Cefoperazon behandelten Maus-Modell der klinisch relevanten<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Dehnungs R20291

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Cefoperazon Maus - Modell von Clostridium difficile - Infektion (CDI) eine klinisch relevante und genetisch-lenkbar - Stamm verwenden, R20291. Schwerpunkt auf der klinischen Krankheitsüberwachung, C. difficile Bakterien-Enumeration, Toxin Zytotoxizität und histopathologischen Veränderungen im gesamten CDI in einem Mausmodell werden im Protokoll aufgeführt.

Zusammenfassung

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Einleitung

Clostridium difficile ist ein anaerob, grampositive, sporenbildenden Bazillus, der lebensbedrohlichen Durchfall ¹ verursacht. C. difficile - Infektion (CDI) ist mit einer erhöhten menschlichen Morbidität und Mortalität und die Ergebnisse in mehr als $ 4,8 Mrd. Kosten für das Gesundheitswesen pro Jahr ^1-4 verbunden. Im Jahr 2013, kategorisiert die Centers for Disease Control and Prevention C. difficile als dringende Antibiotikaresistenz Risiko, was darauf hinweist , dass es eine dringende Gefahr für die öffentliche Gesundheit ¹ darstellt. Derzeit Antibiotika - Behandlung mit Vancomycin und Metronidazol sind die Standardbehandlung für CDI ⁵ betrachtet. Leider ist Rezidiv von CDI nach erfolgreicher Behandlung mit Antibiotika hoch, in 20 auftretenden - ^2,5-7 30% der Patienten. Deshalb ist die Entdeckung neuer Therapeutika gegen diese magensaftresistente Erreger notwendig. Zur Beurteilung Therapeutika gegen C. difficile, einem Tiermodell der Krankheit beim Menschen in ac annähertlinically relevante Belastung benötigt wird.

Zunächst wurden Koch-Postulate für C. difficile im Jahr 1977 mit einer Clindamycin-behandelten syrischen Hamstermodell ⁸ etabliert. Dieses Modell wird auch heute noch verwendet auf Pathogenese ^9,10 , die Auswirkungen von C. difficile Toxine zu untersuchen. Allerdings CDI im Hamstermodell führt zu einer hohen Sterblichkeit und nicht die chronische heimtückische Krankheit Manifestationen nähern , die bei Menschen mit CDI ^10,11 gesehen werden kann. Auf der Grundlage der Zugänglichkeit und Verfügbarkeit von Reagenz murine Plattformen in Forschung, ist ein Mausmodell der CDI relevant.

Im Jahr 2008 wurde mit einem Antibiotikum - Cocktail durch Behandlung von Mäusen eine robuste Mausmodell der CDI etabliert im Trinkwasser (Kanamycin, Gentamicin, Colistin, Metronidazol und Vancomycin) für 3 Tage , gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von Clindamycin ^12. Dies machte Mäuse anfällig für CDI und schwere Colitis. Abhängening auf der Inokulum Dosis verabreicht werden, können eine Reihe von klinischen Anzeichen und Letalität beobachtet werden dieses Modell. Seit dieser Zeit haben sich verschiedene Antibiotika - Anwendungen untersucht worden, die die murinen Darmmikrobiota verändern, Kolonisationsresistenz bis zu dem Punkt abnimmt , wo C. difficile den Magen - Darm - Trakt besiedeln können ( beschrieben in Best et al. Und Lawley & Young) ^13,14.

In jüngster Zeit ein breites Spektrum Cephalosporin, Cefoperazon, rendert in dem Trinkwasser gegeben für 5 oder 10 Tage reproduzierbar Mäuse anfällig für CDI ^15. Da die Verabreichung von Cephalosporinen der dritten Generation mit einem erhöhten Risiko von CDI beim Menschen assoziiert sind, reflektiert Verwendung des Cefoperazon Modell genauer natürlich vorkommenden Krankheits ^16. Cefoperazon behandelten Mäuse anfällig für C. difficile wurden sowohl mit C. difficile - Sporen und vegetativen Zellen von einer Vielzahl von Stämmen Bereich in Frage gestellt worden klinischenRelevanz und Virulenz ^17. Trotz einiger der ursprünglichen Studien C. difficile vegetativen Zellen als infektiöse Form verwendet werden C. difficile - Sporen die wichtigste Übertragungsart ¹⁸ betrachtet.

In den letzten zehn Jahren, C. difficile R20291, ein NAP1 / BI / 027 - Stamm hat, entstanden Epidemien von CDI ^19,20 verursacht. Wir versuchten , den klinischen Verlauf der Erkrankung zu bestimmen , wann Cefoperazon-behandelten Mäusen mit klinisch relevanten und genetisch tractable C. difficile - Stamm, R20291 herausgefordert wurden. Dieses Protokoll beschreibt die klinischen Verlauf, einschließlich Gewichtsverlust, bakterielle Kolonisation Toxin - Zytotoxizität und histopathologische Veränderungen im Gastrointestinaltrakt von Mäusen , die mit C. difficile - Sporen R20291 in Frage gestellt. Insgesamt erweist sich dieses Mausmodell eine wertvolle experimentelle Plattform für CDI annähert Krankheit beim Menschen zu sein. Dieses gekennzeichnet Mausmodell kann somit genutzt werden, um die Auswirkungen zu beurteilenneuartiger Therapeutika auf der Verbesserung der klinischen Erkrankung und über die Wiederherstellung der Kolonisierung Widerstand gegen C. difficile.

Protokoll

Ethische Erklärung:
Die Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) genehmigt diese Studie. Die NCSU Animal Care und Use Policy gilt Normen und Richtlinien , die in der Tierschutzgesetz und Gesundheitsforschung Extension Act von 1985 Labortieranlagen in NCSU her für die Pflege und Verwendung von Labortieren im Leitfaden auf Richtlinien halten. Das Tiergesundheitsstatus wurden täglich bewertet und sterbender Tiere wurden artgerecht von CO ₂ Ersticken gefolgt von Sekundärmaßnahmen eingeschläfert. Ausgebildete Tierpfleger oder ein Tierarzt durchgeführt Tierhaltung in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung während dieser Studie.

1. Gabe des Antibiotikums Cefoperazon in Trinkwasser zu erreichen Empfänglichkeit für C. difficile Kolonisation und Erkrankung

HINWEISE: 5- bis 8 Wochen alte C57BL / 6-WT-Mäuse (Frauen und Männer)vor Beginn der Antibiotika Wasser Verabreichung wurden gekauft und für 1 Woche unter Quarantäne gestellt. Nach der Quarantäne wurden die Mäuse mit autoklaviert Essen, Bettzeug und Wasser untergebracht. Cage Änderungen wurden in einer Laminar-Flow-Haube wöchentlich durch Laborpersonal durchgeführt.

1. Bereiten Sie Cefoperazon (0,5 mg / ml) in sterilem destilliertem Wasser 7 Tage vor dem Ziel Tag der Herausforderung (Abbildung 1).
2. Füllen autoklaviert Wasserflaschen mit Cefoperazon Wasser (0,5 mg / ml) und legen Sie sie in jeder Maus Käfig.
   HINWEIS: Frisch zubereitete Cefoperazon Wasser sollte aus während einer 5-Tage-Frist alle 2 Tage gemacht und verändert werden, wie in den Schritten bezeichnet 1.1 und 1.2. Die ordnungsgemäße Entsorgung von Cefoperazon Wasser folgende institutionelle Umwelt, Gesundheit und Sicherheit Richtlinien empfohlen.
3. Nach 5 Tagen auf Cefoperazon Wasser, ersetzen Sie die Flaschen mit autoklavierten Wasserflaschen mit sterilem destilliertem Wasser gefüllt. Geben Mäuse dieses Trinkwasser für die Dauer des Experiments.

2. Herstellung der C. difficile Spore Inokulum und die orale Gabe der Mäuse

HINWEIS: Vor dem Beginn sicher, dass die folgenden Elemente in der anaeroben Kammer platziert sind mindestens 24 h: 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; siehe Materialien), taurocholate cycloserine Cefoxitin Fructose-Agar (TCCFA) Platten (siehe Materialien und die zusätzliche Datei ) und eine sterile L-förmigen Spreader.

HINWEIS: Die Mäuse mit C. difficile - Sporen in Frage sollte in einem Biosafety Level 2 Tieranlage untergebracht werden.

1. Besorgen Sie sich eine C. difficile Spore Bestand an den gewünschten Stamm (in diesem Fall, R20291) , die zuvor wurde hergestellt und gelagert bei 4 ° C in sterilem Wasser ^21,22. Bestimmen Sie die Aufzählung dieser Spore Lager vor der Verwendung.
2. Auf der Basis der bekannten Konzentration (Sporen / ml) des Sporen Lager, berechnen die gewünschte Verdünnung 10 & ^sup5 ; Sporen pro 25 & mgr; l zu erhalten. Stellen Sie sicher, ist das Inokulum Volumen ausreichend alle zu impfenMäuse im Experiment (25 & mgr; l pro Maus), die Aufzählung der Impfkultur (ca. 30 & mgr; l) durchzuführen, und zum Pipettieren Fehler zu berücksichtigen.
3. Vortex die ursprüngliche difficile Spore Lager C. Dann resuspendieren das berechnete Volumen (aus Schritt 2.2) des ursprünglichen C. difficile Spore Lager in sterilem Wasser in einem Schraubdeckelröhrchen Reaktionsgefäß. Führen Sie diese aerob in einer laminaren Strömung Haube. Identifizieren Sie diese verdünnte Gemisch als "Spore Inokulum."
4. Legen Sie die Spore Inokulum in ein 65 ° C Wasserbad und erhitzen Sie es für 20 Minuten.
   HINWEIS: Dieser Schritt wird sichergestellt , dass nur aktive C. difficile - Sporen bleiben nach der Wärmebehandlung.
5. Innerhalb der Laminar - Flow - Haube, nehmen 50 ul erhitzten Spore Inokulum, legen Sie sie in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen, und gibt sie in den anaeroben Kammer ^23. Verwenden Sie dieses Beispiel für Spore-Enumeration.
6. Innerhalb der Laminar-Flow-Haube, legen Sie die restlichen erhitzten int Spore Inokulumoa 1-ml-Spritze in eine sterile Glühbirne bestückte Magensonde Nadel befestigt. Nutzen Sie eine manuelle Spritze Schritt genaue und schnelle Wiederholung, um sicherzustellen, zwischen Mäusen Dosierung. Stellen Sie sicher, dass die Sondennadel mit dem erwärmten Spore Inokulum vor Gebrauch gefüllt ist.
   HINWEIS: Eine neue sterile Sondennadel für jede Maus ist nicht erforderlich. Wenn verschiedene Dosen von C. difficile - Sporen verabreicht werden, jedoch eine neue Sondennadel wird für jede Dosis empfohlen.
   HINWEIS: C. difficile - Sporen sind sehr resistent gegen herkömmliche Desinfektionsmittel. Daher ist die Verwendung eines Desinfektionsmittels sporiziden, wie # 62 Perisept Sporicidal Desinfizierende, notwendig. Der Hersteller empfiehlt eine 2-min Kontaktzeit C. difficile - Sporen zu zerstören.
7. Schlundsonde jede Maus mit 25 ul der Sporen Inokulum. Zurückhalten jede Maus sanft durch das Tier durch die lose Haut des Halses zu erfassen und zurück, um den Kopf zu immobilisieren. Mit immobilisieren den Zeigefinger weiter den Kopf des Tieres und zulänglich die Speiseröhre. Stellen Sie sicher, dass das Tier vocalize nicht oder zeigen andere Anzeichen von Stress während der Zurückhaltung.
   HINWEIS: Das Gesamtvolumen an Mäuse mit der Schlundsonde gegeben sollte 10 ml / kg Körpergewicht nicht überschreiten (0,1 ml / 10 g).
8. Pflegen Sie die Maus in einer aufrechten, vertikalen Position und sanft die Schlundsonde Nadel in die Seite des Mundes passieren. Leiten die Sondennadel entlang dem Dach des Mundes und langsam die Sondennadel in die Speiseröhre gelangen.
   HINWEIS: Wenn ein Widerstand angetroffen wird, kann die Sondennadel in die Trachea eintreten und somit nicht vorangetrieben werden sollte, sondern entfernt und sofort neu positioniert.
9. Nachdem die Sondennadel etwa zur Hälfte in die Speiseröhre ist, 25 & mgr; l der erhitzten Sporen Inokulum injizieren und sanft die Sondennadel aus der Speiseröhre zurückziehen.
   HINWEIS: Forceful Weiterentwicklung der Schlundsonde Nadel kann zum Bruch der Speiseröhre oder des Magens. Deshalb, wenn Widerstand gestoßen ist, wenn die Sondennadel fortIst es am besten sofort zu entfernen und die Sondennadel neu positionieren.
10. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig und beobachten es für jeden Husten oder Anzeichen von Atemnot, da dies eine unbeabsichtigte tracheale Verabreichung oder Aspiration des erhitzten Spore Inokulum hinweisen.
    HINWEIS: Die Mäuse sind extrem anfällig für C. difficile folgende Antibiotika - Behandlung; Daher Vorsichtsmaßnahmen Kreuzkontamination zu verhindern, zwischen den Käfigen wesentlich ist. Dies ist besonders wichtig, wenn Antibiotika behandelt, aber unchallenged Mäusen als Kontrollen zu verwalten.
11. Nachdem alle Mäuse Impfen, legen Sie die restlichen erhitzte Spore Inokulum in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und in die anaerobe Kammer für Spore Aufzählung passieren.
12. Eine Aufzählung der erwärmten sporen Inokulum (aus Schritt 2.4) und die verbleibende eine Sonde erhitzt sporen Inokulum, stellen 01.10 serielle Verdünnungen jeder Inokulum in 1x PBS. Es wird empfohlen , zu machen , und die Platte 4 - 5 Verdünnungen (dh 10 ^-1 bis10 ^-5).
13. Unter aseptischen Bedingungen übertragen 100 ul jeder Reihenverdünnung auf eine einzelne TCCFA Platte.
14. Mit einem sterilen L-förmigen Spreizer, gleichmäßig verteilt, die auf das Medium über die Platte aufgetragen Verdünnung. Selbst des verdünnten Inokulums Ausbreitung ist für die genaue Zählung von Sporen.
15. Inkubiere die Platten anaerob für 24 Stunden bei 37 ° C. Nach 24 Stunden C. difficile koloniebildenden Einheiten (KBE) können die Infektionsdosis an Mäuse in den 25 & mgr; l (0,025 ml) Volumen (siehe die ergänzende Datei "Beispielrechnungen") verabreicht zu erhalten aufgezählt werden. C. difficile Kolonien sind flach und hellgelb und haben unregelmäßige Kanten und eine Masseglasoptik ^24.
    HINWEIS: Die Nachweisgrenze für bakterielle Aufzählung ist 10 ² CFU.

3. Überwachung Maus Gewichtsverlust und klinischen Anzeichen einer Krankheit in ganz C. difficile - Infektion

1. Wiegen einnimals vor und nach der 5-tägigen Cefoperazon antibiotischen Behandlung, nach der Wiederherstellung 2-Tag von Antibiotika (Tag 0), und dann für die Dauer des Experiments.
   HINWEIS: Beziehen Sie Gewichte an jedem Tag eine konsistente Zeit. Gewichte erhalten am Tag der Herausforderung (Tag 0) sollte als die anfängliche Basisgewicht für den Vergleich im gesamten C. difficile - Infektion verwendet werden.
2. Legen Sie eine digitale Waage in eine Biosicherheitsschrank. Legen Sie einen sterilen Plastikbecher auf die Waage und tarieren das Gewicht des Kunststoffbecher. Dann holen Sie vorsichtig die Maus durch die Basis des Schwanzes und legen Sie sie in den Plastikbecher.
   1. Das Becherglas zurück auf die Waage. Bewegen Sie die Maus mit der Hand über die Oberseite des Bechers, um sicherzustellen, dass die Maus nicht entkommt. Es dauert kann 2 - 3 Sekunden ein stabiles Gewicht zu erhalten. Legen Sie dann vorsichtig die Maus zurück in seinen Käfig. Nehmen Sie dieses Gewicht und wiederholen Sie den Vorgang für jede Maus in diesem Käfig.
      HINWEIS: Es ist zwingend notwendig, dass Vorsichtsmaßnahmen Quer contamina zu verhindern genommention zwischen den Käfigen bei Erhalt Gewichten. Jeder Käfig von Mäusen sollte seinen eigenen Plastikbecher zum Wiegen haben. Die Plastikbecher sollten mit einem sporizides Mittel zwischen jedem Gebrauch und bedeckt mit steriler Aluminiumfolie desinfiziert werden.
3. Überwachen Sie die angegriffenen Tiere zweimal täglich (mindestens) auf Anzeichen einer klinisch schweren C. difficile - Infektion, einschließlich Lethargie, Appetitlosigkeit, Durchfall und gekrümmte Haltung.
4. Einschläfern Menschlich Tiere , die 20% ihrer anfänglichen Basiskörpergewicht und / oder entwickeln schwere klinische Anzeichen einer C. difficile - Infektion (aufgeführt in Schritt 3.3) verlieren.
   HINWEIS: Mäuse , die klinische Anzeichen von C. difficile - Infektion anzeigen soll als während des Experiments nötig gewogen werden , um sicherzustellen , dass sie 20% ihrer ursprünglichen Ausgangswert Körpergewicht nicht verloren haben. Während der frühen Zeitpunkten in dem Experiment, könnte dies bedeuten, zweimal täglichen Messungen.

4. Bakterielle Auszählung von C. difficilevon Maus-Exkremente und Blinddarm Inhalt

HINWEIS: Vor dem Beginn sicher, dass die folgenden Artikel in der anaeroben Kammer platziert sind mindestens 24 h: 1x PBS (siehe Materialien), TCCFA Platten (siehe Materialien), eine sterile L-förmige Spreizer und sterile Mikrozentrifugenröhrchen und / oder PCR-Platten für Verdünnungen.

1. Erhalten Proben für C. difficile Enumeration
   HINWEIS: Vor Kot oder Blinddarminhalt, wiegen sterile Mikrozentrifugenröhrchen im analytischen Maßstab zu erhalten. Zeichnen Sie die Rohrgewicht auf der Seite des Rohres, Rundung auf vier Dezimalstellen (beispielsweise 0,9864 g). Bezeichnen wir dieses Gewicht als das "Rohr Gewicht." Jede Probe gesammelt haben, sollten in einem sterilen, gewogen Mikrozentrifugenröhrchen platziert werden.
   1. Sterile Sammlung von Maus Kot
      1. Sanft jede Maus zurückhalten, indem das Tier durch die lose Haut des Halses zu erfassen und zurück, um den Kopf zu immobilisieren. Verwenden Sie den kleinen Finger zu sanft den Schwanz des Tieres zurückhalten, thus Aussetzen des Anus. Stellen Sie sicher, dass das Tier vocalize nicht oder zeigen andere Anzeichen von Stress während der Zurückhaltung.
      2. Halten Sie eine sterile, gewogen Mikrozentrifugenröhrchen direkt unter dem Tier Anus. Es ist zwingend notwendig, dass das Rohr nicht mit der Maus in direkten Kontakt kommt.
         1. Als das Tier den Darm entleert, sammeln die fäkale Pellet in die Röhre. Halten Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur, bis alle Stuhlproben gesammelt werden. Es kann mehrere Minuten dauern, eine Maus, so dass Versuche notwendig wiederholen Darm zu entleeren Kot zu sammeln.
      3. Wiegen Sie die Rohre Kot im analytischen Maßstab enthalten. Nehmen Sie das Rohr Gewicht, Rundung auf vier Dezimalstellen (zB 1,0021 g). Man bezeichne das erhaltene Gewicht als das "letzte Rohr Gewicht."
      4. Führen Sie die Stuhlproben in der anaeroben Kammer für bakterielle Auszählung direkt nach dem Stuhl Sammlung.
   2. Sterile Sammlung von Maus Blinddarminhalt zum Zeitpunkt der Nekropsie
      1. Nach humane Sterbehilfe durch Ersticken CO ₂ durch sekundäre Maßnahmen folgen, führen Sie eine Obduktion der Blinddarm ²⁵ zu erhalten. Der Blinddarm ist der große, kommaförmige Abschnitt des Magen-Darm-Trakt.
      2. Setzen Sie den Blinddarm auf eine sterile Petrischale aus Kunststoff. Verwenden Sie eine sterile Einmal-Nr. 10 Skalpellklinge den Blinddarm offen von dem blinden Ende des Beutels zu schneiden die cecal Inhalte verfügbar zu machen.
         1. extrahieren Sie vorsichtig die cecal Inhalt durch leichten Druck mit dem Skalpell die Anwendung und den Inhalt in Richtung des eingeschnittenen Abschnitt des Blinddarms fegt.
            HINWEIS: Der Arzt sollte den Blinddarm Gewebe nicht stören genommen werden, die für eine histopathologische Untersuchung vorgelegt wird.
      3. Legen Sie die cecal Inhalt in einen sterilen, gewogen Mikrozentrifugenröhrchen unmittelbar nach der Entnahme. Nur etwa 10 mg Blinddarminhalt ist für die bakterielle Zählung erforderlich.
      4. Wiegen Sie die Rohre Blinddarminhalt auf der analytischen scal enthälte. Nehmen Sie das Rohr Gewicht, Rundung auf vier Dezimalstellen (zB 1,0021 g). Man bezeichne das erhaltene Gewicht als das "letzte Rohr Gewicht."
      5. Führen Sie die Blinddarminhalt Proben in der anaeroben Kammer für bakterielle Auszählung.
2. Bakterielle Auszählung von C. difficile
   1. Berechne die Endgewicht der Inhalte (oder Exkremente cecal) , die für C. difficile aufgezählt werden. Performed dies durch die "endgültige Rohrgewicht" aus der Subtraktion "Rohr Gewicht."
   2. Berechnen einer Verdünnung von 1:10 des Inhalts in 1X PBS und Resuspendieren entsprechend. Für den Exkrementen, verwenden Sie die Spitze der Pipette vorsichtig auf die Pellets in Lösung (siehe die ergänzende Datei "Beispielrechnungen") stören.
   3. Anaerob inkubieren diese resuspendierten Proben bei Raumtemperatur für 30 Minuten, so dass der Inhalt zu begleichen.
   4. Serielle Verdünnungs für jede Probe in 1x PBS für Enumration der KBE pro g Inhalt (Kot oder Blinddarm). Führen Sie anaerob dies.
   5. Unter aseptischen Bedingungen übertragen 100 ul jeder seriellen Verdünnung auf TCCFA Platten. Mit einem sterilen L-förmigen Spreizer, verbreiten sie das auf die Medien aufgebracht Verdünnung gleichmäßig es über die Platte verteilt. Auch der Verdünnung verbreitet, ist für eine genaue Zählung von Kolonien von wesentlicher Bedeutung.
   6. Inkubiere die Platten anaerob für 24 Stunden bei 37 ° C. Zu diesem Zeitpunkt Aufzählen C. difficile Kolonien der CFU pro g - Gehalt (oder Exkremente cecal) zu erhalten. C. difficile Kolonien sind flach und hellgelb und haben unregelmäßige Kanten und eine Masseglasoptik ^24.
      Hinweis: Dieses Protokoll verwendet werden C. difficile aus anderen murinen GI Inhalt aufzuzählen, einschließlich Ileum und Kolon - Gehalt. PCR-Platten können für die Herstellung von Verdünnungsreihen verwendet werden.

5. Vero - Cell - Zytotoxizitätstest zu Quantifizieren C. difficile Toxin CytotoxiStadt

HINWEIS: Es wird empfohlen, dass dieser Assay nach Beendigung des Mausmodells an Proben bei der Nekropsie und gelagert bei -80 ° C gesammelt durchgeführt werden. Aseptische Zellkulturtechniken sind für die während dieser Test Kontamination von Vero-Zellen zu verhindern. Dieses Protokoll dauert 2 Tage durchzuführen. Alle Kot und Darminhalt in diesem Test verwendeten müssen in einem gewogen, sterile Mikrozentrifugenröhrchen gelagert werden (bezeichnet mit dem "Rohr Gewicht", siehe Abschnitt oben). Das endgültige Rohrgewicht (einschließlich des Inhalts) über einen analytischen Maßstab auf die nächsten vier Dezimalstellen gemessen wird (siehe Abschnitt oben). Verwendung einer Mehrkanalpipette wird für diesen Test empfohlen.

HINWEIS: Vor dem Beginn sicher, dass die folgenden Elemente stehen zur Verfügung: Vero-Zellen, Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 1x mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin Medien (bezeichnet als "DMEM 1x Medien, "Materialien und die zusätzliche Datei sehen), 0,25%Trypsin-EDTA, 1x PBS, 0,4% Trypanblau, eine 96-Well - Zellkultur - Flachbodenplatte, eine 96-Well - Filterplatte, Clostridium difficile Toxin A (aliquote in 3 ul bei 1 ug / ul in ultrareinem Wasser und bei -80 ° C), Clostridium difficile Antitoxin, ein Arbeitsblatt (für Berechnungen und Platten Karten; siehe Zusatzdateien).

HINWEIS: Vorsicht ist bei diesem Test für das Personal der Exposition gegenüber C. difficile und dessen Toxin genommen werden.

1. Die Aufteilung der Vero - Zellen (Tag 1)
   1. Wärmen Sie den DMEM 1x Medien, 0,25% Trypsin-EDTA und 1x PBS in einem 37 ° C Wasserbad.
   2. Besorgen Sie sich einen Kolben von Vero - Zellen aus der Zellkultur - Inkubator (37 ° C und 5% CO ₂₎ und legen Sie sie in die sterile Zellkultur Laminarströmungsabzug. Verwenden Sie 70% Ethanol zu wischen Sie die Haube und Ausrüstung vor dem Gebrauch. Mit Hilfe einer serologischen Pipette absaugen Medien aus dem Gewebekulturflasche aus den Vero-Zellen zu entfernen und entsorgen Sie sie in einen Abfall container.
   3. Spülen Sie die Vero-Zellen mit 5 ml 1x PBS (vorgewärmt) in der Zellkulturflasche. Saugen Sie das PBS und entsorgen Sie sie in einen Abfallbehälter.
   4. 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA in die Gewebekulturflasche. Ermöglichen, eine Kontaktzeit von 2 - 3 min. Während dieser Zeit beobachten die Zellen beginnen, um die Flaschenoberfläche ablöst. Schütteln Sie die Gewebekulturflasche Seite zu Seite die Vero-Zellen zu lösen.
   5. Nach Kontaktzeit mit Trypsin-EDTA, fügen Sie sofort 5 ml DMEM 1x Medien in das Gewebekulturflasche. Dies wird die Trypsin-EDTA zu neutralisieren. Verwenden Sie diese Lösung zu leicht, um alle ungebunden Vero-Zellen von der Rückseite des Kolbens zu waschen. Verwenden Sie dann eine serologische Pipette diese Mischung in eine 15-ml konischen Röhrchen zu übertragen.
   6. Zentrifugiere die Vero-Zellen in dem konischen Röhrchen 5 min bei 180 xg und 25 ° C. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge richtig ausbalanciert ist. Nach dem Zentrifugieren ein sichtbares Pellet von Vero-Zellen an der Unterseite des konischen Rohr beobachten. Achten Sie darauf, nicht zu disrUPT dieser Tablette. Absaugen der Überstand aus dem konischen Rohr und entsorgen.
   7. Resuspendieren der Vero-Zellen in 3 ml DMEM 1x Medien.
2. Zählt man die Vero - Zellen
   1. Je 100 ul der Vero-Zellsuspension (hergestellt in Schritt 5.1.7) bis 100 & mgr; l von 0,4% Trypanblau. Vorsichtig mischen, indem die Lösung pipettiert nach oben und unten.
   2. Zugabe von 10 & mgr; l dieses Gemisches zu jeder Kammer eines Hämozytometers.
   3. Zähle die Anzahl der lebensfähigen Zellen innerhalb der vier Quadranten des Hämozytometer. Tote Vero-Zellen wird die Trypanblau nehmen und so wird blau gefärbt werden (diese Zellen sollten nicht gezählt werden). Notieren Sie diese Zahlen in der "Zell Arbeitsblatt Vero" zur Verfügung gestellt.
   4. Summieren sich die Gesamtzahl der lebenden Vero-Zellen in allen vier Quadranten und den Mittelwert berechnen. Multiplizieren mit dem Verdünnungsfaktor, der 2 seit 100 ul der Zellen sind in insgesamt 200 ul Flüssigkeit.
   5. Multiplizieren mit dem Korrekturfaktor zu geben, die "; Anzahl der Zellen / ml "Wenn eine Zählkammer, ist der Korrekturfaktor immer 10 ⁴ durch das Gesamtvolumen multiplizieren zu geben." Gesamtzahl der Zellen "..
3. Die Ermittlung der Anzahl der Wells Erforderlich für jedes Experiment
   HINWEIS: Eine einzelne Probe (entweder Kot oder Darminhalt) erfordert 24 getrennten Vertiefungen in doppelter Ausführung durchgeführt werden. Eine Konzentration von 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung Vero (Gesamtvolumen von 90 & mgr; l) erforderlich.
   HINWEIS: Wenn man wünscht , die Platten in Vero - Zellen mit 96 Vertiefungen über Nacht 10 einer Konzentration von ³ pro Well Vero - Zellen bei 37 ° C, inkubiert wird empfohlen für die verlängerte Inkubationszeit zu berücksichtigen. Berechnungen innerhalb der Zelle Arbeitsblatt Vero müssten angepasst werden, um diese Änderung zu berücksichtigen.
   1. Bestimmen Sie die Anzahl der Brunnen, die zur Verfügung bezogen auf die Menge von Vero-Zellen verwendet werden kann (aus Schritt 5.2, verwenden Sie die Vero-Cell-Arbeitsblatt, zur Verfügung gestellt).
   2. Bestimmen Sie das Volumen derVero-Zellsuspension benötigt, um die Anzahl der gewünschten Vertiefungen zu füllen (bezogen auf die Anzahl der Proben getestet). Stellen Sie sicher, dass jede zusätzliche Volumen in zum Pipettieren Fehler Konto hinzugefügt wird (verwenden Sie den mitgelieferten Vero-Cell-Arbeitsblatt).
   3. Verdünnen Sie die Vero-Zellsuspension (erhalten in Schritt 5.1.7) in DMEM 1x Medien das Volumen zu erhalten, für das Experiment erforderlich.
4. Seeding Vero - Zellen in einer 96-Well - Zellkulturplatten
   1. zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Zellkultur-Flachbodenplatte Unter Verwendung der Zelle Vero Aufwirbelung von Schritt 5.3.2, verwenden Sie eine Pipette Mehrkanal 90 ul der Vero-Zellsuspension hinzuzufügen.
   2. Inkubiere die Platte mit den Vero - Zellen in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO ₂ für mindestens 4 Stunden vor dem Toxin (Proben) zu den Vertiefungen hinzugefügt wird . Diese Inkubationszeit werden die Vero-Zellen erlauben, auf den Boden jeder Vertiefung haften.
5. Erstellen von Stammlösungen aus den Proben (Exkremente oderIntestinale Inhalt)
   HINWEIS: Alle Proben sollten das "Rohr Gewicht" haben und "Endröhrengewicht Gewicht" über einen analytischen Maßstab gemessen. Verwenden Sie Vero-Cell-Arbeitsblatt für die Berechnungen.
   1. Berechnen des Gewichts des Inhalts. Konvertieren g in mg, dann mg bis & mgr; l. Berechnen Sie die endgültige Gesamtzahl der ul Lösung benötigt, um eine Verdünnung von 1:10 in 1x PBS zu machen. Berechnen der Gesamtmenge von 1x PBS zur Probe hinzuzufügen.
   2. Füge das Gesamtvolumen 1x PBS (berechnet oben) zu der Probe. Führen Sie diese aerob und unter aseptischen Bedingungen. Für den Exkrementen, verwenden Sie die Spitze der Pipette vorsichtig auf die Pellets in die Lösung zu stören.
   3. Vortexen die Proben und dann zentrifugieren bei 3.522 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge richtig ausbalanciert ist. Achten Sie darauf, nicht das Pellet und resuspendieren die Probe in Lösung zu stören.
      HINWEIS: Während der Schritt 5.5.3, wenn nur wenige Proben verarbeitet werden, können Inhalte durch sterilisiert werdensie durch einen einzigen 0,22-um-Filter geleitet, anstatt eine 96-Well-Filterplatte zu verwenden. Einige Proben können mehrere Filter erforderlich, das gesamte Volumen Inhalt mit dieser Technik zu sterilisieren.
   4. Sterilisieren der Probe / PBS-Mischung von 150 ul Überstand genommen und in getrennten Vertiefungen auf einer 96-Well-Filterplatte platziert. Legen Sie die Filterplatte sicher auf einer 96-Well-Zellkultur-Flachbodenplatte, so dass der Inhalt in dieser Platte filtert.
   5. Zentrifugieren Sie die Filterplatte / Zellkultur Plattenstapel bei 431 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge richtig ausbalanciert ist und dass die Filterplatte / Zellkultur Plattenstapel eng ausgerichtet sind und nicht während der Zentrifugation verschieben.
      HINWEIS: Diese gefilterten Inhalt der 10 ^-1 Lager sind, die in den Verdünnungsplatten verwendet werden.
   6. Legen Sie die Platte mit gefilterten Proben auf Eis.
6. Erstellen von Verdünnungsplatte # 1
   HINWEIS: Die Verdünnung Plate # 1 (DP # 1) erfordert 6 Vertiefungen pro Probe, einschließlich positiver (C. difficile Toxin A) und negativen (1x PBS) Kontrollen (siehe DP # 1 Layout auf dem Handy Arbeitsblatt Vero).
   1. Zur Herstellung der Positivkontrolle (C. difficile Toxin A) für diesen Assay, erhalten 3 & mgr; l Aliquots (1 ug / ul) von -80 ° C gekühlt und 297 & mgr; l ultrareinem Wasser, um eine Endkonzentration von 0,01 & mgr; g / & mgr; l ergibt. Legen Sie auf dem Eis.
   2. Beschriften Sie die Brunnen mit ihren Verdünnungen (10 ^-1 bis 10 ^-6) für jede Probe und weist auf die positiven und negativen Kontrollen (siehe DP # 1 - Layout).
   3. In entsprechenden Mengen 1x PBS zu jeder Vertiefung. In den 10 ^-1 Brunnen, no PBS. Für die 10 ^-2 bis 10 ^-6 Brunnen, fügen Sie 90 ul 1x PBS.
   4. Fügen geeignete Mengen der Proben in jede Vertiefung. In den 10 ^-1 Brunnen, für jede Probe 100 ul der 10 ^-1 Lager hinzufügen (siehe Schritt 5.5.7 aus dem Filter plate). Für die 10 ^-2 bis 10 ^-6 Brunnen, eine serielle Verdünnungs; Start um 10 & mgr; l aus der 10 ^-1 gut zu nehmen und es an die 10 ^-2 gut Zugabe. Weiter zu den seriellen Verdünnungen, um die 10 ^-6 Verdünnung.
   5. Decken Sie die DP # 1 Platte mit einem durchsichtigen Kunststoff-Klebedichtung und legen Sie es auf Eis.
7. Erstellen von Verdünnungsplatte # 2
   HINWEIS: Verdünnungsplatte (DP # 2) benötigen zwei Fahrspuren von 6 Vertiefungen für jede Probe, einschließlich positiver und negativer Kontrollen (siehe DP # 2 Layout auf dem Handy Arbeitsblatt Vero).
   1. Beschriften Sie die Brunnen mit ihren Verdünnungen (10 ^-1 bis 10 ^-6) für jede Probe und weist auf die positiven und negativen Kontrollen (siehe DP # 2 Layout). Beschriften Sie die Vertiefungen mit dem Beispielnamen (bezeichnet als "Proben-Wells") oder dem Beispielnamen mit Antitoxin (bezeichnet als "Antitoxin-Brunnen").
   2. Berechnen Sie die Menge an Antitoxin für diesen Test erforderlich. HINWEIS: Die Antitoxin ist ein 25x LagerLösung, die 01.25 muss in 1x PBS verdünnt werden. Die vorbereitete Gegengift 1x Lösung auf Eis.
   3. Für "Probenschächten," in jede Vertiefung 20 ul 1x PBS hinzufügen für alle Verdünnungen (10 ^-1 bis 10 ^-6) dieser Probe. Für "Antitoxin - Brunnen" , jeweils 20 ul 1x Antitoxin zu gut für alle Verdünnungen (10 ^-1 bis 10 ⁶⁾ dieser Probe hinzufügen.
   4. Transfer 20 ul der verdünnten Probe in den Vertiefungen von DP # 1 in die vorgesehenen Vertiefungen auf DP # 2 für die Zeilen 1 bis 6 und Zeilen 7 bis 12 (siehe DP # 2 Layout auf dem Handy Arbeitsblatt Vero). Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Pipettieren auf und ab.
   5. Decken Sie DP # 2 mit einem durchsichtigen Kunststoff-Klebeverschluss und lassen 40 min Inkubation bei Raumtemperatur. Diese Inkubation ist die Antitoxin zu erlauben zu binden , und damit inaktivieren und die C. difficile - Toxin neutralisieren.
   6. Nach der Inkubation werden 10 & mgr; l Mischung aus DP # 2 in den entsprechenden Zell Brunnen Vero (siehe die Zellenplattenlayout Vero auf dem Vero Handy-Arbeitsblatt). Sie vorsichtig die Lösung mischen Pflege durch Pipettieren auf und ab, wobei nicht die Vero-Zellen zu stören, die an der Bodenfläche der Vertiefungen eingehalten werden.
   7. Inkubieren der Zellplatte Vero über Nacht in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO _2.
8. Beurteilen Sie Vero - Zellen für Rounding mit einem Lichtmikroskop (Tag 2)
   HINWEIS: erinnern , dass der Verdünnungsfaktor um einen Faktor von 10 , wenn die Probengemische zu der Zellplatte Vero Zugabe (zB 10 ^-3 ist jetzt 10 ^-4). Wells, die vorhanden Gegengift haben sollte keine Vero-Zell Runden haben wenig zur Kenntnis genommen. Vero - Zell Runden (Zytotoxizität) wird in den Proben zu beachten , dass C. difficile Toxin enthalten. Wenn der zytotoxischen Aktivität in einem Verdünnungs neutralisiert wird , um die Probe und das Antitoxin enthält, wird das Vorhandensein von C. difficile - Toxin in Vero resultierende Zell - Cytotoxizität bestätigt.
   1. Untersuchen Sie für Vero-Zell Runden eine ligh mitt-Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Für Probenvertiefungen (einschließlich der Positivkontrolle), die Verdünnung der gut aufnehmen , die die letzten 80% Vero Zellrundung haben festgestellt.
   2. Berechne den zytotoxischen Titer, die als Kehrwert der höchsten Verdünnung definiert, die 80% Vero Zellabrundung pro g Probe hergestellt. Wenn die höchste Verdünnung , ist beispielsweise 10 ^-5, dann würde der Verdünnungsfaktor 10 ^-6 für diese Probe sein. Somit würde der log [Endverdünnung Faktor] / g Probe log [10 ^6], die eine reziproke Titer von 6 ergibt.
      HINWEIS: - 4 Durchgängen und nicht mehr als 30 Passagen vor ihrer Verwendung in diesem Assay ²⁶ Vero - Zellen müssen wenigstens haben 3 unterzogen.

Ergebnisse

Während einer repräsentativen Studie, 5 Wochen alte C57BL / 6-WT-Mäuse wurden mit Cefoperazon in ihrem Trinkwasser vorbehandelt (0,5 mg / ml) für 5 Tage und erlaubt eine 2-Tages-auswaschen mit regelmäßigen Trinkwasser. Mäuse wurden mit 10 & ^sup5 ; Sporen von C. difficile R20291 via Schlundsonde am Tag 0 (1A) herausgefordert. Die Mäuse wurden für 14 Tage für die Gewichtsabnahme und klinischen Zeichen (Lethargie, Appetitlosigkeit, Durchfal...

Diskussion

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner	SSS Navigator	48027	This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter	Fisherbrand	09-720-3	Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue	Gibco	15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin	Gibco	15070-063
10% heat inactivated FBS	Gibco	16140-071	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe	BD Medical Supplies	309628
1x PBS	Gibco	10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap	Corning	430917
96 well cell culture flat bottom plate	Costar Corning	CL3595
96 well filter plate	Millipore	MSGVS2210
Adhesive Seal	ThermoScientific	AB-0558
Bacto Agar	Becton Dickinson	214010	Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone	Becton Dickinson	211684	Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone	MP Bioworks	199695
Cefoxitine	Sigma	C47856	Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit	Tech Labs	T5000	Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A	List Biological Labs	152C	Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine	Sigma	C6880	Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water	Gibco	15230
DMEM 1x Media	Gibco	11965-092	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose	Fisher	L95500	Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer	Bright-Line, Sigma	Z359629
KH2PO4	Fisher	P285-500	Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous)	Sigma	M2643	Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter	Millex-GS	SLGS033SS	Filter for TCCFA plates
Na2HPO4	Sigma	S-0876	Part of TCCFA plates (see below)
NaCl	Fisher	S640-3	Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade	Miltex, Inc	4-410
PCR Plates	Fisherbrand	14230244
Plastic petri dish	Kord-Valmark Brand	2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader	Fisherbrand	14-665-230
Syringe Stepper	Dymax Corporation	T15469
Taurocholate	Sigma	T4009	Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664	Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope	Olympus Life Science
DP27 camera	Olympus Life Science
cellSens Dimension software	Olympus Life Science