Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Zusammenfassung

Elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA) sind eine instrumentale Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und deren Ziel-DNA-Sequenzen zu charakterisieren. Die Radioaktivität ist die vorherrschende Methode der DNA-Markierung in EMSA gewesen. Allerdings haben jüngste Fortschritte in der Fluoreszenzfarbstoffe und Scanverfahren die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung von DNA als Alternative zu den Radioaktivität für den Vorteilen der leichten Handhabung Aufforderung, Zeitersparnis und reduziert die Kosten und die Verbesserung der Sicherheit. Wir haben vor kurzem fluoreszierende EMSA (FEMSA) erfolgreich adressieren eine wichtige biologische Frage verwendet. Unsere Analyse liefert FEMSA mechanistischen Einblick in die Wirkung einer Missense-Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG Transkriptionsfaktor SOX-2 auf olfaktorische Neuronen Typ Streuung. Wir fanden , dass mutierte SOX-2 ^G73E Protein spezifische DNA - Bindungsaktivität verändert, wodurch olfaktorischen Neuronen Identität Transformation verursacht. Hier stellen wir ein optimiertes und kostengünstiges Schritt-für-Schritt-Protokollfür FEMSA mit Infrarot - Fluoreszenz - Farbstoff-markierten Oligonukleotiden , die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen und gereinigt SOX-2 - Proteine (WT und Mutanten - SOX-2 ^G73E Proteine) als biologisches Beispiel enthält.

Einleitung

EMSAs verwendet , durch Verwendung nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu analysieren , um eine Mischung aus einem Protein von Interesse und eine markierte DNA - Sonde enthält , potentielle Zielstellen des Proteins ¹ zu lösen. Eine DNA-Sonde mit Protein gebunden langsamer wandert mit einer freien DNA-Sonde verglichen wird, und daher verzögert in seine Wanderung durch eine Polyacrylamid-Matrix. Die radioaktive Markierung von DNA durch ³² P hat die vorherrschende Methode zur Detektion in EMSA gewesen. Obwohl die Anwendung von radioaktiven Markierung in der biochemischen Forschung vorteilhaft war, sind Methoden der alternativen DNA-Markierung mit vergleichbarer Empfindlichkeit wird aufgrund der Risiken Gesundheit und Sicherheit beschäftigt im Umgang mit Radioaktivität in Verbindung gebracht. Diese alternativen Verfahren umfassen die Konjugation von DNA mit Biotin ² oder Digoxigenin (DIG) ³ (beide werden dann durch Chemilumineszenzsystemen erkannt), SYBR Grün - Färbung der PAGE - Gels ^4,oder direkte Detektion von DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate durch das Gel ^5,6 scannen.

Die aufgelösten Gele von EMSA unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA - Sonden erfordern Nachlauf Verarbeitung durch Autoradiographie Filme oder ein Phosporimager System radioaktiven Signale ^1,7 erfassen. Gele EMSAs Biotin- ² oder DIG-konjugierten ³ DNA - Sonden müssen ebenfalls verarbeitet und auf eine geeignete Membran übertragen und dann durch Chemilumineszenz ⁶ detektiert. SYBR grüne Färbung des Gels erfordert Nachlauf Gel - Färbung und einen fluoreszierenden Scanner ^4. Da Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte zur EMSAs unter Verwendung dieser DNA-Markierungstechniken benötigt werden, kann die aufgelöste Gel nur einmal getestet werden. Im Gegensatz dazu markierten DNA-Sonden mit Fluorophoren direkt in dem Gel in den Glasplatten durch einen Scanner detektiert werden kann. Daher können die DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrmals zu verschiedenen Zeitpunkten während des Laufs überwacht und analysiert werden, diedeutlich reduziert Zeit und Kosten. Die DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate , die für EMSAs verwendet wurden , umfassen Cy3 ^{6,8, 6,8} Cy5, Fluorescein ⁹ und Infrarot - Fluoreszenzfarbstoffe ^4-6.

