behandlung, führen Zika Virusinfektion (MOI von 0,1 in 400 & mgr; l pro Vertiefung). Fügen Negativkontrollen ohne Infektion (mock).
3. Bei 4 Stunden nach der Infektion, ersetzen Sie die viralen Inokulum mit Medien Zytokin behandelt (2 ml). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für weitere 44 Std.
4. Bei 48 Stunden nach der Infektion zählen virale Plaques ein Phasenkontrastmikroskop und erwerben repräsentative Bilder von infizierten Zellen bei 40 - facher Vergrößerung (Abbildung 5).

Ergebnisse

Ein Zika - Virusstamm (PRVABC59; GenBank - Zugangsnummer KU501215) des asiatischen Genotyp wurde in dieser Studie ¹² genutzt. Vero - Zellen bei 80% Konfluenz wurden zur Untersuchung der de novo Zika Virusinfektion verwendet. Für die virale Produktion und anschließende virologischen Charakterisierung, eine frühe Passage (P3) Zika Virus wurde verwendet. Die viralen Plaques wurden am zweiten Tag der Infektion beobachtet. Zika viralen Nachkommen von der anfänglich inf...

Diskussion

Hier wird eine rationalisierte Protokoll zur Kultivierung Zika Virus in vitro dargestellt. Kritische Schritte, einschließlich Identifizierung optimale Endpunkte für Viruskultur erweitert, Titer zu messen und zu quantifizieren Genomreplikation bereitgestellt wurden. Zika-Virus ist ein menschlicher Krankheitserreger, so, beim Umgang mit infektiösen Erregern, die Biosicherheit Verfahren sind strikt befolgt werden. Ein Affennierenzelllinie, Vero, wurde für den Nachweis verschiedener virologische Tests verwendet...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red	Corning	25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	T10282
Countess – Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Countess-cell counting  chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10283
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fischer	4471088
RNase-Free DNase	Promega	M6101
Vero Cell Line	ATCC	CCL-81
Zika viral strain PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6	Peprotech	200-06
IL-1 alpha	Peprotech	200-01A
TNF-alpha	Peprotech	300-01A
Interferon alpha A	R & D Systems	11100-1
Interferon beta	Peprotech	300-02BC
Interferon gamma	Peprotech	300-02
Centrifuge 5415R	Eppendorf	5415R
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5810R
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