Vein Interposition Modell: ein geeignetes Modell zur Untersuchung Bypass Graft Durchgängigkeit

Zusammenfassung

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Zusammenfassung

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

Einleitung

Koronare Herzerkrankungen und deren Komplikationen gehören zu den führenden Todesursachen weltweit. Aktuelle Therapiestrategien konzentrieren sich auf die Wiederherstellung des Blutflusses, entweder durch die verengte Gefäß dilating oder durch einen Bypass zu schaffen. Koronaren Bypass-Operation (CABG) Venentransplantaten wurde erstmals im Jahr 1968 beschrieben und wurde im Laufe der Jahre verfeinert. Abgesehen von der Revaskularisierung des linken vorderen absteigenden Koronararterie, Vena saphena Leitungen werden am häufigsten ¹ verwendet. Allerdings bleibt Graft Durchgängigkeit die Achillesferse der Vena saphena-Transplantate (SVG). Ein Jahr nach der Operation, ist Graft Durchgängigkeit 85% und fiel auf 61% nach zehn Jahren ^2,3. Die Enthüllung der pathophysiologischen Mechanismen und Ursachen für den Verlust SVG Durchgängigkeit ist daher eine wichtige Aufgabe.

Dieses Video zeigt eine Ratte Vene Zwischen Modell Venentransplantatverlust zu untersuchen. Die allgemeinen Ziele dieser Methode sind die zugrunde liegenden pathobiologischen zu erkundenund Physiologische Prozesse während der Krankheitsprogression und ein geeignetes Modell für Arzneimittel oder therapeutische Option Tests zu entwickeln. die V. epigastrica superficialis in das arterielle System, dieses Modell ahmt die klinische Einstellung der koronaren Bypass-Operation durch Transplantation. Chirurgische Trauma, Ischämie und Wandspannung sind wichtige Auslöser der pathologischen Gefäßveränderungen und werden im Modell beschrieben nachgeahmt.

Verschiedene Modelle und Arten sind vorhanden Venentransplantat Durchgängigkeit Verlust zu untersuchen. Großtiermodellen, wie Schweine ^4, Schafe ^{5, 6} Hunden und Affen ⁷ ähneln menschlichen Gefäßes und anatomischer Strukturen und so komplexe therapeutische Strategien, wie beispielsweise Bypass - Stenting oder neue chirurgische Techniken zu ermöglichen, werden ⁸ getestet. Allerdings spezielles Gehäuse, Ausrüstung und Personal erforderlich sind. Darüber hinaus hohe Kosten und die Notwendigkeit für eine zusätzliche Anästhesist während eines chirurgischen Eingriffs zu behindern ihre breitere Anwendung. Smalle Tiere, einschließlich Ratten, sind einfach nicht spezielles Gehäuse zu handhaben, benötigen, und haben überschaubaren Kosten. Im Vergleich zu Maus - Modellen ^9,10 haben Rattenmodelle den Vorteil der besseren Handhabbarkeit und damit weniger Variabilität in den Ergebnissen. Ratten sind physiologisch und genetisch ähnlich wie beim Menschen als Mäuse ^11,12. Zudem sind die meisten Wildtyp - Mäusen entwickeln nur begrenzte myointima ^13, die Mausmodelle machen anfällig II Fehler zu geben. Die Histologie der Hauptmaus Venen, wie die inferior vena cava, besteht nur aus wenigen Zellschichten und rendert frühzeitige Bewertung schwierig ^13. Ein weiterer Nachteil ist die geringe Menge an Gewebe für eine nachfolgende Analyse nach Graft Genesung.

Das Modell in diesem Video beschrieben ist reproduzierbar, kostengünstig und einfach durchzuführen, und es kann schnell und zuverlässig hergestellt werden. Es eignet sich besonders für teure experimentelle therapeutische Mittel, wie virale Vektoren Auswertenfür die Gentherapie, in wirtschaftlicher Weise.

Protokoll

Die Tiere erhielten humane Pflege im Einklang mit dem Leitfaden für die Grundsätze von Labortieren, hergestellt durch das Institut für Labortierressourcen und durch die National Institutes of Health veröffentlicht. Alle Tier Protokolle wurden von der zuständigen Behörde ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz) Hamburg") zugelassen.

1. Animal Care

1. Erhalten Lewis-Ratten (LEW / GRL) Ratten und ROSA / Luciferase-LEW transgenen Ratten 300-350 g vom Institut für Labortiere wiegen.
2. Halten Sie die Ratten unter üblichen Bedingungen in belüfteten Schränken und füttern sie Standard-Rattenfutter und autoklaviert Wasser ad libitum.
3. Führen Sie eine Graft-Transplantation die ROSA / Luciferase-LEW transgenen Ratten als die Spender und die syngenen LEW / Crl Ratten als Empfänger verwendet wird.

2. Herstellung des Donor-Ratte

1. Verwenden Sie ein inductIonenkammer eine Ratte mit Isofluran (2,5-3%) zu betäuben.
2. Legen Sie die Ratte auf den Rücken und halten die Anästhesie mit einer Gesichtsmaske für den Mund und Nase. Achten Sie auf ausreichende Narkosetiefe durch die Hinterfüße Kneifen und Überprüfung der Abwesenheit von Reflexen. Tragen Sie etwas Tierarzt Salbe in die Augen Trockenheit zu verhindern, während der Narkose.
3. Verbreiten Sie die Hinterbeine und fixieren ihre Position Klebeband.
4. Rasieren Sie den Leisten Haare mit einem Haarschneider und desinfizieren Sie die gesamte Fläche mit Povidon-Iod, gefolgt von 80% Ethanol. Wiederholen Sie den Desinfektionsschritt zweimal.
   HINWEIS: Der OP-Bereich, Gaze und chirurgische Instrumente sollten sterilisiert werden. Halten Sie einen sterilen Bereich während des gesamten Verfahrens und tragen Einweg, sterile OP-Handschuhe, Masken und Kappen.
5. Unter einem Mikroskop, einen vertikalen Schnitt entlang der linea inguinalis zuführen. Verwenden Sie zwei Pinzette vorsichtig die subkutanen Gewebe trennen und die V. epigastrica superficialis von seinem ori aussetzenGin auf die Oberschenkelvene. Sorgfältig isolieren die V. epigastrica superficialis aus den umliegenden Geweben.
6. Stopp des Blutflusses in der oberflächlichen Vene epigastric unter Verwendung von zwei Mikroschellen.
7. Ernte eine etwa 0,5 bis 1 cm-Segment der Vene durch vorsichtiges die isolierte Ader mit einer Pinzette Heben und Schneiden durch das Gefäß mit Mikroscheren. Lassen Sie die Mikroklammern auf dem Schiff Stumpf den Blutverlust zu verhindern. Legen Sie die entnommene Stück Vene auf steriler Gaze. eine 30-G-Nadel innerhalb eines Endes des geernteten Vene vorsichtig platzieren und das Gefäß mit Heparin (50 Einheiten / ml) spülen.
   HINWEIS: Behandeln Sie die Vene mit Sorgfalt und Vermeidung von Schäden beim Heben, Schneiden und Spülung. Stellen Sie sicher, das Transplantat mit der richtigen Menge an Heparin zu spülen.
8. Halten Sie das Gefäßsegment in 1% Lidocain auf Eis bis zur Transplantation in den Empfänger Ratte einen Gefäßspasmen zu verhindern.
9. Euthanize die Spender Ratte nach der Anästhesie bis 5% Isofluran erhöht. Nach 2-3 min, open den Bauch entlang der linea alba, schneiden durch die Membran, und entfernen Sie das Herz-Kreislauf zu stoppen.

3. Vorbereitung der Empfängerratte

1. Anästhesieren und die Empfängerratte in der gleichen Weise wie der Spenderratte fixieren.
2. Rasur die mediale Seite der Schenkel mit einem Haarschneider und desinfizieren dreimal mit Povidon-Jod und 80% Ethanol.
3. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie und sicherzustellen, dass es durch die Überprüfung das Fehlen von Reflexen ausreichend ist, wenn die Hinterfüße Kneifen.
4. Führen Sie eine mittlere Oberschenkel Schnitt vom Knie bis zur Leistenbeuge. Unter dem Mikroskop benutzen 2 Zange die Femoralarterie von der Umgebung zu trennen.
5. Verwenden Sie Mikro Klammern um den Blutfluss zu stoppen. Legen Sie die proximale Klemme zuerst durch die distale Klammer gefolgt.
6. Schneiden Sie ein kurzes Segment der geklemmten Femoralarterie mit Mikroschere aus und entsorgen. Verkürzen Sie die verbleibenden arteriellen Stumpf mit Mikroschere, eine Lücke zu schaffen, ist1-2 mm größer als die Vene Graft. Spülen Sie den arteriellen Stumpf mit Heparin eine 30 G Nadel.
   HINWEIS: Wenn die Adventitia geringfügig über den Gefäßstumpf ragt, Zangen verwenden Sie es über das Ende des Schiffes leicht zu ziehen und ein Stück entfernen.
7. Legen Sie die geernteten Vene aus Schritt 2.8 zwischen den arteriellen Stümpfe und die Länge so einstellen, dass sie in geeigneter Weise in den Spalt passt. Beachten Sie die Richtung der Vene.
8. Führen Sie die proximale Anastomose zuerst eine 10-0 Prolene Naht verwendet wird. Führen Sie einzelne Stiche in der angegebenen Reihenfolge (Abbildung 1D). Beginnen mit einer Naht auf jeder lateralen Seite, bevor sie auf der Bauchseite drei Fäden hinzugefügt wird. Danach legen drei Maschen auf der dorsalen Seite des Schiffes die Anastomose zu vervollständigen.
9. Verbinden Sie die distale Gefäße mit dem Transplantat mit der gleichen Technik wie für die proximale Anastomose beschrieben in Schritt 3.8. Wieder mit einer Naht auf jeder Seite beginnen und dann auf der ventralen sid drei Nähte platzierene und der dorsalen Seite.
10. Legen Sie zwei 1-ml-Spritzen mit Fibrinkleber Komponente 1 und 2. Heben Sie vorsichtig das Transplantat mit einer Pinzette und fallen etwa 100 ul Fibrinkleber Komponente 1 unter dem Transplantat, gefolgt von Komponente 2.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Komponenten 1 und 2 in einem 1 angewendet werden: 1-Verhältnis.
11. Legen Sie das Transplantat wieder in seine Position und fallen weitere 100 & mgr; l der Komponenten 1 und 2 auf der Oberseite des Transplantats. Achten Sie darauf, dass der Klebstoff sowohl das Transplantat und die Anastomose abdeckt, um Anastomoseninsuffizienzen und Überdehnung der Vene Transplantat zu verhindern.
12. Öffnen Sie vorsichtig die distale Klammer, durch die proximalen gefolgt.
13. Bestätigen einer erfolgreichen Operation durch einen sichtbaren Impuls in der transplantierten Vene und Arterie distal des Transplantats zu überprüfen.
14. Überschüssiges Klebstoff, der Hautverschluss verhindert. Verwenden einer Pinzette, um das gehärtete Klebstoff zu heben und den Überschuss mit Mikroschere entfernen. Schließen Sie die Hautschichten mit 5-0 Prolene Fäden.
15. Injizieren 4-5 mg / kg Carprofen subkutan, bevor der Ratte zu wecken. Nicht das Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Halten Sie das Tier in einem Käfig, bis es vollständig zurückgewonnen wird.
16. In Metamizol dem Trinkwasser (50 mg Metamizol pro 100 ml) als Schmerzmittel für die folgenden 3 Tage und überwachen täglich das Tier.

4. Duplex-Sonographie

HINWEIS: Verwenden Sie duxplex Sonographie Blutfluss nicht-invasiv in Ratten ¹⁴ sichtbar zu machen.

1. Betäuben eine Ratte in einer Induktionskammer (Isofluran 2%). Legen Sie die Ratte auf den Rücken und halten Anästhesie mit einer Gesichtsmaske bedeckt die Nase.
2. Verwenden Sie Haarschneidemaschinen und Enthaarungscreme die Haare um den Bereich des Oberschenkels zu entfernen.
3. Bewerben Ultraschall-Gel auf den Oberschenkel. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen. Erwerben Duplexsonographie Bilder eine MS 400 Wandler mit (Mittenfrequenz: 30 MHz) mit einer Bildrate von 230 bis 400 Bilder / Sek.

5. Histopathologie

HINWEIS: Ernte und färben das Gefäß mit Masson Trichrom Färbung für morphometrische Analyse ^15.

1. Befestigen Sie das entnommene Gefäß in 4% Paraformaldehyd über Nacht und entwässern es in Konzentrationen von Ethanol zu erhöhen. Einbetten der Probe in Paraffin und schneiden Sie es in 5 & mgr; m dicke Scheiben mit einem Mikrotom.
   HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig und sollte mit besonderer Sorgfalt behandelt werden.
2. Entparaffinieren Dias vor ihnen mit Trichromfärbung Lösung Färbung. Entwässern die gefärbten Objektträger, deaktivieren Sie sie mit Xylol und montieren sie Medium bei der Montage. Nachdem die Folien Trocknen sehen Sie die Proben mit einem Mikroskop.

6. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI)

HINWEIS: Die postoperative Transplantat wurde im Laufe der Zeit in vivo verfolgt durch Biolumineszenz - Messsignal ¹6.

1. Man löst 1 g D-Luciferin-Kaliumsalz in 22 ml PBS und injizieren sie intraperitoneal in der Ratte (375 mg / kg Körpergewicht). Warten Sie 15 min für das Luciferin in dem Tier zu zirkulieren.
2. Legen Sie die Ratte in einer Echtzeit-Biolumineszenz-Quantifizierungssystem und auf das Biolumineszenz-Signal.

Ergebnisse

Die Ratte Vene Zwischen Modell geeignet ist, die Entwicklung von myointima Hyperplasie und Venentransplantatversagen zu untersuchen. Tiere erholen gut von der Operation und zeigen eine hervorragende körperliche Verfassung nach der Operation. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Operationsschritte. Nach dem Hautschnitt entlang der linea inguinalis sind die epigastric oberflächliche Vene und Arteria femoralis (Abbildung 1A) identifiziert. Ernten des Transplantats sollte sorgfältig durchge...

Diskussion

Dieses Video zeigt eine Ratte Vene Zwischen Modell Venentransplantatverlust zu untersuchen und für die Erforschung der zugrunde liegenden pathologischen Prozesse und die Erprobung neuer Medikamente oder Therapieoptionen zu ermöglichen.

Anästhesie ist ein entscheidender Aspekt der chirurgischen Verfahren. Eine kontinuierliche inhalative Anästhesiesystem wird empfohlen, da dies eine sichere und einfache Methode ist, vor allem bei längeren Operationen. Dies kann während der Trainingsphase...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment