Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Zusammenfassung

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Zusammenfassung

Biofilme bestehen aus Gruppen von in einem selbst sezerniert Matrix eingeschlossen Bakterien. Sie spielen eine wichtige Rolle in der industriellen Verschmutzung sowie in der Entwicklung und Persistenz von vielen gesundheitsbezogenen Infektionen. Eines der am besten beschrieben und untersucht Biofilmen in der menschlichen Erkrankung tritt bei chronischen Lungeninfektion von Mukoviszidose-Patienten. Wenn Biofilme im Rahmen des Host studieren, können viele Faktoren die Biofilmbildung und Entwicklung beeinflussen. Um zu ermitteln, wie Wirtsfaktoren die Bildung von Biofilmen und Entwicklung beeinflussen können, haben wir eine statische chambered Abdeckglas Methode Biofilmen in Gegenwart von Wirt abgeleiteten Faktoren in Form von Sputum Stände zu wachsen. Die Bakterien werden in die Kammern ausgesät und Sputum Filtrate ausgesetzt. mit einem handelsüblichen Biofilm Lebensfähigkeit Kit vor der konfokalen Mikroskopie und Analyse folgenden 48 h des Wachstums werden Biofilme gefärbt. Nach der Bildaufnahme können Biofilm Eigenschaften mit Hilfe Plattformen unterschiedlicher Software bewertet werden.Dieses Verfahren ermöglicht es uns, Schlüsseleigenschaften von Biofilmwachstum in Gegenwart verschiedener Substanzen einschließlich Antibiotika zu visualisieren.

Einleitung

Bakterielle Biofilme sind Gruppen von Mikroorganismen, die miteinander und umhüllt in einer selbst sezerniert Matrix gebunden sind. ^1,2 Classically stellen sie Bakterien physisch an einen abiotischen oder biotischen Oberfläche unter den Bedingungen der Strömung gebildet angebracht. Biofilme sind auch gezeigt worden, unter statischen Bedingungen (keine Strömung) und distal von Oberflächen, beispielsweise an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche der thermischen Pools oder Häutchen gebildet in Reagenzgläsern zu wachsen. Diese Biofilme sind seit langem in der Umwelt erkannt und sind eine große Nachteil für industrielle Prozesse, wie sie in Wasserbehältern oder in Rohren bilden können, was zu Biofouling, Korrosion und Verstopfung. ^3,4

Biofilme sind auch im Gesundheitsbereich kritisch, da sie in Katheter bedingten Infektionen, Lungeninfektionen bei Mukoviszidose-Patienten, sowie in zahlreichen anderen Infektionen beteiligt haben gezeigt werden. ^5,6 Eines der Markenzeichen von Biofilm - Infektionen ist die deerhöhte Empfindlichkeit von Bakterien gegen Antibiotika und die Beeinträchtigung der Clearance durch das angeborene Immunsystem. ^7-9 Die gut untersucht, klinisch relevante Szenarien Biofilm-basierten Infektion beteiligt tritt bei Patienten mit zystischer Fibrose (CF), die chronisch infiziert sind , mit Pseudomonas aeruginosa Biofilme. P. aeruginosa kann eine Reihe von Änderungen bei Etablierung einer chronischen Infektion zu unterziehen , die es sehr schwierig zu behandeln , machen. ^10,11 Biofilme können unterschiedlich angeborenen Immunität aktivieren und Entzündung fahren. ^12-14 Da diese Infektionen zu einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei CF - Patienten führen, ist es wichtig , Faktoren zu verstehen , die Biofilmbildung in diesem Zusammenhang beeinflussen können.

Eine neue Studie schlägt vor , dass Host-Faktoren bei der Bildung von P. aeruginosa Biofilm Aggregate kritisch sind. ¹⁵ Diese Biofilme tragen zu einer reduzierten Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika und Abwehrmechanismen des Wirts. Die Presenz von Wirt-abgeleiteten Faktoren, wie Neutrophilen-Elastase, sowie sekretierte Produkte von Mikroorganismen, die in der CF-Lunge, haben das Potential stark zu Biofilmbildung und Entwicklung modulieren. ¹⁶ Darüber hinaus interagieren Biofilmen mit dem Host - Expression zahlreicher Wege zu modulieren und Entzündungen auslösen. Während Hochdurchsatzverfahren, wie zum Beispiel die Standardkristallviolett-Assay, einige Informationen in Bezug auf die Biofilmverfahren zur Verfügung stellen kann, die Visualisierung des Biofilms in Reaktion auf diese Faktoren liefern weitergehende Informationen.

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Verfahren zur Faktoren aus dem Sputum von Patienten mit CF mit der Entwicklung von Biofilmen in vitro zu studieren. Dieses Verfahren ermöglicht eine schnelle Visualisierung von auf Sputum enthaltenden Wirtsfaktoren ausgesetzt Biofilmen Kommerzielle Biofilm Lebensfähigkeit Kit. Diese Technik kann verwendet werden, um visuell Veränderungen zu identifizieren, die während der Biofilmwachstum in Gegenwart von exogeno auftretenuns Produkte und stellt ein verbessertes Verfahren der Änderungen in Biofilmentwicklung unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen.

Protokoll

Beachten Sie, dass Forschungsethik Board (REB) erforderlich zu sammeln und zu speichern, Sputum-Proben von menschlichen Probanden. Diese Studien wurden von der Klinik zugelassen für kranke Kinder REB # 1000019444.

1. Vorbereiten CF Sputum-Proben

1. Sammeln Sie Sputum Probe von Patienten während der Routine Abfragen der Mukoviszidose-Klinik und auf Eis halten.
2. Transport Sputumprobe auf Eis innerhalb der ersten Stunde nach der Entnahme, zum Forschungslabor, die Verarbeitung zu unterziehen.

2. Sputum Verarbeitung

1. Aufzeichnen des Volumens des Sputum-Probe erhalten. Fügen Phosphat - gepufferter Salzlösung (PBS) , um das Volumen der Probe auf 2x (dh 2 Teile PBS, 1 Teil Probe).
2. Mischen Sie die Probe gut mit einer Transferpipette. Vortex die Probe auf die höchste Einstellung für 1 min vollständig zu mischen.
3. Aliquot 1 ml der obigen Mischung in die entsprechende Anzahl von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Spin bei 5000 × g nach unten für20 min bei 4 ° C.
4. Nach der Zentrifugation den Überstand und das Pellet verwerfen.
5. Filter sterilisieren den Überstand durch ein 0,22 um Filter und sammeln sich in einem sauberen Reaktionsgefäß.
   HINWEIS: Sterility des Filtrats durch Ausplattieren auf LB-Agar getestet und flüssigen Medien Animpfen.
6. Speichern von Sputum Überstand bei -80 ° C für zukünftige Verwendung.
   HINWEIS: Sputum von mehreren Patienten können auch nach der Filtration gesammelt werden.
7. Vor der Verwendung verdünnt Sputum Filtrat 1/10 v / v (100 & mgr; l Sputum, 900 ul Medium) in gewünschte Medien.
   HINWEIS: Hier Standard LB-Medium (LB) Medien verwendet wurde.

3. Kammerdeckgläser Verfahren zur Bildung von Biofilmen

1. Wachsen Bakteriumisolat von Interesse über Nacht in das gewünschte Medium bei 37 ° C unter Schütteln (200 rpm).
   Hinweis: Eine Anzahl verschiedener Bakterien verwendet wurden, einschließlich der klinischen Isolate von Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia und Achromobacter xylosoxidans. Wahl der Medien hängt von Stämmen und Bedingungen von Interesse kann jedoch LB-Medien für erste Experimente verwendet werden.
2. Von Übernachtkultur, legen 40 & mgr; l der Kultur in die 4 ml frisches Medium wachsen und für 3-4 h bei 37 ° C unter Schütteln (200 Upm) , um eine Kultur mit einer optischen Dichte bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ von ungefähr 0,5 zu erhalten , -0.6.
3. Verdünnen Sie die Kultur aus Schritt 3,2 bis 1/5 in das gewünschte Medium mit 10% Sputum Filtrat oder ohne Auswurf Filtrat (als Kontrolle). Andere Konzentration von Sputum Filtrat kann (dh 50% oder 100%) getestet werden.
4. Verwenden Sie 200 ul der Verdünnung Vertiefungen Schiebekammern auf Saatgut.
5. Lassen Bakterien für 4 Stunden bei 37 ° C zu befestigen ohne Schütteln.
6. Nach 4 Stunden, um die Medien zu entfernen und sanft den Biofilm mit 1x frisches Medium waschen. Ersetzen mit 200 & mgr; l frisches Medium.
   Hinweis: Um die Auswirkungen von Sputum auf dem Biofilm studieren, die fresh Medien sollten Sputum Überstand enthalten.
7. Erlauben Biofilmen für gewünschte Zeitdauer bei 37 ° C zu wachsen, ohne Schütteln, Medien alle 12 Stunden ersetzt, ohne Waschen, bis die Zeit für die Mikroskopie.
   ANMERKUNG: Um die Wirkung von Sputum Überstände auf Biofilm antibiotischen Empfänglichkeit untersuchen, werden Antibiotika zum Medium hinzugefügt folgenden 24 h Biofilmwachstum und werden in den Medien bis zum Anfärben und Abbildung von Biofilmen gehalten.

4. Die Färbung Biofilme und konfokale Mikroskopie

1. gewünschte Wachstumszeit verfolgt (24-48 h funktioniert am besten), entfernen Sie Medien aus der Kammer Brunnen und sanft jede Kammer zweimal mit 300 ul sterilem PBS waschen.
2. Bereiten Sie Färbemischung für Biofilm durch Mischen von 1 ul jeder Farbstoff (sofern in der Lebensfähigkeit Kit) für jeden ml Lösung benötigt. Machen Farbstoff in Wasser oder Media-Lösung.
   HINWEIS: Das Wasser wird vom Hersteller empfohlen.
3. Mit 200 & mgr; l der Farbstoffmischung in jede Vertiefung chambered coverglass und für 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
4. Entfernen Färbung Mischung aus Kammern und waschen Sie jede Vertiefung mit 300 ul sterilem PBS. Entfernen PBS und ersetzen mit frischem Wasser oder Medien.
5. Fahren Sie mit der Visualisierung von Biofilmen durch konfokale Mikroskopie.

5. Visualizing Biofilme mit konfokale Mikroskopie

1. Lesen gefärbten Biofilmen in Kammern unmittelbar nach dem Färben (innerhalb von 1 h). Minimieren Verzögerung in Visualisierung der Objektträger durch Anfärben August 1-02-well Kammern zu einer Zeit.
2. Führen Bildgebung mit konfokalen Mikroskop mit Lasern für die Anregung und Filtersätze für die Erfassung.
   HINWEIS: Hier wird die sich drehende Scheibe konfokalen System mit spektraler borealis Laser (Grün: 491nm, Rot: 561 nm) zur Anregung verwendet wurden. Emissionsfiltersätze von 515/40 und 624/40 wurden verwendet, um die Flecken aus dem Biofilm Lebensfähigkeit Kit zu visualisieren.
3. Nehmen Sie Bilder mit einem 25X Wasser Ziel auf konfokalen Mikroskop mit Kamera.
4. Verwenden Z-Stacks des Biofilms zu modellieren. Nehmen Sie Bilder jede 0,5-1 & mgr; m ausgehend von der ersten in-Fokusebene auf den letzten im Fokus befindlichen Rahmen des Biofilms (typischerweise Spanning 30-80 & mgr; m für 48 Stunden Biofilme)
5. Nehmen Sie 3-5 Bilder von jedem gut.
   HINWEIS: So für einen 8 gut chambered Abdeckglas, 24-40 Bilder erzeugt werden.
6. Speichern Sie die Bilder für die Analyse.
   HINWEIS: Bilder gespeichert werden sollen als OME-TIFF - Dateien mit COMSTAT ^18,19 analysiert werden. Hinweise zur Biofilmbildanalyse kann bei http://www.comstat.dk/ finden. Sobald Bilder importiert werden, können Parameter wie die durchschnittliche Dicke, Biomasse und Flächendeckung für jeden Kanal (rot und grün) analysiert werden.

Ergebnisse

Das Gesamtdesign des Experiments ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Verwendung dieses Protokoll bietet eine bequeme Methode , die Veränderungen in Biofilmen für verschiedene Zeiträume (beispielsweise 24, 48 oder 72 Stunden) gezüchtet zu visualisieren. Wichtig ist, dass exogene Signale, wie Sputum Filtrate können hinzugefügt werden, um die Veränderungen in der Biofilmentwicklung zu visualisieren. Wie in Figur 2 zu sehen ist , kann die Geg...

Diskussion

Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen die Visualisierung von bakteriellen Biofilmen in Gegenwart von exogenen Produkten gewachsen. Es überrascht nicht, die Herstellung der exoproducts ist von Bedeutung, wenn diese Art von System. Zum Beispiel Dithiothreitol (DTT), wird häufig auf die menschliche Sputum-Proben verwendet, um die Proben helfen verflüssigen. Jedoch allein der Wirkung von DTT Biofilmentwicklung verringern kann und die Lebensfähigkeit (Daten nicht gezeigt). Somit sind geeignete Kontrollen für a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf