Biofilmentfernung Kohlendioxid Aerosols Verwendung ohne Stickstoffspülung

Zusammenfassung

Biofilms on surfaces can be effectively and rapidly removed by using a periodic jet of carbon dioxide aerosols without a nitrogen purge.

Zusammenfassung

Biofilms can cause serious concerns in many applications. Not only can they cause economic losses, but they can also present a public health hazard. Therefore, it is highly desirable to remove biofilms from surfaces. Many studies on CO₂ aerosol cleaning have employed nitrogen purges to increase biofilm removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning. However, in this study, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from polished stainless steel surfaces. CO₂ aerosols are mixtures of solid and gaseous CO₂ and are generated when high-pressure CO₂ gas is adiabatically expanded through a nozzle. These high-speed aerosols were applied to a biofilm that had been grown for 24 hr. The removal efficiency ranged from 90.36% to 98.29% and was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm as the treatment time was varied from 16 sec to 88 sec. We also performed experiments to compare the removal efficiencies with and without nitrogen purges; the measured biofilm removal efficiencies were not significantly different from each other (t-test, p > 0.55). Therefore, this technique can be used to clean various bio-contaminated surfaces within one minute.

Einleitung

Biofilms are complex bacterial community structures in which bacterial cells are embedded within self-produced matrices of extracellular polymeric substances, held together, and protected from the external environment. Biofilms can present a public health risk and cause economic losses because they can form on various surfaces, including medical implant materials and devices, food processing equipment, and heat exchangers. In fact, biofilms have been found to be associated with 65% of all bacterial infectious diseases in humans, according to the Centers for Disease Control and Prevention¹.

Autoclaves and disinfectants such as chlorine have generally been used for the inactivation of biofilms. However, the use of an autoclave is limited for surfaces that can neither withstand high temperature steam nor be placed into the autoclave. Disinfectants are not suitable for surfaces sensitive to chemical treatment or prone to collecting toxic oxidation products². In addition, the biofilm should not only be inactivated, but also removed in order to prevent the attachment of new cells onto the surface, thereby forming a new biofilm³. However, it is difficult to remove biofilms using methods based on viscous fluid shear because the flow velocity near the surface is almost zero and the shear force usually cannot overcome the adhesive forces of micron- and submicron-sized substances. Moreover, the biofilm matrix is known to act as a physical and chemical barrier¹.

Many physical and mechanical techniques have been developed to remove biofilms from surfaces, including ultrasonic vibration¹, electric currents⁴, laser irradiation⁵, and high-pressure water sprays⁶. Each technique has its own pros and cons. Ultrasonic vibration and electric current can be used to control biofilm formation; however, they require a particular configuration and conductive surfaces, respectively, requiring additional shear stress^{1, 4}. Laser irradiation can be applied to a limited area and to hard surfaces; however, some live and dead cells remain on the surface⁵. High-pressure water sprays effectively remove biofilms; however, their high momentum can cause damage to soft substrates⁶.

Biofilm removal using CO₂ aerosols has been previously proposed. It has shown promising results, with high removal efficiencies within a short time^7-11. CO₂ aerosols are generated by adiabatic expansion of a high-pressure CO₂ gas through a nozzle, and they are applied to the surfaces contaminated with a biofilm. This cleaning technique utilizes the momentum transfer of solid CO₂ particles and the solvent action of the melted CO₂ liquids, followed by the aerodynamic shear force of the CO₂ gas¹². Compared with high-pressure N₂ gas jets, CO₂ aerosol jets at the same stagnation pressure are much more effective in removing E. coli biofilms⁷. Moreover, although the momentum of the solid CO₂ that is delivered to the bacteria is considerably high, the momentum of the total aerosol jet applied to the solid surface is substantially lower than that of water jets. Therefore, damage-free cleaning is possible using this CO₂ aerosol technique.

In this protocol, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from a polished stainless steel surface. In fact, nitrogen purges have been used in many CO₂ aerosol studies to increase the removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning, even though heating with a hot plate or infrared lamps and employing dry boxes have also been adopted¹². The surface biofilm formation and the optimized cleaning procedures are described below. The removal efficiency was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm on the surface.

Protokoll

1. Vorbereitung der Oberfläche für die Bildung von Biofilmen

1. Cut 1 mm dicken 304 Edelstahlplatten in Chips (10 × 10 mm ²⁾ mit einem mechanischen Schneider.
2. Führen Ultraschallreinigung der Chips in Aceton, Methanol und deionisiertem (DI) Wasser nacheinander für jeweils 10 min. Verwenden, um einen lösungsmittelbeständigen Behälter, die aus Substanzen wie Glas, organische Verunreinigungen zu entfernen.
3. Spülen Sie die Chips mit DI-Wasser für 3-5 sec fließt.
4. Trocknen Sie die Chips N ₂ Gasfluss für 3-5 sec verwenden.

2. Herstellung der Bakterien-Kultur

1. Nehmen Sie einen P. putida KT2440 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Südkorea) Lager gelagert in einem -80 ° C Gefrierschrank.
2. Tauen Sie nach 1 min bei Raumtemperatur und die obere Schicht der gefrorenen Stammlösung wird zu Matsch. Tauchen Sie eine Schleife in die geschmolzene Schicht der Stammlösung.
3. Verwenden Sie diese Schleife zu Streifen, die Bakterien auf eine Luria-Bertani (LB) Platte, die 1,5% Agar.
4. Die Platte über Nacht bei 30 ° C, um die Bakterienkolonien wachsen.
5. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte eine frische Schleife.
6. Beimpfen von 10 ml LB-Brühe in einem 50 ml konischen Röhrchen mit der Schleife die einzelnen Bakterienkolonie enthält.
7. Inkubieren Sie die Brühe in einem Schüttel-Inkubator für 16 Stunden bei 30 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute.

3. Bildung von Biofilmen auf der Oberfläche

1. Pick-up jeder der hergestellten Chips mit einer Pinzette und tauchen sie in 70% Ethanol 5 mal für 1-2 sec je, um die Oberfläche jedes Chips zu sterilisieren. Stellen Sie sicher, dass die Chips mit einer Pinzette während des Eintauchens gehalten werden.
2. Tauchen Sie jeden Chip in autoklavierten DI-Wasser und in LB-Brühe sequentiell, 5-mal für 1-2 sec je, um die verbleibenden Ethanol zu entfernen.
3. Legen Sie diese Chips in 6-Well-Kulturplatten mit 2 Chips und 5 ml LB-Medium pro Vertiefung.
4. Verdünne die Bakterienkultur, bis die Konzentration in der LB-Brühe Lauf8 × 10 ⁸ Zellen / ml (optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge: ~ 0.8).
5. Impfen jede Vertiefung mit 50 ul der verdünnten Bakterienkultur.
6. Inkubiere die Platten bei 30 ° C ohne von Biofilmen für 24 h zur Bildung Schütteln.

4. CO ₂ Aerosol Reinigung

1. Tauchen Sie die Biofilm-gebildeten Chips in 10 mM Ammoniumacetat-Puffer (flüchtig) 5-mal zu entfernen lose befestigt und planktonischen Bakterien.
2. Trocknen Sie diese Chips in einem Bio-Sicherheitsschrank, wo die Luft mild fließt.
3. Unmittelbar nach dem Trocknen, stellen einen Chip auf dem Ladeplatz, der sich entlang der Achse des Strahls 20 mm von der Düse CO ₂ ist. Kippen Sie die Strahlachse auf einen Winkel von 40 °.
4. Stellen Sie die Staudrücke von CO ₂ und N ₂ -Gas auf 5,3 MPa und 0,7 MPa bzw. Gasdruckregler verwendet wird .
5. Wenden Sie den Aerosolstrahl auf den zentralen Teil des Chips. Weiß Aerosole einschließlich der festen CO ₂ solltesichtbar sein. Schalten "auf" das Magnetventil für CO ₂ für 5 Sekunden, und schalten Sie es "off" für 3 sec (Zyklus: 8 sec) in regelmäßigen Abständen einen manuell gesteuerten Schalter. Wenn eine Stickstoff - Spülung verwendet werden muss, schalten das Magnetventil für eine kontinuierliche Zufuhr von N _2.
6. Behandeln Sie die Chips mit CO ₂ Aerosole für 16, 40 und 88 sec mit und ohne Stickstoffspülungen. Bewahren Sie Chips ohne Behandlung als negative Kontrollen.