Transkriptionelle Regulation erfordert Protein-DNA-Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren und ihre Zielgene. Die Koordination dieser Interaktionen erzeugt diverse Zelltypen aus einem gemeinsamen Vorläufer bei Tierentwicklung. Eine unvoreingenommene vorwärts genetisches Screening identifizierten eine Missense - Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG DNA-Bindungsdomäne des SOX-2 Caenorhabditis elegans Transkriptionsfaktor. Die Mutation führt zu einer Zellidentität Transformation von AWB olfaktorischen Neuronen in AWC Riechzellen auf molekularer, morphologischen und funktionellen Ebenen ^5,10. SOX-2 regelt differentiell die terminale Differenzierung von AWB und AWC Neuronen mit kontextabhängigen Partner Transkriptionsfaktoren interagieren und die jeweiligenDNA - Zielstellen ^5,10. SOX-2 Partner mit LIM-4 (LHX) in Terminal AWB neuronale Differenzierung, während SOX-2 Partner mit CEH-36 (OTX / OTD) in Terminal AWC neuronale Differenzierung. Luziferase - Reporter - Assays zeigen , dass SOX-2 und mutierten SOX-2 ^G73E Proteine haben kooperative Wechselwirkungen mit Transkriptions Cofaktoren LIM-4 und CEH-36 einen Promotor in AWB und AWC Neuronen zu aktivieren. Allerdings SOX-2 und mutierten SOX-2 ^G73E angezeigt Differentialaktivierungseigenschaften des Promotors. Um die molekulare Basis der differentiellen DNA - Bindungsaktivitäten von SOX-2 und SOX-2 ^G73E untersuchen, fEMSAs wurden mit diesen Proteinen und deren potentielle Zielstellen durchgeführt.

Zunächst wurde ein Ansatz Bioinformatics die biologisch relevante DNA-Bindungssequenzen innerhalb des 1 kb-Promotorregion in der Luciferase-Assay verwendet, zu identifizieren. Da mehrere potenzielle SOX-2 Bindungsstellen im gesamten Promotor anwesend waren, konzentrierten wir unsauf den vorhergesagten SOX-2-Bindungsstellen neben mutmaßlichen CEH-36 oder LIM-4-Bindungsstellen und evolutionär zwischen verschiedenen Nematodenarten konserviert. Diese Sequenzen wurden deletiert oder mutiert und anschließend in vivo auf ihre Aktivität getestet , um GFP reporter Transgenen in AWB oder AWC Neuronen exprimieren. Durch diesen Ansatz identifizierten wir Potential LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen , die speziell die für die Expression von GFP in AWB und AWC Neuronen sind jeweils ^5. Wir untersuchten die möglichen Unterschiede in der DNA - Bindung von SOX-2 und SOX-2 ^G73E mit FEMSA mit den identifizierten LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen. Unsere EMSA - Analyse zeigte , dass SOX-2 ^G73E nicht die DNA - Sonde hat binden die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen (erforderlich für die Genexpression in AWB) so effizient wie WT SOX-2 tat enthält. Allerdings SOX-2 und SOX-2 ^G73E hatte keinen Unterschied in der Bindung der DNA - Sonde die CEH-36 / SOX-2 a enthält ,djacent Zielstelle (erforderlich für die Genexpression in AWC) ^5,10. Unsere FEMSA Analysen für die AWB-to-AWC Zellidentität Phänotyp Transformation in beeinflussen spezifische DNA - Bindungsaktivität mechanistischen Einblick in die Natur des SOX-2 ^G73E - Mutation bereitstellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll von FEMSA unter Verwendung von gereinigtem 6xHis-SOX-2 oder 6 × His-SOX-2 ^G73E zusammen mit Infrarot - Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA - Sonden mit den LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen als Fallstudie in Angriff zu nehmen eine wichtige biologische Frage.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

HINWEIS: EMSAs fluoreszenzmarkierten DNA - Sonden oder andere Formen von markierten DNA die gleichen Protokolle für Protein oder Zellextraktzubereitung, Protein-DNA - Bindungsreaktion und PAGE Gelzubereitung und Ausführen (1A) verwendet wird . Die wichtigsten Unterschiede sind DNA-Markierungsverfahren, post-run Gel Verarbeitungsschritte und Nachweismethoden.

1. Gel Zubereitung

1. Bereiten 5% nativen Polyacrylamidgel, enthaltend 0,5 × TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA) und 2,5% Glycerin, ein Mini-Protein-Gel-System (8,3 cm Breite x 7,3 cm Länge x 0,75 mm Dicke).
   1. Zur Herstellung von 30 ml Gel-Lösung für 4 Gele, mischen 5 ml 30% Acrylamid / Bis (37,5: 1), 3 ml 5-fach TBE (0,45 M Tris-Borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% Glycerol, 300 & mgr; l von 10% Ammoniumpersulfat, 15 & mgr; l TEMED und 20,2 ml ddH ₂ O gründlich.
      HINWEIS: Acrylamid schädlich und giftig ist, Griff mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung.
2. Cast der Gel-Lösung sofort. Nach der Polymerisation wickeln die Gele in klaren Plastikfolie mit 0,5x TBE vorbenetzt und lagern Sie sie bei 4 ° C.

