SILAC Based Proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1-infizierten Zellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine quantitative Proteomik Verfahren die Technik der Silac (SILAC) mit Hilfe der Wirkung von HIV-1-Infektion auf Host exosomalen Proteome zu analysieren. Dieses Protokoll kann leicht an Zellen unter verschiedenen Stress oder Infektionsbedingungen angepasst werden.

Zusammenfassung

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Einleitung

Viele menschliche Erkrankungen, einschließlich Virusinfektionen sind häufig mit ausgeprägten zellulären Prozessen verbunden, die stattfinden und um in den betroffenen Zellen. Die Proteine, die oft als die ultimative zelluläre Effektoren wirken, diese Prozesse vermitteln. Die Analyse der Proteine ​​können oft wertvolle Informationen über die lokale Umgebung der betroffenen Zellen liefern und uns helfen, die zugrunde liegenden Mechanismus der Pathogenese der Erkrankung zu verstehen. Unter den verschiedenen Techniken der Proteinanalytik, hält Proteomik besonders vielversprechend. Als leistungsstarker, groß angelegte Tool können Proteomik ein systemisches Verständnis zellulärer Prozesse schaffen, vor allem im Bereich der Funktion und Interaktion von Proteinen. spezifische Proteine ​​zu analysieren ist einfacher durch die Entwicklung von Markierungstechniken hergestellt, die Forscher ermöglichen, die Expression von zellulären Komponenten zu überwachen, insbesondere Proteine, in den Ort der Untersuchung. Obwohl viele Proteom-Analysen wurden auf zellulärer durchgeführt worden istProteom - Skala, Proteomik Charakterisierungen auf subzellulärer Kompartimente haben sich als besonders informativ ¹ zu sein. Dies wird beispielhaft auch in den Studien von HIV-1-Infektion.

Exosomen, 30-100 nm Membranvesikel von einer Vielzahl von Zelltypen sekretiert ^{2, 3,} sind kritische Komponenten der interzellulären Kommunikation und molekularen Transport. Sie waren zuvor eine wichtige Rolle bei der HIV-1 - Knospungsvorgang ^{4, 5} zu spielen entdeckt. Durch die Proteomanalyse mit funktionellen Dissektion kombiniert, fanden wir , dass von HIV-1 - infizierten Zellen freigesetzt Exosomen bestehen aus einer einzigartigen und quantitativ unterschiedliche Proteinsignatur und Hafen regulatorische Moleküle , die auf benachbarten empfänglichen Zellen zelluläre Eigenschaften beeinflussen, einschließlich der zellulären Apoptose und Proliferation ^6. Die Verfahren werden in diesem Protokoll beschrieben ist,nämlich SILAC (Silac) ⁷ basierend proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1 - infizierten Zellen. Ähnliche Ansätze können durch Einstellen der experimentellen Spannung auf den bestimmten Kompartiment oder einen Bruchteil von Interesse und die erforderlichen Änderungen an den beschriebenen Verfahren besser verstehen zu anderen subzellulären Kompartimenten während der Pathogenese angewendet werden.

In Anbetracht der jüngsten Entwicklung von quantitativen Proteomik Methoden gibt es viele zur Auswahl, wenn die effizienteste Methode für ein bestimmtes Experiment ausgewählt. Unter diesen sind die chemisch-basierte iTRAQ (isobar Tags für relative und absolute Quantifizierung) ⁸ und die markierungsfreie MRM (multiple reaction monitoring) ⁹ Techniken. Beide Methoden sind leistungsfähige Werkzeuge und sind eine gute Wahl für spezifische Einstellungen. Für eine typische Labor hauptsächlich mit Zelllinien arbeiten, jedoch sind diese beiden Methoden relatively höheren Kosten und sind zeitaufwendig, wenn sie der SILAC basierte Methode verglichen. SILAC ist eine Stoffwechsel basierten Markierungstechnik, die Formen der Aminosäuren aus dem Kulturmedium in zelluläre Proteine ​​nicht-radioaktiven Isotopen enthält. Typischerweise beginnen, SILAC Experimente mit zwei Zellpopulationen, beispielsweise infizierte und nicht infizierte. Jedes Zimmer ist unterschiedlich in seiner spezifischen Isotopen Umgebung markiert bis zur vollständigen Kennzeichnung erreicht wird. Die markierten Exosomen dieser Zellen werden dann an die Proteinextraktion unterzogen. Sobald extrahiert, werden die markierten exosomalen Proteine analysiert Flüssigchromatographie Tandem - Massenspektroskopie ^10. Schließlich werden die Ergebnisse der Massenspektrometrie und deutlich markierten Proteine ​​zu statistischen unterworfen und Bioinformatik-Analysen sowie strenge biochemische Überprüfung. Unsere bisherigen Untersuchungsberichte deuten darauf hin, dass die SILAC / exosome Verfahren besser geeignet sind für Zelllinien als primäre Zellen, wie Zelllinien sind in der Regel in einaktiv proliferierenden Zustand für eine effiziente Isotopenmarkierung,

Protokoll

1. Zellkultur und HIV-1-Infektion

HINWEIS: Bevor Experimente starten, wird empfohlen , ¹² der Zellen Lebensfähigkeit durch Trypan - Blau - Färbung ¹¹ und deren Proliferation durch einen MTT - Test zu überprüfen. Es ist auch wichtig neu vorbereitet SILAC Medium zu verwenden. Verschiedene Zelllinien können verwendet werden, solange sie in einem aktiv proliferative Phase, und sind anfällig gegenüber HIV-1-Infektion, oder die Testbedingung der Wahl. In diesem Protokoll verwenden H9-Zelllinie als Beispiel.

1. Seed 2 x 10 & ^sup6 ; H9 - Zellen in jeder Zellkulturflasche. Wachsen eine Gruppe in 10 ml RPMI 1640 - markiertem Medium , enthaltend 10% dialysiertes fötales Rinderserum (FBS), 100 mg / L ¹³ C ₆ L-lysin und 100 mg / L ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ L-Arginin. Wachsen die andere Gruppe in 10 ml unmarkierten RPMI 1640-Medium, das mit 10% dialysiertem FBS, 100 mg / l L-Lysin und 100 mg / l L-Arginin.
2. Wachsen die Zellen für sechs Verdopplungen an welchem ​​Punkt der Proteine ​​der Zellen in dem markierten Medium praktisch vollständig markiert (> 99%) mit schweren Aminosäuren. Fügen Sie frische Medien oder Medien regelmäßig zu ändern (alle 1-3 Tage, je nach der Art der Zelle. Für H9 Zelle ändern Medium alle 3 Tage). Am Ende der Markierung erhöhen Kulturvolumen (zB ~ 30 ml) das Wachstum von Zellen unterzubringen.
   HINWEIS: Bestimmen genaue Zellenzeit am Beginn des Experiments über den Trypan-Blau-Färbung und Zellzählung zu verdoppeln.
3. Infect die markierten Zellen mit HIV-1 _NL4-3 mit Standard - HIV-1 - Infektion Protokoll ¹³ für 48 Stunden. Inkubieren der Zellen mit geeigneten Mengen an Virus mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) etwa 0,3. Überprüfen, HIV-1-Infektion durch p24 Quantifizierung der Kulturüberstände unter Verwendung eines HIV-1 p24-Antigen-ELISA-Kit. Führen Sie eine Immunfluoreszenztest ¹⁴ erfolgreiche Infektion von Zellen zu bestätigen. Keep wächst die unmarkierten Zellen in unmarkierten Medium ohne HIV-1-Infektion.
4. Ernte der Überstände beider Gruppen am Ende der Infektion (Schritt 2.1).

2. exosome Isolation

Hinweis: Durch eine Reihe von Schritten Ultrazentrifugation, exosomalen Fraktionen aus Kulturüberstände werden ¹⁵ angereichert. Führen alle folgenden Schritte wurden bei 4 ° C mit einer Ultrazentrifuge Rotor, der eine Geschwindigkeit von mindestens 100.000 x g erreichen kann.

1. Sammle den Überständen der Kulturen in 50 ml konischen Röhrchen, die Vermeidung Zellen. Zentrifugieren für 10 min bei 300 xg, um die verbleibenden Zellen zu entfernen.
2. Sammeln Sie die Überstände in neue 50 ml konische Röhrchen und zentrifugieren 10 min bei 2000 × g tote Zellen zu entfernen. Übertragungsüberstände auf kommerzielle Rotor-kompatiblen Röhren führt, die fähig sind Ultrazentrifugation zu widerstehen.
3. Achten Sie darauf, die Ultrazentrifugenröhrchen zu balancieren. Zentrifugieren der Röhrchen für 30 min bei 10.000 × g zu entfernenZelltrümmer.
4. Sammeln Sie die Überstände in Ultraröhrchen und Zentrifuge für 70 min bei 100.000 x g. Die Überstände verwerfen.
5. Resuspendieren der exosome reichen Pellets in 5 ml frischem PBS. Übertragen Sie die Lösungen an die frische Ultrazentrifuge Rohre und Zentrifuge wieder für 70 min bei 100.000 x g.
6. Verwerfen Stände. Zum Speichern der Exosomen langfristig Resuspendieren der Pellets in 50 ul PBS und bei -80 ° C. Alternativ gehen Sie direkt zur Proteinextraktion, wie unten gezeigt.

3. Proteinextraktion und Vorbereitung

1. Löse isoliert exosomalen Pellets in 100-200 ul RIPA-Lyse und Extraktionspuffer mit zusätzlichen Protease-Inhibitor-Cocktails. Der Puffer besteht aus 25 mM Tris-Hydrochlorid, 150 mM Natriumchlorid, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat und 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei pH 7,6. Die Protease-Inhibitor-Cocktails sollte eine Vielzahl von Protease-Inhibitoren enthalten, wie Aprotinin, Bestatin, leupeptin, Pepstatin A und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), das kann eine vollständige Palette von Proteasen hemmen.
2. Zentrifugieren Sie die gelösten Lösungen für 10 Minuten bei 13.000 × g (4 ° C), und übertragen Sie die gelöscht Stände auf neue 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Quantifizieren Proteinkonzentration jeder Probe von Exosomen mit Bicinchoninsäure (BCA) oder Bradford - Test ^16.
4. Mischen Sie eine gleiche Menge an Proteinen (2 ug) von markierten und unmarkierten Proben und führen Sie die gleiche Mischung auf einem 4-20% SDS-PAGE-Gel bei 120 mA / 200 V für 30 min.
5. Stain Gel mit Coomassie - Blau , gefolgt von ¹⁷ Entfärben.
6. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die Probenspur aus dem Gel. Dann schneiden Sie das Gel Spur in 10-15 gleich große Stücke. Legen Sie jedes Stück in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für insgesamt 10-15 Rohre.
7. Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH ₄ HCO ₃ in 50% Acetonitril, Wirbel, und -Überstände verwerfen. Zweimal wiederholen. TrockenWürfel in einem Vakuum - Konzentrator ^{18, 19.}
8. Rehydrate Würfel mit 10 mM Dithiothreitol (DTT), Wirbel und Zentrifuge kurz. Inkubieren bei 56 ° C für 1 Stunde. Überstand verwerfen.
9. Tauchen Gelwürfel in 55 mM Iodacetamid, Wirbel, und Spin. Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln für 45 min. Überstand verwerfen.
10. Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH ₄ HCO _3, Wirbel, Spin und Überstand verwerfen.
11. Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH ₄ HCO ₃ in 50% Acetonitril, Wirbel, und Spin. Wiederholen 3.9 und 3.10.
12. Trocknen Sie die Würfel in einem Vakuum-Konzentrator. In 25 ul Sequenziergrad modifizierte Trypsin in 25 mM NH ₄ HCO _3, Inkubation bei 4 ° C für 30 min, und entsorgen Sie die überschüssige Lösung. Tauchen Sie Würfel in 25 mM NH ₄ HCO ₃ ohne Trypsin und Inkubation über Nacht bei 37 ° C.
13. Spin Kurz Würfel nach unten und übertragen die resultierenden Peptid Extract in ein neues Röhrchen. In 30 ul 5% Ameisensäure in 50% Acetonitril zu den Kuben, Wirbel für 30 Minuten, und Spin. Kombinieren Sie den Überstand mit dem Extrakt. Trocknen Sie die Peptidextrakte mit einem Vakuumkonzentrator auf weniger als 5 & mgr; l.
14. Senden Proben Massenspektrometrie Core Facility für die LC-MS / MS-Analyse. Die MS-Analysedaten, die von Open Source Software erzeugt werden kann, enthält typischerweise eine Zugangsnummer für jedes identifizierte Protein, gekennzeichnet / nicht-markiertem Verhältnisse und die Anzahl der einzelnen Peptide identifiziert.

4. Western Blotting Verification

HINWEIS: Western-Blot wird empfohlen Massenspektrometrie Ergebnisse zu überprüfen.

1. Folgen Standard-Western-Blotting Protokollen und sicherzustellen, dass gleiche Mengen an Protein aus jeder Gruppe geladen werden. Verwenden Antikörper gegen Proteine von Interesse (zB Annexin A5, Laktat - Dehydrogenase - B - Kette) identifiziert durch MS. Western-Blot-Detektion, zusammen mit Densitometrie analysis, kann bestätigen, dass MS Protein Identifizierung und Quantifizierung korrekt sind.

5. Proteomik Datenanalyse

HINWEIS: Die Bewertung der Datenqualität, Datenvorbehandlung, Berechnung und Bestimmung der signifikanten Proteinkandidaten werden separat erfolgen für jede MS replizieren. Sobald obigen Analysen abgeschlossen sind, werden die analysierten Daten von Replikaten verglichen und ^{6 kombiniert, 20, 21.}

1. Bewerten Sie die Qualität der MS-Daten.
   1. Zunächst log2 die SILAC-MS in einem Tabellenkalkulationsprogramm markierten / nicht markierten Verhältnisse von quantifizierten Proteine ​​verwandeln.
   2. In der wissenschaftlichen Grafiken und statistische Software, Gruppe die Verhältnisse in 40-100 Verhältnis Bins und zeichnen Sie die Anzahl der Verhältnisse pro Fach ein Histogramm zu erzeugen. Eine normale Verteilung von Histogramm zeigt eine gute Qualität der MS - Daten ^6. Führen Sie diesen Schritt für alle MS repliziert.
2. Um das Vertrauen und die Genauigkeit der MS Peptidverhältnisse erhöhen, sollten Proteine ​​zu entfernen, die weniger als zwei quantifizierten Peptide haben.
3. Um zu bestimmen , deutlich nach oben und nach unten reguliert Protein Kandidaten, verwenden Sie die folgenden Schritte zur Berechnung Bedeutung ²² Schwellen.
   1. In der wissenschaftlichen Grafiken und statistische Software erzeugen, die den Frequenzverteilungsdaten eine nichtlineare Regression oder Kurvenanpassung. Dieser Schritt ergibt Werte, die verwendet werden können, die Cutoff-Werte zu berechnen. Berechnen Sie die Cut-off-Werte als Median ± 1,96 σ für 95% Vertrauensgrenzen oder 2,56 σ für 99% Vertrauensgrenzen.
      HINWEIS: Nähere Einzelheiten des Cutoffs Berechnung kann bei Emmott et al. ^22.
   2. Wählen Sie die Proteinkandidaten, deren Verhältnisse sind entweder größer als 1,96 (oder 2,56) Standardabweichungen über dem Mittelwert (signifikant überexprimiert) oder niedriger als 1,96 (oder 2,56) Standardabweichungen unter dem Mittelwert (deutlich unter ausgedrückt).
4. Vergleichen die Replikate der oben identifizierten signifikanten Kandidaten Konsistenz zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass sie die folgenden Kriterien erfüllen diese letzte Auswahlschritt weitergeben müssen: Kandidaten müssen konsequent in allen Replikaten identifiziert werden; und Replikate eines Kandidaten müssen in der Richtung der Regulierung im Einklang stehen (vorzugsweise mindestens 2 von 3 Wiederholungen eines Kandidaten sollte entweder hochreguliert oder herunterreguliert).
5. Finalisieren Daten für die Kandidaten, die die oben genannten Kriterien durch ihre Replikate "Zusammenführen von Daten erfüllen.

6. Bioinformatics Verifikation und Charakterisierung

HINWEIS: Die bestehenden genomischen und bioinformatischen Informationen bietet eine Fülle von Informationen für fast jedes Protein. Data Mining und bioinformatische Analyse dieser Informationen können gewinnen viel Einblick in das Eigentum und die Funktionen der bedeutenden Kandidaten helfen. Diese process ist in der Regel notwendig, die richtige nachgeschalteten Nasslaborexperimenten zu entwerfen.

1. Mit ihren GenBank Zugangsnummern oder UniProt IDs, die Kandidaten gegen aktuelle exosome Datenbanken zu suchen (Exocarta ^23, Evpedia ²⁴⁾ , um zu überprüfen , dass die Kandidatenproteine zuvor in exosome gefunden wurden. Dieser Schritt fügt eine Schicht von Vertrauen, dass die Kandidaten sind in der Tat in Exosomen.
   1. Zugang http://www.exocarta.org/, klicken Sie auf "Abfrage" und geben Sie entweder das Gen oder Protein Name / Zugangsnummer. Eine Zusammenfassung Seite wird angezeigt und die Beweise in exosome wird gezeigt, zur Verfügung gestellt werden, wenn es irgendein.
2. Suche die Kandidaten gegen die HIV-1 und dem Human Protein - Interaktion Datenbank ^25. Alternativ können Sie die spezifischen Datenbanken, die Informationen über die Interaktion der Kandidatenproteine ​​und die Testbedingungen zur Verfügung stellen kann.
   1. Zugriff auf die Datenbank bei www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVWechselwirkungen. Auf dem Eintrag 'Protein Domain-Namen ", geben Sie die Namen der Kandidaten oder Zugangsnummern, und klicken Sie auf Suche. Die Suchergebnisse können Einblick in die Wechselwirkungen zwischen HIV-1 zur Verfügung stellen und die Protein-Kandidaten, und welche der Kandidaten vorschlagen könnte wirklich HIV-1 in Verbindung gebracht werden.
3. Import GenBank Zugangsnummern oder UniProt IDs der Kandidaten in GO - Analyse - Software (wie FunRich, Functional Enrichment - Analyse - Tool ²⁶⁾ und die Software ausführen.
   1. Laden Sie die Software auf http://www.funrich.org/. Nach der Installation öffnen Sie die Software unter Anreicherung Analyse, klicken Sie auf "Add Data Set", und die Liste der Protein / Gene hochladen. Als nächstes wählen Sie den Diagrammtyp die GO-Analyse zu visualisieren.
      HINWEIS: GO Analyseergebnisse werden in Form von Tortendiagrammen visualisiert werden. Dieser Schritt hilft uns, mit den Kandidaten in den Bereichen biologische Verfahren (BP), Cellular Komponente (C assoziiert globalen Einblick zu gewinnenC) und Molecular Funktion (MF).
4. Zugang DAVID bei http://david.ncifcrf.gov/ ^27, klicken Sie auf das "Functional Annotation Tool" auf ihrer Website. Geben Sie die Kandidatenliste, wählen Sie die "Identifier" des Gens wie die "UniProt ID", wählen Sie "Gene List" und suchen. Die angereicherten GO Begriffe, p-Werte und weitere Parameter können durch Klicken auf die "Annotation Zusammenfassung Ergebnisse" unter der "Gene_Ontology" Kategorie zu finden.
5. Um mögliche Wechselwirkungen der Kandidaten mit anderen Proteinen zu untersuchen, verwenden offen zugängliche STRING - Datenbank ²⁸ potentielle Protein-Protein - Wechselwirkungen und mögliche biochemische Wege aufzuklären.
   HINWEIS: GO Analysis and Functional Annotation (Abschnitt 6,3-6,4) können hier auch die neuesten STRING-Software durchgeführt werden.
   1. Zugriff auf die Datenbank bei http://string-db.org/. Geben Sie die Protein-ID oder eine Sequenz in die vorgesehenen search Feld und wählen Sie die richtigen Spezies für die Analyse. Klicken Sie auf "Suchen". Die Ergebnisse werden Informationen zu den beiden direkten (physischen) geben und indirekte (funktionelle) Verbände. Die Top-Ten bekannte Spiele für die exosomalen Kandidat wird angezeigt und sollte für eine signifikante Kandidatenauswahl berücksichtigt werden.
      ANMERKUNG: Eine große Menge an Informationen mit den Kandidaten im Zusammenhang analysiert werden können, die Schritte oben. Die wichtigsten Kandidaten zur weiteren nachgelagerten molekularen und biochemischen Analyse ausgewählt werden.

Ergebnisse

1A ist ein Flussdiagramm , umreißt das SILAC Markierungsverfahren ^21. Um die Exosomen zu reinigen, müssen die Proben über Zentrifuge geschleudert werden. 1B zeigt die Schritte exosome Reinigung durch Ultrazentrifugation serielle ^21. Nach der Reinigung sind die Exosomen unter experimentellen Proteomanalyse wie in dem Verfahren beschrieben.

Diskussion

In den in diesem Dokument beschrieben, haben wir gezeigt, die Anwendung der SILAC Technik, um die Wirkung von HIV-1-Infektion auf dem Host exosomalen Proteom zu untersuchen. Anfänglich nicht infizierten und HIV-1-infizierten Zellen sind unterschiedlich isotopenmarkierten. Die differentiell markierten Exosomen werden dann gereinigt, bevor die Proteinextraktion durchgeführt wird. Als nächstes wird die Massenspektrometrie-Flüssigchromatographie-Tandem eingesetzt, um die exosomalen Proteom zu analysieren. Schließlich w...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
H9 cell line	ATCC	HTB-176
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
MTT assay kit	Thermo Fisher	V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher	26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Thermo Fisher	88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Thermo Fisher	88431
HIV-1 NL4-3	NIH AIDS Reagent Program	2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit	PerkinElmer	NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge	Eppendorf	22628045
Refrigerated ultracentrifuge	Beckman Coulter	363118	Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher	14-432-22
Ultracentrifuge Tubes	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti Rotor	Beckman Coulter	369694
RIPA buffer	Thermo Fisher	89900
Protease Inhibitor Cocktails	Thermo Fisher	78430
ThermoMixer	Eppendorf	5384000020
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23250
Spectrophotometer	Biorad	1702525
SDS PAGE Gel apparatus	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Novex	XV04200PK20
Gel staining reagent	Sigma Aldrich	G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher	SPD131DDA
Antibody to human annexin A5	Abcam	ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain	Abcam	ab53292
Graphing and Statistical Software	Systat	SigmaPlot	Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite	Max Planck Institue of Biochemistry	Maxquant
Software and databases	Various vendors		Refer to main text for details