5. Analyse für Abscheideleistung

1. Bereiten 1 uM grüne Fluoreszenz Nukleinsäurefarbstoff (Anregungs- / Emissionswellenlänge: 480/500 nm) in DI-Wasser zu Bakterienzellen an der Steuerung und Aerosol behandelten Späne färben.
2. Legen Sie die Chips in der Färbungslösung.
3. Inkubieren der Chips in einem Inkubator ohne Licht bei 37 ° C für 30 min.
4. Im Anschluss an die Inkubation spülen Sie vorsichtig die Chips mit DI-Wasser fließt übermäßige fluoreszierenden Farbstoff zu entfernen.
5. Trocknen Sie die Chips with N ₂ Gasstrom.
6. Nehmen Sie fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von 5 zufällige Sichtfelder (321 × 240 & mgr; m ²⁾ für jeden Chip ein Epifluoreszenz - Mikroskop mit einer 40 - fach Objektivlinse und einer CCD - Kamera.
7. Besorgen Sie sich die Fluoreszenzintensität für jedes Bild eine Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ. In ImageJ und nutzen die "Subtract Background" -Funktion im Menü "Bearbeiten" und wählen Sie "Integrierte Dichte" in der "Set Messungen" Fenster in der "Analyse" -Menü. Haben die "Messung" im "Analyze" Menü, um die Fluoreszenzintensität zu erhalten.
8. Berechnen Sie die Biofilmentfernungseffizienz nach der folgenden Formel: 100% × (I Kontrolle Chips - ich der behandelten Chips) / (I von Kontroll - Chips), wo ich die berechneten Fluoreszenzintensität ist.
9. Besorgen Sie sich die durchschnittliche Abscheidegrade und Standardabweichungen. Verwenden Sie beimindestens 4-Chips für jeden Fall.

Ergebnisse

CO ₂ Aerosole wurden verwendet , um die zu entfernen , P. putida Biofilme aus SUS304 Flächen (Abbildung 1). Die meisten der Oberflächen wurden mit dem Biofilm nach 24 h Wachstum bedeckt. Der größte Teil des Biofilms wurde mit der CO ₂ Aerosole (Abbildung 2) entfernt. Wie erwartet, 3 zeigt einen Anstieg der Biofilm - Entfernungseffizienz als die erhöhte Aerosolbehandlungszeit CO _2. Für die Behandlungszeit von 88 sec wurde d...

Diskussion

Previously, we conducted optimization studies on CO₂ gas pressure, jet angle, and distance to the solid surface in CO₂ aerosol cleaning⁷. Unlike our previous studies, in the present study, a nitrogen purge was not included in the aerosol (Figure 1). Moreover, 304 stainless steel was used in this protocol, since it is one of the most common stainless steels and is widely used in the food industry. The polished surface is beneficial for fluorescence analysis because of a un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
304 stainless steel	Steelni (South Korea)		Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner	Branson (USA)	5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company (USA)	244620	500 g
Agar	Becton, Dickinson and Company (USA)	214010	500 g
6-well culture plate	SPL Life Sciences (South Korea)	32006
Ammonium acetate buffer	Sigma-Aldrich (USA)	667404	10 mM
Dual gas unit	Applied Surface Technologies (USA)	K6-10DG	One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas
SYTO9	Thermo Fissher Scientific (USA)	Invitrogen	Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope	Nikon (Japan)	Eclipse 80i
40X objective lens	Nikon (Japan)	Plan Fluor	NA: 0.75
CCD camera	Photometrics (USA)	Cool SNAP HQ2	Monochrome