2. Herstellung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sonden

HINWEIS: Halten Sie die Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden weg von Licht so viel wie möglich während der Herstellung, Lagerung und Experimente.

1. Gestalten und bestellen Oligonukleotide.
   1. Entwerfen Sie lange Oligonukleotid für ~ 51-mere.
      HINWEIS: Die lange Oligonukleotid - Sequenz des LIM-4 / SOX-2 - Sonde ist TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange Oligonukleotide erfordern keine PAGE oder HPLC-Reinigung.
   2. Entwerfen komplementäre kurze Oligonukleotide für ~ 14-mers mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-Modifikation am 5'-Terminus (5'Dye) und eine Schmelztemperatur über 37 ° C.
      HINWEIS: Die kurze Oligonukleotid-Sequenz des LIM-4 / SOX2 Sonde ist 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. Die Mindestsynthesemaßstab von 5'Dye-markierte kurze Oligonukleotide ist 100 nM. Daher erfordern die Oligonucleotide HPLC-Reinigung.
2. Resuspendieren Oligonukleotiden in 1x Tris-EDTA-Puffer (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) auf eine Endkonzentration von 100 uM.
3. Anneal Short (5'Dye) und lange Oligonukleotide.
   1. Mischungs 0,6 ul 5'Dye-Short Oligo (100 uM), 1,2 ul Oligo Lange (100 uM), und 28,2 & mgr; l Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer (STE: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in einem 1,5 ml-Röhrchen.
   2. Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem. Schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos O / N kühlen im Dunkeln.
4. Füllen Sie das 5'-Überhang von vergütetem 5'Dye-kurz / lang Oligos mit Klenow-DNA-Polymerase doppelsträngigen DNA-Sonden zu machen.
   1. Bereiten Sie die Reaktion durch Vermischen30 ul geglüht kurz / lang Oligos mit 5'Dye Tag, 8,5 ul 10x Klenow-Puffer, 1,7 ul 10 mM dNTPs, 1,7 ul Klenow (3 '-> 5' exo) (5 u / ul) und von 43,1 & mgr; l ddH ₂ O in einem 0,2 ml PCR - Röhrchen.
   2. Inkubieren 60 min bei 37 ° C in einer PCR-Maschine.
   3. Hinzufügen, 3,4 & mgr; l 0,5 M EDTA die Reaktion und Wärme inactivate für 20 min in einer PCR-Maschine bei 75 ° C zu beenden.
5. Verdünnte eingefüllte in Sonden (0,7 uM) in STE für Endkonzentration von 0,1 uM.
6. Shop Oligos bei -20 ° C im Dunkeln bis zur Verwendung. Oligos kann für bis zu einem Jahr in diesem Zustand gelagert werden.
   HINWEIS: Um die DNA-Sonden mit mutierten Bindungsstellen, mutierten Versionen von langen Oligonukleotiden geglüht mit 5'Dye-markierte kurze Oligonukleotide, gefolgt von Fill-in von 5'-Überhänge mit Klenow erzeugen. Es hat sich gezeigt, daß die Sonde mit einem Strang mit einem Infrarot fluoreszierenden markierten gezeigtFarbstoff nur 30% Intensität der Sonde mit den beiden mit dem Farbstoff markierten Stränge. Wenn die Signalintensität verstärkt werden muss, sind lange Oligos beider Stränge mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffen an 5'-Enden markiert und geglüht Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden machen.

3. Herstellung von unbeschriftet / kalt Probes (Wettbewerber)

Hinweis: Lange Oligonukleotide komplementäre Sequenzen (Long und LongR) mit unmarkierten Sonden zur Wettbewerbsanalyse zu machen geglüht wurden Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden.

1. Mix 20 ul 100 uM lang, 20 ul 100 uM LongR Oligonukleotiden und 60 & mgr; l STE in einem 1,5-ml-Röhrchen.
2. Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem, schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos über Nacht abkühlen.

4. Bindungsreaktion und Elektrophorese

1. Vorbereitung 1 ml 5x Bindungspuffer um 50 & mgr; l Misch60; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 ul 5 M NaCl; 200 ul 1 M KCl, 5 ul 1 M MgCl _2, 10 ul 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 ul 1 M DTT; 25 ul 10 mg / ml BSA und 695 & mgr; l ddH ₂ O.
   HINWEIS: Der 5x Bindungspuffer kann bei -20 ° C aliquotiert und gelagert werden. Ein weiterer Punkt zu beachten ist, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren verschiedene Modifikationen an den Bindungspuffer haben.
2. Kurz vor dem Bindungsreaktionen einrichten, Vorlauf 5% nativen Polyacrylamidgel in 0,5x TBE + 2,5% Glycerin alle Spuren von Ammoniumpersulfat bei 80 V für 30 zu entfernen - 60 min, oder bis der Strom nicht ändert länger mit der Zeit.
3. Legen Sie die Bindungsreaktion in Endvolumen von 20 & mgr; l auf.
   1. Mischungs 4 ul 5x Bindungspuffer, 80 bis 200 ng gereinigtem Protein A (in 50% Glycerin, dh SOX-2), 1 ul 0,1 uM Farbstoff-konjugierten Sonde (Endkonzentrationentration: 5 nM) und ddH ₂ O.
   2. Optional: Wenn kalte Sonde Konkurrenten erforderlich sind, fügen verschiedene Konzentrationen (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) von kalten Sonden.
   3. Optional: Wenn die Wechselwirkung zwischen den Proteinen A und B (dh SOX-2 und LIM-4) geprüft wird, hinzufügen von 80 bis 200 ng gereinigtem Protein B (in 50% Glycerin, dh LIM-4).
   4. Optional: Wenn Kernextraktzubereitung verwendet wird , und spezifische Bindung von Protein A ist , validiert werden, Antikörper , der spezifisch an Protein A addieren (dh anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
   5. Inkubieren bei R / T in Dunkelheit für 15 min.
4. Legen Sie alle der Bindungsreaktion auf das Gel, und führen Sie das Gel bei 10 V / cm auf den gewünschten Abstand.

5. Imaging

HINWEIS: Das Gel wurde direkt in den Glasplatten mit einer erweiterten Infrarot-Abbildungssystem abgetastet. Daher kann das Gel weiter aufgelöst werden und wiederholt (1C gescannt und 2). Eine Nahinfrarot-Fluoreszenzabbildungssystem in erster Linie für Western-Blots wurde auch getestet, das Gel zu scannen, sondern nur die erweiterten Infrarot-Abbildungssystem konnte das Gel mit guter Auflösung zu scannen. Die beschriebene Methodik ist spezifisch für ein bestimmtes Infrarot-Abbildungssoftware, obwohl andere Software-Pakete verwendet werden können.

1. Reinigen Sie das Bett des Scanners mit ddH ₂ O und gut trocknen vor dem Scannen. Wischen Sie die Glasplatten des Gels trocknen und legen Sie die Platten, die das Gel auf dem Scannerbett.
2. Öffnen Sie die Infrarot-Imaging-Software und gehen Sie auf die "Acquire" Tab. Wenn die dünnere Platte (1 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 169 & mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 1,5 mm. Wenn die dickere Platte (3 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 84 & mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 3,5 mm. Fokus-Offset ist abhängig von derDicke der Glasplatte.
3. Wählen Sie den Bereich, der das Gel auf dem Scanner einnimmt. Klicken Sie auf 'Start', um den Scanvorgang zu starten.
4. Wiederholen Sie die Elektrophorese und scannen zusätzlich nach Bedarf.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Orange G loading dye (6x: 0.12 g Orange G in 100 ml 30% Glycerol) können vor dem Laden in die Bindungsreaktion zugesetzt werden, um das Fortschreiten der Elektrophorese sichtbar zu machen. Weitere Lade- Farbstoffe Bromphenolblau einschließlich wird während des Scannens und daher interferieren Bildanalyse (1B) detektiert werden.

In einigen Fällen von EMSAs, insbesondere wenn die Kernextraktzubereitung verwe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

fEMSAs sind ein leistungsfähiges Werkzeug Protein-DNA-Wechselwirkungen, und sind eine Alternative zur radioaktiven Markierung von DNA zu untersuchen. Fluoreszenzfarbstoffe, wie beispielsweise Infrarot-Farbstoffe sind im Handel erhältlich und bieten einen sicheren und umweltfreundlichen Verfahren im Vergleich zur radioaktiven DNA-Markierung. EMSA unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden erfordern keine Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte und somit Zeit und Kosten im Vergleich zu an...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA